Стан ендокриноцитів панкреатичних острівців в експериментальних тварин при гіперглікемії різної етіології та патогенезу

5. Встановити особливості змін морфофункціонального стану ендокриноцитів панкреатичних острівців в залежності від етіології та патогенезу гіперглікемії у щурів при експериментальній патології.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота обсягом 161 сторінка друкованого тексту складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків. Список використаної літератури складається з 408 джерел, з них 24 написано кирилицею та 384 латиницею. Дисертація ілюстрована 19 малюнками та документована 29 таблицями.

Характеристика експериментальних тварин і методи дослідження. Для реалізації поставлених завдань проводили спостереження за самцями щурів лінії Wistar (98) та SHR (18), які знаходились при контрольованому температурному режимі (Т=18-22^oC) і вологості повітря в умовах природного освітлення на стандартному раціоні віварію, збалансованому за основними макро- та мікронутрієнтам із вільним доступом до їжі та питної води. Усі експерименти виконано відповідно до національних «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна, 2001), що узгоджуються із положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Усі тварини були розподілені на групи відповідно до моделі експериментальної патології. Всередині групи тварини були поділені в підгрупи за віком або тривалістю перебігу ЦД. Для виключення ефекту впливу цитратного буферу та внутрішньочеревних ін'єкцій додатково 10 вагітним самкам (модель ЕГД) та 10 самцям (модель ЕЦД) внутрішньочеревно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН 4,5). При цьому концентрація глюкози крові цих тварин не відрізнялась від показників самців контрольної групи і не перевищувала 4,6-4,7 ммоль/л.

Для спостереження вікової динаміки морфофункціональних особливостей панкреатичних острівців нормальних самців щурів лінії Wistar виводили з-під нагляду у віці 1 (ранній вік), 7 (статева зрілість), 18 (дорослий вік) і 24 (старість) місяців.

ЕЦД моделювали на самцях лінії Wistar одноразовою внутрішньочеревною ін'єкцією розчиненого у 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН 4,5) стрептозотоцину (SIGMA Chemical, США) в дозі 50 мг/кг після 24-годинного голодування та процедури зважування. У 1-шу добу тварин поїли 20% розчином глюкози, на 2-гу - 10%. Критерієм відбору до експериментальної групи була концентрація глюкози крові натще вище 8,6 ммоль/л на 7-му добу після індукції ЦД. Часом для виведення тварин із експерименту був термін тривалості ЦД 3 і 5 тижнів (21-й та 35-й день).

Для моделювання ЕГД самкам щурів лінії Wistar (40 особин) в еуглікемічному стані на 15 добу встановленої вагітності одноразово внутрішньочеревно вводили стрептозотоцин у дозі 45 мг/кг, розчинений у 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН 4,5). У 1-шу добу самок поїли 20% розчином глюкози, на 2-гу - 10%. Критерієм включення самок до експерименту була концентрація глюкози крові натще вище 6,5 ммоль/л (середній показник становив 12,26±0,45 ммоль/л) на 5-ту добу після індукції діабету (Колесник Ю. М. і співавт., 2006). Із самців-нащадків формувались експериментальні групи, контролем для яких були нащадки самок щурів з нормальним перебігом вагітності. При досягненні тваринами віку 1, 7 і 18 місяців їх виводили із експерименту.

Самці щурів лінії SHR і контрольні самці лінії Wistar виводилися з-під нагляду у віці 7 і 24 місяців.

Виведення тварин із експерименту здійснювали після 12-годинного голодування методом одномоментної декапітації під наркозом (внутрішньочеревно етамінал натрію 40 мг/кг). Відбирали кров для біохімічних досліджень. Відокремлену підшлункову залозу після 20 годинного витримування при кімнатній температурі у фіксаторі Буена 2 години промивали під проточною водою. Надалі мікропрепарат зневоднювали і заливали в парафін. Серійні зрізи підшлункової залози товщиною 5 мкм готували на ротаційному мікротомі MICROM HR-360 (Microm, Німеччина). Відібрані гістологічні зрізи депарафінізували для подальшого імунофлюоресцентного дослідження.

