Генетическая регуляция факторов патогенности

Размещено на http://allbest.ru

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И.М. Сеченова

Лечебный факультет

Доклад на тему: «Генетическая регуляция факторов патогенности»

Выполнила: Петриченко М.С.,

студентка 34 группы

Проверил: Пашков Евгений

Петрович

Москва 2014.



ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ

Патогенность, или болезнетворность, - это потенциальная способность микробов вызывать инфекционный процесс, т.е. проникать в макроорганизм (определённого вида, при естественных условиях заражения), размножаться в нём, вызывать различные нарушения гомеостаза и развитие ответных реакций макроорганизма. Вирулентность и токсинообразование - непременные атрибуты патогенности. Вирулентность -- степень способности данного инфекционного агента (штамма микроорганизма или вируса) заражать организм.

Факторы патогенности - это материальные носители, способные вызвать инфекционный процесс. В зависимости от участия в разных стадиях инфекционного процесса выделяют факторы адгезии, колонизации, пенетрации, инвазии и подавления неспецифической и иммунной защиты организма хозяина. Все эти факторы находятся под контролем хромосомных и плазмидных генов. Большинство генов факторов патогенности располагается на хромосомах отдельными кластерами, причём наблюдается своеобразное разделение функций между хромосомой и плазмидами.

Участки ДНК, кодирующие факторы патогенности, отличаются от остальной части генома по ряду признаков. Это позволило выдвинуть концепцию о ведущей роли «островков» патогенности, а также систем секреции факторов патогенности в развитии инфекционного процесса.

«Островки патогенности» (ОП) представляют собой особую область ДНК, которая присутствует в геноме вирулентных штаммов микроба-патогена и отсутствует в авирулентных формах того же самого вида. Кодирующие гены ОП локализованы на плазмидах или интегрированы в бактериальную хромосому в составе профагов или других генетических элементов.

Впервые ОП были описаны в 1980 г. у уропатогенных E. coli (UPEC) Йоргом Хакером и его коллегами из Вирцбургского университета, Германия. Они разработали концепцию мозаичного строения генома бактериальных патогенов, который включает относительно древние и стабильные участки ДНК и разбросанные среди них островки патогенности, приобретенные путем горизонтальной передачи генов.

С тех пор островки патогенности были описаны у многих патогенных бактерий. У грамположительных микроорганизмов роль островков патогенности играют генетические кассеты или кластеры генов. Часто один и тот же микроорганизм обладает несколькими островками патогенности, выполняющими разные функции. Подавляющее большинство детерминант вирулентности не относится к жизненно важным для бактерий. Также вирулентность не является устойчивым признаком какого-либо вида. Например, токсинопродуцирующие штаммы коринебактерий, стафилококков, стрептококков, эшерихий и прочих микроорганизмов фенотипически не отличаются или практически не отличаются от авирулентных штаммов этих же видов.

В геноме иногда обнаруживаются элементы, структурно похожие на ОП, но лишенные генов патогенности. Эти элементы также нестабильны и называются «геномными» или «метаболическими островками».

СТРУКТУРА

ОП несет от одного до нескольких десятков генов, кодирующих факторы патогенности. ОП занимают относительно большую область генома. Их размер от 10 до 200 kb.

Детерминанты вирулентности, кодируемые ОП:

1. Факторы адгезии и колонизации Энтеропатогенные и энтерогеморрагические E.coli, вызывающие острые кишечные инфекции, имеют островок патогенности, кодирующий белок адгезии Tir. Tir-протеин встраивается в мембрану энтероцитов, взаимодействует с белком-интимином на поверхности энтеропатогенных и энтерогеморрагических E.coli, что приводит к адгезии возбудителей на энтероцитах.

2. Факторы инвазии. ОП сальмонелл и шигелл кодируют инвазины, впрыскиваемые в клетку-мишень, в результате чего происходит перестройка цитоскелета с образованием пальцевидных выпячиваний на поверхности кишечного эпителия, которые смыкаются вокруг патогена с формированием эндосомы.

3. Белки секреторных систем. Важной особенностью многих патогенных микроорганизмов является способность целенаправленно доставлять детерминанты вирулентности в клетку-мишень. Грамотрицательные патогены Salmonella spp., E. coli, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori, Brucella spp., Chlamyophila psittaci, Legionella spp., Yersinia pestis имеют ОП, кодирующие системы секреции факторов патогенности I - V типов.