Для ідентифікації бета-, дельта- та амілінсинтезуючих клітин використовували набори для імунофлюоресцентного виявлення інсуліну, соматостатину та аміліну відповідно виробництва фірми Peninsula Laboratories, Inc. (США). Досліджували гістологічні зрізи різних ділянок підшлункової залози. Відібрані 3 із 4 серійних зрізи інкубували з нормальною козячою сироваткою 1:10 при Т=37^оС протягом 30 хвилин у закритій інкубаційній камері задля елімінації неспецифічного зв'язування імуноглобулінів з компонентами тканини. Потім кожен зріз обробляли первинними антитілами 1:200 до гормону (інсуліну, соматостатину, аміліну) й інкубували 24 години при Т=4^оС. Надлишок первинних антитіл тричі по 10 хвилин відмивали в 0,1 М фосфатному буфері (pH=7,4). За цим відбувалася 60-хвилинна інкубація (Т=37^оС) із вторинними антитілами, кон'югованими з FITC 1:100. Наприкінці імуногістохімічної обробки зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером (pH=7,4) і укладали в суміш гліцерину та фосфатного буферу (9:1). Для контролю специфічності зв'язування первинних антитіл виконували аналогічні процедури ідентифікації з додатковою в наборі стандартною навіскою досліджуваних гормонів. Для контролю специфічності зв'язування вторинних антитіл проводили реакцію за вищезгаданою методикою, але без інкубації з первинними антитілами.

Для імуногістохімічного виявлення альфа-клітин кожен 4-ий гістологічний зріз із серії тричі відмитий у 0,1 М фосфатному буфері протягом 18 годин при Т=4^оС, інкубували з мишачими моноклональними первинними антитілами до глюкагону (SIGMA Chemical, США) в розбавлені 1:2000. Потім триразово відмивали від надлишку первинних антитіл у 0,1 М фосфатному буфері та інкубували зі вторинними кролячими антитілами проти мишачих IgG, кон'югованими з FITC (SIGMA Chemical, США) у розведенні 1:64 при Т=37оС 60 хвилин. Потім зріз тричі промивали 0,1 М фосфатним буфером і укладали у суміш фосфатного буферу та гліцерину (9:1). Для контролю специфічності зв'язування антитіл проводили аналогічні процедури, але без інкубації із первинними антитілами до глюкагону.

Візуалізацію панкреатичних острівців здійснювали за допомогою комп'ютерної системи цифрового аналізу зображень VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі з використанням високоемісійного світлофільтру 38НЕ із діапазоном збудження 450-490 нм та емісії 500-550 нм під мікроскопом Axioskop з флюоресцентною приставкою та спеціальним об'єктивом з широкою апертурою (Zeiss, Німеччина). Отримане зображення вводили за допомогою високочутливої 8-бітної CCD- відеокамери COHU-4922 (COHU Inc., США) в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Кожен відеокадр обробляли у цифровий формат за денситометричною шкалою із 256 градаціями сірого кольору.

Вимір інтенсивності імунофлюоресценції проводили в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). З урахуванням інтенсивності флюоресценції в імунопозитивних ділянках та інтенсивності флюоресценції фону обчислювали показники:

· відносна концентрація гормону в острівцях (інсуліну, глюкагону, соматостатину та аміліну) за формулою: Сi = | lg(Di /D0) |, (в одиницях інтенсивності флюоресценції, ОІФ), де Di - показник інтенсивності флюоресценції клітини, D0 - показник інтенсивності флюоресценції міжклітинного простору (“фону” препарату);

· відносний вміст гормону в острівцях (інсуліну, глюкагону, соматостатину та аміліну) за формулою: СТi = Si * | lg(Di /D0) |, (в одиницях інтенсивності флюоресценції, ОІФ), де Si - площа (мкм²), зайнята імунореактивним матеріалом в острівці, Di - показник інтенсивності флюоресценції клітини, D0 - показник інтенсивності флюоресценції “фону”.

Середній показник вмісту гормонів у синтезуючих їх клітинах обчислювали шляхом помноження середньої площі клітин на показник середньої концентрації гормону в острівцях.

· площа панкреатичного острівця (мкм²);

· площа матеріалу з імунореактивним інсуліном, глюкагоном, соматостатином та аміліном в острівці (мкм²);

· площа та кількість бета-, альфа-, дельта- та амілінсинтезуючих ендокриноцитів в острівці (розраховувались в інтерактивному режимі).

Для більш детальної характеристики функціонального стану ендокринного апарату підшлункової залози були виділені наступні типи острівців за площею (мкм²): подинокі бета-клітини, маленькі острівці (100-1500 мкм²), середні (1500-3500 мкм²), великі (3500-7500 мкм²) та гігантські (більше 7500 мкм²).

Для контролю глікемії застосовували глюкометр “SUPER GLUCOCARD-II” (Arkray Factory, Японія) за принципом двоетапного глюкозооксидазного методу.

Статистичний аналіз цифрових даних виконували за допомогою пакета прикладних та статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) та EXCEL (Microsoft Corp., США). Для всіх показників розраховували значення середньої арифметичної вибірки (М), її дисперсії та похибки середньої (m). Статистично значущі відмінності результатів, для яких р<0,05, були встановлені за допомогою комп'ютерної програми «Statistica 6.0 for Windows» («StatSoft® Inc», CША) методом ANOVA за критерієм Стьюдента (t).

Результати дослідження та їх обговорення. У ході проведеного дослідження у тварин з ЕЦД, нащадків самок з ЕГД, щурів лінії SHR та нормальних щурів лінії Wistar у процесі старіння виявлено гіперглікемію, час розвитку якої та ступінь прояву залежали від природи патогенного фактору.

У нормальних щурів лінії Wistar рівень концентрації глюкози крові перевищував нормоглікемічний поріг тільки у старих, 24-місячних, тварин. У структурі класифікованих на типи острівців залежно від площі за частотою виявлення в усі досліджувані вікові періоди переважали маленькі. В 1-місячних тварин відсоток маленьких острівців був найбільший (80%) поряд з низьким відсотковим вмістом середніх і великих та абсолютною відсутністю гігантських острівців. У 7- та 18-місячних тварин знижувався відсоток маленьких острівців за рахунок збільшення частоти виявлення середніх та великих, а також з'являлися гігантські. Проте у старих тварин залишались лише маленькі та середні острівці, а великі та гігантські практично зникали. Поступове зростання показника середньої площі острівців відбувалося до 18-місячного віку тварин, але в 24 місяці характерним було його зниження (рис. 1). Це спостереження узгоджується з уявленнями про важливе значення великих острівців тільки при нормоглікемії (Chan C. B. et al., 1999). Згідно з отриманими даними, зменшення площі острівців у старих тварин було викликане зниженням у них кількості та відсоткового вмісту бета-клітин. Натомість кількість та відсотковий вміст альфа-клітин в острівцях зростали (Ahuja S. K. et al.,). Істотні зміни морфофункціональних параметрів дельта-клітин не виявлялися. Важливо зазначити, що включення компенсаторних механізмів з боку бета-клітин відбувалося вже у 18-місячних тварин, коли кількість цих клітин та площа острівців були максимальними серед досліджуваних вікових періодів у вигляді зростання площі бета-ендокриноцитів та вмісту в них інсуліну із накопиченням цього гормону в острівцях. У старих щурів у ще більшій мірі відбувалося зростання цих показників. Таким чином, зміни морофункціональних параметрів бета-клітин мали місце в дорослих тварин, коли ще концентрація глюкози крові не перевищувала еуглікемічний поріг.

Рис. 1. Вікова динаміка змін середньої площі панкреатичних острівців і відсоткового вмісту типів острівців за площею у щурів лінії Wistar (мкм², %)

До особливостей морфофункціонального стану панкреатичних острівців при розвитку гіперглікемії у тварин з ЕЦД слід віднести високий відсоток маленьких острівців у тканині підшлункової залози вже на 21 день перебігу діабету та відсутність гігантських на 35-ий день. Прогресування діабету супроводжувалося редукцією площі острівців за рахунок зниження в них кількості бета-клітин (Колесник Ю. М., 1990-1995). На 35-ий день перебігу діабету значно зменшувалась і кількість альфа-клітин, які також піддавалися імунологічному кіллінгу в інфільтрованих лімфоцитами острівцях (Pechhold K. et al., 2009). Одночасно з цим у бета-клітинах уже на 21-ий день перебігу ЕЦД включалися компенсаторні реакції, оскільки вони були у стані гіпертрофії із підвищеним вмістом інсуліну. Однак обмеження адаптаційних можливостей цих клітин проявлялося у знижені в них вмісту інсуліну, зафіксованому на 35-ий день перебігу патологічного процесу. Прогресуюче зниження вмісту інсуліну в острівцях було виявлене наприкінці 3-го тижня після індукції ЦД. Для альфа-клітин також характерним був розвиток гіпертрофії з 21-го дня діабету із паралельним прогресивним зростанням у них вмісту глюкагону. Відомо, що інсулін знижує транскрипцію гену глюкагону, тому при недостатній кількості інсуліну внаслідок загибелі бета-клітин відбувалося підвищення біосинтетичної активності альфа-ендокриноцитів (Edgerton D. S. et al., 2009). Але в умовах стійкої гіперглікемії рівень вмісту глюкагону в острівцях тварин з 3- і 5-тижневим терміном перебігу діабету та контрольних тварин був практично однаковий (Quesada I. et al., 2008).