4. Факторы, способствующие ускользанию от действия иммунной системы и внутриклеточной бактерицидности. Шигеллы и листерии, находясь внутри клетки-хозяина в фагосоме, лизируют фагосомальную мембрану и поступают в цитоплазму, где становятся недоступными разрушению. Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia spp., Legionella pneumophilia продуцируют белки, препятствующие слиянию лизосом с фагосомами, что предотвращает переваривание этих микроорганизмов. Белок SipB, кодируемый ОП-1 Salmonella spp., вызывает апоптоз макрофагов.

5. Систему сидерофоров. Способность конкурировать за питательные вещества является существенным аспектом патогенеза. Сидерофоры - белки, связывающие ионы железа и необходимые для его перемещения в бактериальную клетку. Ионы железа важны для проявления вирулентных свойств бактериями. Yersinia spp. синтезируют иерсинобактин, S. flexneri - аэробактин, S. typhimurium - Sit1, S. pneumoniae - Рit2. Островки патогенности грамположительных бактерий. У грамположительных микроорганизмов гены патогенности располагаются сгруппировано, но в отличие от грамотрицательных, они не ограничены прямыми повторами или генами тРНК, в связи с чем ОП грамположительных сложно идентифицировать и их называют генетическими кассетами, или кластерами генов.

Таблица 3. ОП и кластеры патогенности грамположительных микроорганизмов

Виды бактерий	ОП/кластер	Детерминанта вирулентности	Свойства, функции
S. aureus	SaPI	Токсин синдрома токсического шока (TSST-1)	Суперантиген, синдром токсического шока
S. aureus	SCCmec	Пенициллин связывающий белок PBP 2a	Устойчивость к метициллину и другим -лактамам
L. monocytogenes	PrfA кластер	Листериолизин О, PlcA/B	Лизис фагоцитарной вакуоли
C. difficile	tcdA, tcdB, tcdC, tcdD tcdE	Актинотропные энтеротоксины	Приводят к антибиотикоассоциированной диареи и псевдомембранозному колиту
S. pyogenes	Vir регулон	белок М, ScpA	Антифагоцитарный белок и суперантиген, C5a пептидаза
S. pneumoniae	ОП 1	Pit2 - АВС транспортный белок	Захват железа

Строение островка патогенности. Располагается вблизи генов тРНК. По обоим его концам находятся прямые повторы (DR), в начале - ген, кодирующий интегразу. Далее следуют один или несколько генов вирулентности (V1 - V4), IS элементы

ОТЛИЧИЯ ОТ ОСТАЛЬНОЙ ДНК

ОП отличаются от нативного генома по составу нуклеотидных оснований. Это результат чужеродности ОП к ДНК бактерии-реципиента. Степень чужеродности обычно характеризуется по процентному содержанию пар оснований гуанин - цитозин (G+C).

В бактериальной ДНК содержание G+C колеблется от 25 до 75 %. У патогенных видов процентное содержание G+C составляет 40 - 60 %. Установлено, что нативная бактериальная ДНК в норме составляет 70-80% генома, а привнесённые генетические элементы, соответственно, 20-30%. Горизонтально приобретенные ОП, как правило, сохраняют состав донорского вида, однако в процессе эволюции содержание G+C может меняться и со временем приобретать сходство с реципиентным геномом.

Участки генома с отличным содержанием G+C, чужеродные для нативного генома бактерий, могут иметь разные размеры и свободно перемещаться по геному бактерии или с помощью горизонтального переноса. Эти участки называются «гибкий генофонд» и включают мобильные (или условно мобильные) генетические элементы (IS-элементы, транспозоны, интегроны, плазмиды и профаги) и геномные острова.

ОП обычно локализованы в областях, смежных с tRNA-генами, что позволяет предположить об использования этих генов в качестве якоря для прикрепления чужеродной ДНК, попавшей в бактериальную клетку путем горизонтальной передачи. Далее фрагмент чужеродной ДНК, фиксированный на tRNA-гене, включается в реципиентный геном путем рекомбинации между tRNA-генами, характеризующимися высокой консервативностью для разных бактериальных видов.

ОП часто фланкированы прямыми повторами, которые представляют собой последовательности ДНК, состоящие из 16 - 20 пар оснований (в некоторых случаях до 130). Для прямых повторов характерна четкая регулярная повторяемость. Прямые повторы играют роль сайтов распознавания для энзимов, участвующих в разрезании мобильных генетических элементов, что приводит к нестабильности ОП. Иногда ОП подвергаются воздействию делеций.

ОП часто несут латентные или функционально мобильные гены детерминант генетического обмена (транспозаз, интеграз, инсерционных последовательностей). Интегразы - компоненты лизогенных бактериофагов, обусловливают включение фагового генома в геном бактерии-хозяина, а также инициируют начало литического цикла. Такие функционально активные гены, находящиеся в ОП, могут кодировать белки, которые способны разрезать чужеродную ДНК и даже приводить к полному исчезновению всей структуры ОП.