У нащадків самок з ЕГД вже в 1-місячному віці визначався ранній маркер розвитку метаболічного синдрому, що відноситься до обов'язкових його компонентів - надлишкова вага (Pravenec M. et al., 2002). У статевозрілих нащадків самок з ЕГД концентрація глюкози крові статистично значимо перевищувала контрольні показники, а у дорослих нащадків розвивалась гіперглікемія (Колесник Ю. М., Ганчева О. В., 2006). В 1-місячних щурів був низький відсотковий вміст маленьких острівців при меншому показнику концентрації глюкози крові, порівняно з одновіковими нащадками інтактних самок. Водночас із цим показник середньої площі острівців мав набагато більші значення з 1-го місяця, але його зростання відбувалося тільки до періоду статевої зрілості щурів. У 18-місячних експериментальних тварин площа острівців знижувалась, на відміну від цього показника у нащадків самок із нормальним перебігом вагітності. Загалом панкреатичні острівці нащадків самок ЕГД містили менше бета-клітин за кількістю і відсотковим співвідношенням, ніж острівці інтактних нащадків, крім віку 1 місяць, коли чисельність бета-клітин була більшою. Проте в 1-місячному віці кількість альфа- і бета-клітин була однаковою, як і у тварин контрольної групи. (рис. 2).

Рис. 2. Вікова динаміка змін середньої кількості альфа- та бета-клітин у панкреатичних острівцях нащадків самок з ЕГД і нащадків інтактних самок

Розміри бета-клітин були більшими в ранньому постнатальному періоді життя та у статевозрілих тварин, і ця гіпертрофія мала компенсаторний характер у відповідь на пренатальну дію гіперглікемії. Як відомо, інсулін не проникає через плаценту (Goodner C. J. et al., 1961; Girard J. et al., 1974), тому при гестаційному діабеті бета-ендокриноцити плоду функціонують із підвищеним навантаженням. Внаслідок цього бета-клітини в 1- та 7-місячних експериментальних тварин містили інсуліну більше, ніж у нащадків інтактних самок. Але вже у дорослому віці компенсаторні механізми обмежувались, що проявлялося у вигляді зменшення площі бета-клітин та вмісту в них інсуліну. У літературі містяться дані щодо зниження активності гена-промотора інсуліну під впливом хронічної надлишкової стимуляції бета-клітин високими концентраціями глюкози, результатом чого є зниження секреції інсуліну (Harmon J. S. et al., 1999; Han J. et al., 2007). Виявлений низький, порівняно з контролем, вміст інсуліну в острівцях 7- та 18-місячних нащадків самок з ЕГД може свідчити про високу його потребу для контролю концентрації глюкози крові (Serradas P. et al., 1998; Boloker J. et al., 2002). До того ж розвиток гіперглікемії у дорослому віці експериментальних тварин супроводжувався збільшенням кількості альфа-ендокриноцитів, площа яких та вміст глюкагону були знижені.

Дослідження на щурах лінії SHR зі спонтанним генетично обумовленим підвищенням артеріального тиску показали, що з віком у цих тварин розвивається гіперглікемія та гіперінсулінемія, тобто має місце інсулінорезистентність (Sechi L. et al., 1996; Pravenec M. et al., 2002; Sebastien M. еt al., 2006; Колесник Ю. М. та ін., 2007). При оглядовій мікроскопії звертало увагу те, що ендокринний апарат підшлункової залози статевозрілих щурів лінії SHR був представлений маленькими острівцями (Iwase M. et al., 2001; Inuwa I. et al., 2005) (рис. 3) Це узгоджується з думкою про функціональну роль маленьких острівців в умовах гіперглікемії (Alonso L. C. et al., 2007; Lehmann R. et al., 2007). У старих щурів лінії SHR, крім візуально визначених острівців великого розміру, було встановлено зростання їх середньої площини в 4 рази, у порівнянні зі статевозрілими.