Другие мобильные генетические элементы, похожие на интегразы, воздействуют на гены транспозонов. Они могут менять локализацию транспозонов в хромосоме, а иногда даже индуцировать перепрыгивание транспозона из хромосомы в плазмиду, и наоборот. Часто в ОП обнаруживаются инсерционные элементы, которые могут приводить к инактивации генов, а комбинации из двух и более таких элементов приводят к мобильности большей части ДНК. ОП могут также нести интегрированные плазмиды, конъюгативные транспозоны, бактериофаги или отдельные части этих элементов.

ОП отличаются нестабильностью и изменяются с более высокой частотой, чем нормальная степень частоты мутаций. Такие мутации обусловлены не изменениями индивидуальных генов вирулентности, а потерей больших участков ОП или даже целых ОП. Эти мутации могут наблюдаться в процессе культивирования патогенов in vitro, а также их обнаруживают в образцах, выделенных от больных, имеющих персистентную форму инфекции, т.е. in vivo. Генетическую нестабильность и мобильность ОП обусловливают также и те механизмы, которые играют ведущую роль в горизонтальной передаче генов, такие как интегразы, транспозазы и IS-элементы. Нестабильность, как и стабильность «островов», видимо, не случайность в проявлении бактерией патогенности. Эти свойства способны создать бактерии дополнительные адаптивные преимущества. Высокая вирулентность может оказаться невыгодной на определенной стадии инфекционного процесса. Нестабильность же «островов патогенности» будет способствовать координированному снижению вирулентности всей популяцией возбудителя инфекции. Делеция «островов патогенности» может усилить экспрессию других, рядом расположенных, генов. патогенность микроорганизм геном

С другой стороны, отдельные факторы вирулентности являются адаптивными для бактерий. По этой причине они должны кодироваться на стабильных «островах патогенности».

Чужеродность «островов» придает даже большую стабильность факторам вирулентности. Чужеродная ДНК, интегрировавшаяся с хромосомой, не вовлекается в рекомбинацию с ДНК близкородственных микроорганизмов, поэтому она может длительно поддерживаться в бактериальных популяциях. Видимо применительно к каждому патогенному микроорганизму «стабильность» и «нестабильность» «островов» закрепляется естественным отбором.

Для ОП характерна мозаичная структура приобретенной ДНК. Некоторые ОП представляют собой вставку одного генетического элемента. Другие имеют более сложную структуру.

Она возникает в процессе эволюции за счет включения в ОП элементов различного происхождения. Эти элементы могут включаться независимо в разное время и от разных хозяев. Однако эти приобретенные элементы ДНК интегрируются в одном и том же участке хромосомы реципиентной бактериальной клетки. Т.о. происходит аккумуляция горизонтально приобретенных элементов на одном участке хромосомы. При этом такие структурные мишени, как tRNA-гены, могут быть повторно использованы для включения в ОП различных генетических элементов. Как правило, ОП содержат гены, кодирующие продукцию ФП, делающих микроб потенциально вирулентным.

В комплекс патогенности входят ФП, ответственные за функцию колонизации, функцию защиты от фагоцитоза и токсическую функцию, лежащую в основе поражающего действия.

Каждая группа генов кодирует продукцию соответствующих ФП независимо друг от друга. Это значит, что в ОП одного и того же вида могут содержаться различные комбинации генов, ответственных за биосинтез функционально различных ФП. Т.о. штаммовое многообразие патогенного вида можно объяснить различными комбинациями генов в ОП. Имеются штаммы, лишенные вообще ОП, а также штаммы, имеющие ОП с одним или несколькими наборами генов, обусловливающих продукцию различных типов ФП.

Например, можно допустить, что существуют штаммы, у которых из всего комплекса патогенности в ОП сохранились гены, кодирующие только факторы адгезии. Такие штаммы способны продуцировать адгезины и осуществлять адгезивную функцию, но из-за отсутствия других ФП они становятся невирулентными для организма хозяина.

Другой пример: в популяции B. anthracis имеются штаммы, у которых ОП содержит одновременно гены, контролирующие синтез глутамил-полипептида и его сборку в капсульную структуру, а также гены, ответственные за биосинтез экзотоксина. Это полноценно вирулентные штаммы.

Но имеются и штаммы, продуцирующие какой-то один из указанных ФП. Эти штаммы авирулентны также как и штаммы, которые вообще лишены способности продуцировать ФП. Штаммовое многообразие патогенного вида подтверждает главную особенность ОП - их высокую мобильность и высокую степень изменчивости.