Рис. 3. Вікова динаміка змін середньої площі панкреатичних острівців та відсоткового вмісту типів острівців за площею у щурів лінії Wistar та SHR (мкм², %)

За нашими даними таке збільшення площі острівців у 24-місячних щурів лінії SHR було обумовлено зростанням кількості і відсоткового вмісту в острівцях бета-клітин. Тобто, у відповідь на гіперглікемію у статевозрілих щурів лінії SHR спрацьовували компенсаторні механізми за рахунок високоактивної діяльності маленьких острівців, а у старих у цей процес включалася адаптаційна гіперплазія бета-клітин (Xu G. et al., 1995).

Вже з 7-місячного віку при низької кількості бета-клітин розвивалася їх гіпертрофія із високим вмістом інсуліну. Одночасно в острівцях цього гормону містилося менше, ніж у статевозрілих щурів лінії Wistar. Попри те, у старих щурів лінії SHR спостерігалося збільшення вмісту інсуліну в острівцях, у порівнянні з 7-місячними. Цей ефект внутрішньоострівцевої кумуляції гормону, пов'язаний з порушенням процесів глюкозостимульованої секреції інсуліну бета-клітинами, був виявлений і у старих щурів лінії Wistar (Reaven E. P. et al., 1981; Borg L. et al., 1995; Wang S. et al., 2008). Компенсаторні реакції ендокринного апарату підшлункової залози щурів лінії SHR на високу концентрацію глюкози крові не обмежувалися вище викладеними механізмами. Також було виявлено значно меншу кількість альфа-клітин у статевозрілих і старих щурів лінії SHR порівняно з одновіковими щурами лінії Wistar. Хоча разом з цим визначився високий вміст цього гормону в альфа-ендокриноцитах і острівцях 24-місячних щурів лінії SHR, у порівнянні зі старими щурами лінії Wistar (Quesada I. et al., 2008). Показники кількості дельта-клітин та вмісту в них соматостатину були низькими в обох вікових групах щурів лінії SHR порівняно з Wistar, хоча в острівцях старих щурів лінії SHR спостерігався високий вміст цього гормону (Mitra S. W. et al., 1999; Rutter G. A., 2009). Важливо зазначити, що дельта-клітини у щурів лінії SHR були зосереджені переважно в маленьких острівцях і невелика їх кількість містилася в середніх, у великих і гігантських острівцях ці клітини були відсутні. Це власне спостереження ще раз підкреслює функціональне значення маленьких острівців при гіперглікемії.

Особливість багатьох, якщо не всіх, ендокринних клітин синтезувати і накопичувати більше одного гормону вивчалася в багатьох дослідженнях (De Krijger R. R. et al., 1992; Lukinius A., et al., 1992; Teitelman G. et al., 1993; Chiang M. K. et al., 2003). Незважаючи на суперечливість даних щодо ролі аміліну в нормі та патології, думки вчених суголосні, що амілін є гормоном-синергістом інсуліну і основним місцем його синтезу та секреції є бета-клітини (Johnson K. H. et al., 1988; Cooper G. J. S., 1994; Mulder H. et al., 1995; Hettiarachchi M. et al., 1997).

У нашому дослідженні встановлено, що форма бета-клітин і клітин, які синтезують амілін, а також центральна локалізація цих типів ендокриноцитів у панкреатичних острівцях були схожі. Наступною зазначеною особливістю є збільшення кількості клітин, здатних синтезувати амілін, паралельно зі зменшенням кількості бета-клітин у 24-місячних тварин лінії Wistar. При цьому поряд із збільшенням вмісту інсуліну в острівцях відбувалося зниження аналогічного показника аміліну. Найімовірніше, виявлені зміни були проявами агоністичної дії аміліну у відповідь на брак фізіологічного ефекту інсуліну через зниження кількості бета-ендокриноцитів і порушення секреції ними інсуліну в процесі старіння організму. У таких умовах можливим альтернативним джерелом синтезу аміліну виступають альфа-клітини. Про це свідчить зростання кількості альфа-ендокриноцитів, відсутність статистично значущих відмінностей їх площі від площі амілінсинтезуючих клітин, а також істотне зниження вмісту глюкагону в альфа-клітинах і острівцях.