Как правило, гены патогенности, содержащиеся в островах патогенности, регулируются координированно, т. е. функционируют как самостоятельный геном патогенности в составе хромосомы клетки.

КОДИРОВАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ

Как отмечалось выше, при кодировании факторов патогенности наблюдается своеобразное разделение функций между хромосомой и плазмидами. Так, образование пилей общего типа, участвующих в адгезии, контролируется хромосомными генами. В то же время адгезия, колонизация и некоторые антигены у эшерихии контролируются плазмидами CFA/I, CFA/II, CFA/III. Образование биологически активных веществ, участвующих в пенетрации, также контролируется плазмидами (например, у шигелл Зонне и других бактерий), а ферментов гиалуронидазы и нейраминидазы, участвующих в инвазии, хромосомными генами.

Синтез антифагоцитарных и антикомплементарных веществ, например протеина А золотистого стафилококка, М-протеина пиогенного стрептококка, капсульного полисахарида пневмококка, контролируют главным образом хромосомные гены. В R-плазмидах бактерий содержатся транспозоны, контролирующие не только множественную устойчивость к разным антибиотикам, но и их токсичность.

Характеристика отдельных «островов патогенности»

Микроорганизм	Наименование	Локализация	Районы	Стабильность	Чужеродность происхождения, G-C: % островов/ % хромосомы	Функция	Размер, Кб
Уропатогенная E. coli 536	Остров патогенности I (Pai I)	Sel Ca, 82'	16 кб, прямые повторы, производные от sel C общий мотив с Pai II повторами	Нет	Прямые повторы; отсутствуют в E. coli нормальных фекалий и в лабораторных штаммах	альфа-гемолизин	70
	Pai II	Leu Xa, 97'	18 кб, прямые повторы, производные от leu X, общий мотив с Pai I повторами	Нет	То же	альфа-гемолизин, prf (фибрии, адгезивные к клеткам хозяина), транскрипционные активаторы хромосомных генов	190
Уропатогенные E. coli J96	(Pai I)	Вблизи Phe Va, 64'	--	--	То же	альфа-гемолизин, pap (фибрии, адгезивные к клеткам хозяина), последовательности IS-элементов, последовательности R-плазмид, последовательности фага Р4	>170
	Pai II	Phe Ra,94'	135 кб, неполный прямой повторяющийся	Нет	То же	альфа -гемолизин, pis (фимбрии, адгезивные для клеток хозяина), цитотоксический некротизирующий фактор I типа, последовательности IS-элементов, последовательности фага Р4, Omp R гомолог	106
Энтеропатогенные E. coli	Локус стирания энтероцитов, LEE	Sel Ca,, 82'	Повторов или IS-элементов не найдено	Даb	G+C:39/51, не показано тесной связи	Вызывает АЕ-поражения, секреторная система III-типа	35
S. typhymurium	SPI 1	Между fhe и mut S, 63'	Повторов или IS-элементов не найдено; в некоторых серологически различных штаммах граничат с IS3	Да	G+C:42/52, отсутствуют в E. coli	Инвазия в культуры эпителиальных клеток, секреторная система III-типа	40
	SPI 2	между ydh E и pyk F, 31'		Даb	G+C:42/52, отсутствуют в E.coli, законсервирован среди Salmonella	III тип секреции	40
	Сальмонелла- индуцируемый жгутиковый ген А, sif A	potB/potC	140 кб, прямые повторы	Да	G+C:41/52, прямые повторы; отсутствие в E. coli; законсервирован среди Salmonella	Для формирования структур, связанных с сальмонелла-ассоциированными вакуолями в пределах эпителиальных клеток	1,6
Y. pestis	Способность к адсорбции экзогенных пигментов, Pgm	Pho E	2,2 кб, прямой повтор (=IS 100)	Нет	G+C: регион накопления гемина 47/46-50; Рецептор иерсинеобактина / регион железорегулируемого белка 56-60/46-50; Прямые повторы	Связывание гемина и конго красного. Пестицинчувствительность. Связывание железа. Рост при 37°С в обедненной среде	102
V. cholerae 0137	Otn A otn B	rfb	Фланкирован двумя различными IS -элементами	--	IS-элемент; не содержится в Vibrio cholerae 01 El Tor	Синтез капсулы и О антигена	35
L. monocytogenes	--	Между prs и ldh	IS-элементов не обнаружено	Даb	В непатогенных видах отсутствует	Избавляет листерию от вакуоли; внутри и внеклеточное распространение	9,6

Примечание: а -- ген tRNA; b -- сравнительно

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ОП

У бактерий обнаружено два типа генов, составляющих ОП и контролирующих синтез факторов патогенности: гены собственной хромосомы и гены, привнесенные в хромосому мобильными генетическими элементами.