У тварин з ЕЦД вже з 21-го дня перебігу патологічного процесу одночасно з прогресуючим зниженням кількості бета-ендокриноцитів визначалося зменшення числа амілінімунореактивних клітин (Iki K. et al., 2007). Вміст амілоїдного поліпептиду в клітинах зростав, а в острівцях статистично значуще не змінювався. У бета-клітинах на початку розвитку ЕЦД також зростав вміст інсуліну, але вміст цього гормону в острівцях знижувався у відповідь на високу потребу в ньому. Стверджувати про спільну продукцію і ко-секрецію інсуліну й аміліну можна лише за відсутності патології (Takada K. et al., 1996; Ahren B. et al., 1997). При ожирінні, порушенні толерантності до глюкози, 2-му типі ЦД за допомогою подвійної імуногістохімічної обробки препаратів підшлункової залози була показана ко-експресія амілоїдного поліпептиду іншими ендокриноцитами острівця (Madsen O. D. et al., 1991; Enoki S. et al., 1992), переважно дельта-клітинами (De Vroede M. et al., 1992; Iki K. et al., 2007). У підшлунковій залозі тварин з ЕЦД, по-перше, було виявлене збільшення кількості дельта-клітин, по-друге, зменшення їхньої середньої площі, яка ставала рівною середній площі амілінсинтезуючих клітин, по-третє, зниження вмісту соматостатину в дельта-клітинах в процесі розвитку ЦД. Поряд із цим визначалося збільшення вмісту аміліну в клітинах, здатних його синтезувати, і досить стабільний рівень вмісту цього гормону в острівцях тварин з цукровим діабетом тривалістю 3 та 5 тижнів. Отримані дані в сукупності з літературними можуть свідчити про включення в процеси синтезу аміліну дельта-ендокриноцитів при ЕЦД, що перебігає за 1-им типом.

У тварин моделі ЕГД у ранньому постнатальному і статевозрілому віці визначалося менше за кількістю, порівняно з контрольною групою, амілінсинтезуючих клітин. У дорослих тварин число бета-клітин не збільшувалася, у порівнянні з 7-місячними, хоча клітин, що синтезують амілін, ставало вдвічі більше. Разом з цим кількість альфа-клітин у 18-місячних тварин була майже в 2 рази більше, ніж у 7-місячних, їх площа була такою ж, як і площа клітин, імунопозитивних до аміліну, а глюкагону в них, так само як і в острівцях, містилося менше. Натомість показник вмісту амілоїдного поліпептиду в острівцях 7 - і 18-місячних нащадків самок з ЕГД не відрізнявся, але був більшим, порівняно з одновіковими тваринами групи контролю, у той час як вміст інсуліну в острівцях експериментальних тварин був нижчим, ніж в острівцях нащадків інтактних самок. Таким чином, збільшення кількості амілінсинтезуючих клітин і вмісту аміліну в острівцях у дорослих нащадків самок з ЕГД можуть бути ознаками залучення у процеси синтезу аміліну альфа-клітин (Yoon S. et al., 2005).

У статевозрілих щурів лінії SHR спостерігалася менша кількість бета-і амілінсинтезуючих клітин, у порівнянні із статевозрілими щурами лінії Wistar. І паралельне зростання числа обох типів ендокриноцитів було відзначене у старих щурів лінії SHR. У 7-місячних щурів лінії SHR амілоїдного поліпептиду, як і інсуліну, в острівцях містилося менше, у порівнянні з 7-місячними щурами лінії Wistar. Тобто, простежувалась спільність локалізації обох гормонів у бета-клітинах і синергізм їх біологічної дії. У 24-місячних тварин лінії SHR було виявлене збільшення показників середнього вмісту інсуліну і аміліну в острівцях, причому останнього до максимального значення серед досліджуваних періодів життя тварин.

Отже, можливі варіанти локалізації аміліну в різного типу острівцевих ендокриноцитах тварин кожної з моделей експериментальної патології і при природному процесі старіння. Але односпрямованість змін функціональних параметрів клітин, що синтезують амілін та інсулін, свідчить про синхронну дію цих гормонів та існування єдиного стимулу, що ці зміни спричиняє. Думається, таким стимулом є гіперглікемія. І якщо раніше в роботах Orci 1976, Gerich 1981, Колесник Ю. М. 1990-1993, Yoon 2003 було показано збільшення абсолютної кількості альфа-клітин внаслідок зниження чисельності бета-клітин при ЦД, а зростання кількості дельта-клітин пояснювалось необхідністю зниження надмірної секреції глюкагону, то зараз бачиться дещо інший регуляторний механізм. Зокрема, при зниженні бета-клітинної маси, нестачі інсуліну або в умовах порушення його фізіологічної дії (інсулінорезистентності) відбувається додаткова активація синтезу аміліну в альфа- і / або дельта-ендокриноцитах. Тобто, стимуляція синтезу амілоїдного пептиду є можливим альтернативним способом зниження концентрації глюкози крові, відмінним від механізму дії інсуліну шляхом. За даними літератури, гіпоглікемічний ефект аміліну пов'язаний із пригніченням почуття голоду через вплив на гіпоталамічні та стовбурові центри, уповільненням спорожнення шлунка через центральну регуляцію еферентної вагусної активності (Macdonald I. A., 1997), подовженням періоду абсорбції глюкози (Arnelo U. et al., 1996; Hayden M. R. et al., 2001; Lutz T., 2006), а також глюкагоностатичною дією при гіперглікемії та в постпрандіальний період, коли у такий спосіб зменшується гепатичне вивільнення глюкози в системний кровообіг (Silvestre R. A. et al., 2001; Young A., 2005).

ВИСНОВКИ

За допомогою сучасних імунофлюоресцентних методів дослідження, оптичних приладів із принципом ICS та підключення комп'ютерної системи аналізу зображень, яка виконує високоточні вимірювання геометричних та денситометричних параметрів, було вивчено комплекс морфофункціональних змін панкреатичних острівців у вікової динаміці в нормальних тварин та при розвитку гіперглікемії внаслідок дії різноманітних факторів.

1. Розвиток гіперглікемії внаслідок дії на організм певних ендогенних (вік, генетична схильність) та екзогенних (пренатальна гіперглікемія, селективне бета-клітинне ушкодження) несприятливих факторів супроводжується змінами морфогенетичних та цитоархітектуральних характеристик панкреатичних острівців. Ступінь вираженості і початок розвитку гіперглікемії із комплексом змін морфофункціональних параметрів альфа-, бета-, дельта- та амілінсинтезуючих клітин при цьому залежить від кожного конкретно причинного фактору.

2. Вікова динаміка змін стану панкреатичних острівців характеризується зростанням їх площі за рахунок збільшення кількості бета-ендокриноцитів на тлі нормоглікемії до 18-місячного віку тварин включно. У старих тварин у 24 місяці життя концентрація глюкози крові перевищує нормоглікемічний рівень, і площа острівців зменшується у 2 рази, що обумовлене зниженням кількості бета-клітин у 1,6 рази. При цьому зростає вміст інсуліну у збільшених за розміром на 12% бета-ендокриноцитах та острівцях. Кількість альфа-клітин зростає у 2 рази.

3. Гіперглікемія при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті, що перебігає за типом 1, протягом перших 3-х тижнів обумовлена прогресуючим зменшенням площі острівців внаслідок масової деструкції бета-клітин, а до закінчення 5-го тижня також і зменшення кількості альфа-ендокриноцитів на 60%. Нечисленні бета- і альфа-клітини збільшені в розмірах із високим вмістом гормонів. При цьому вміст інсуліну в острівцях знижується у міру прогресування патологічного процесу. Кількість дельта-клітин зростає у 2 рази.

4. Для 1-місячних нащадків самок з експериментальним гестаційним діабетом характерна макросомія, більша площа острівців та більша кількість альфа- і бета-клітин, але відсоткове співвідношення цих ендокриноцитів однакове, як і у одновікових нащадків інтактних самок. У 7-місячному віці у цих тварин перевищення нормоглікемічного рівня відбувається на тлі більшої площі острівців із меншою кількістю бета-ендокриноцитів і нижчим вмістом інсуліну в острівцях. У віці 18 місяців при збільшеному рівні глікемії середня площа острівців знижується при паралельному практично двократному збільшенні кількості альфа-клітин. В острівцях 7- та 18-місячних тварин удвічі більша кількість дельта-клітин менших за розміром.

5. Як для статевозрілих, так і для старих гіпертензивних щурів лінії SHR характерним є гіперглікемічний стан. У 7 місяців у цих тварин переважають маленькі острівці, а у підшлунковій залозі одновікових щурів лінії Wistar присутні острівці більшої площі. У відповідь на гіперглікемію у старих самців (24 місяці) компенсаторна реакція формується переважно шляхом зростання площі острівців у 4 рази (за рахунок зростання кількості бета-клітин у 3 рази), тоді як в одновікових щурів лінії Wistar цей показник знижується на 25%. При домінуванні в острівцях бета-ендокриноцитів із низьким вмістом інсуліну поодинокі альфа-і дельта-клітини характеризуються високим вмістом гормонів.

6. Специфіка змін морфофункціональних параметрів амілінсинтезуючих клітин залежить від чинника, що обумовлює розвиток гіперглікемії. У старих тварин лінії Wistar кількість бета-ендокриноцитів знижується на 40%, а клітин, здатних продукувати амілін, зростає на 55%. При експериментальному цукровому діабеті знижується кількість бета-ендокриноцитів та амілінімунопозитивних клітин, але вміст аміліну в острівцях не змінюється. У дорослих нащадків самок з ЕГД при незмінній чисельності бета-ендокриноцитів зростає кількість амілінсинтезуючих клітин. В острівцях старих щурів лінії SHR відбувається зростання кількості бета- та амілінсинтезуючих клітин. Це вказує на можливість синтезу аміліну не тільки бета-клітинами, а й іншими ендокриноцитами острівця.

7. Результати комплексної оцінки морфофункціонального стану панкреатичних острівців розширюють і доповнюють уявлення про механізми розвитку гіперглікемії з урахуванням функціональних особливостей альфа-, бета-, дельта- та амілінсинтезуючих клітин, що може бути використане у розробці адекватних превентивних заходів і методів корекції в осіб зі встановленими факторами ризику розвитку порушень вуглеводного обміну.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Грекова Т. А. Влияние пренатальной гипергликемии на морфофункциональное состояние эндокринного аппарата поджелудочной железы самцов крыс в возрастной динамике / Т. А. Грекова. - Запорожский медицинский журнал. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 12-15.

2. Грекова Т. А. Порівняльна характеристика отсрівців Лангерганса у статевозрілих та старих щурів самців лінії SHR i Wistar / Т. А. Грекова. - Вісник наукових досліджень, науково-практичний журнал. - 2010. - Т. 2, № 59. - С. 50 - 52.

3. Колесник Ю. М. Нейро-иммунно-эндокринные механизмы регуляции эндокринной функции панкреатических островков / [Колесник Ю. М., Абрамов А. В., Ганчева О. В., Камышный А. М., Грекова Т. А.]. - Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2010. - Т. 5, № 3. - С. 16-20. (Дисертантом представлені літературні дані та матеріал власних спостережень у рамках виконуваної планової комплексної теми кафедри патофізіології ЗДМУ).

4. Грекова Т. А. Состояние альфа-, бета-, дельта- и амилинсинтезирующих клеток панкреатических островков самцов крыс линии Wistar в динамике развития стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета / Т. А. Грекова, Ю. М. Колесник. - Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2009. - Т. 4, № 2. - С. 22-27. (Дисертант брав участь у постановці експерименту, самостійно проводив підбір, аналіз та узагальнення літературних даних, готував матеріал дослідження, обробляв отримані дані).

5. Колесник Ю. М. Особенности постнатального морфогенеза инсулрного аппарата поджелудочной железы самцов крыс / [Ю. М. Колесник, Т. А. Грекова, А. В. Абрамов, М. А. Тихоновская]. - Патология. - 2009. - Т. 6, № 3. - С. 67-68. (Дисертантом самостійно проводився підбір, аналіз та узагальнення літературних даних, робота з первинним матеріалом, статистична обробка результатів дослідження).