Первые, соответственно, возникли в результате мутаций (точечных или аберраций) или рекомбинаций генотипа бактерии. Существенного вклада в генетическое регулирование факторов патогенности они не вносят.

Вторая группа генов включает в себя умеренные конвертирующие фаги, транспозоны, IS-последовательности, плазмиды. Эти гены возникли в результате одновременного горизонтального внутривидового и межвидового переноса генов. Мобильными их называют потому, что они содержат собственные генетические компоненты, кодирующие транспозазу, интегразу, а также сайт-специфические участки, которые взаимодействуют со специфическими сайтами хромосомы клетки и обеспечивают интеграцию в нее.

Источников ОП и всех геномных островков является «гибкий» генофонд (см. свойства ОП) и горизонтальный перенос генов (в отличие от нативного генома, который наследуется вертикально). ОП, полученные с помощью горизонтального переноса, осуществляют «скачки» эволюции микроорганизмов. Уникальные гены каждой конкретной бактерии, не имеющие гомологов в других геномах, скорее всего, будут представлены в геномных островках.

Состав гибкого генофонда во многом зависит от окружающей среды, точнее, от конкретной экологической ниши, населяемой бактериями. Внешняя среда постоянно снабжает бактерии чужеродным ДНК в виде плазмид, фрагментов хромосомной ДНК, фагов и т.д. Интересно, что порой источником генов, переносимых горизонтальным переносом, не обязательно должны являться прокариоты. Например, виды Xanthomonas получили PNP гены, кодирующие натрийуретические белки растений. У Legionella spp. есть многочисленные эукариотические белки.

Механизмами горизонтального переноса генов являются трансформация, конъюнгация и трансдукция.

В результате рекомбинации умеренных фагов с хромосомой бактерий возникли многие патогенные бактерии (Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, EHEC и др.), а в результате переноса генов патогенности плазмидами -- Bacillus anthracis, Yersinia pestis, ETEC, EIEC, EPEC и др. Наиболее значительный вклад в горизонтальный перенос осуществляет фаговая трансдукция.

На то есть ряд причин.

Во-первых, разнообразие фагов составляет примерно 10 видов на 1 вид прокариотов.

Во-вторых, получение новых генов с помощью трансдукции позволяет бактериям заселять новые экологические ниши, что способствует и более широкому распространению фагов. Поэтому трансдукция взаимно выгодна для фагов и бактерий.

При трансдукции имеет место лизогенное превращение - обусловленные фагом фенотипические изменения бактерии. Но чтобы произошли фенотипические изменения, необходимо, чтобы чужеродная ДНК «усвоилась» бактерией. Это достигается рядом этапов, которые будут описаны для формирования островков патогенности.

Пять этапов формирования ОП.

1. Приобретение генов патогенности (часто в виде оперона).

2. Интеграция в хромосому или уже существующую плазмиду посредством сайт-специфической рекомбинации или других механизмов. Интеграция происходит с помощью интегразы или рекомбиназы.

3. Мобильный генетический элемент может трансформироваться в ОП с помощью перестроек генов, их потери или последующего приобретения новых последовательностей. ОП могут стать фиксированными из-за инактивации или делеции ориджинов репликации или генов, вовлечённых в мобилизацию. Результатом является устойчивость и наследование с нативным геномом.

4. Приобретённые гены могут успешно экспрессироваться. Если продукты генов способствуют лучшей адаптации бактерий к условиям среды, естественный отбор закрепляет эти варианты генома.

5. ОП могут эволюционировать дальше с посощью рекомбинации, инсерций или делеций фрагментов

Есть косвенные признаки того, что процесс образования новых штаммов патогенных микроорганизмов идет непрерывно. Основные селективные факторы отбора, действующие в организме человека и животных, относятся к неспецифической и иммунной защите организма хозяина, а также постоянно увеличивающемуся арсеналу этиотропных химиотерапевтических и иммунных (вакцины, иммуноглобулины) препаратов. При этом число новых генотипов, выживших в результате отбора, находится в прямой зависимости от количества действующих селективных факторов. Это приводит к постоянному обновлению генофонда микробной популяции.

Например, новый эпидемический штамм Vibrio cholerae О139 появился в результате приобретения «острова патогенности». Хотя известно, что он возник из штамма того же серотипа (О1), который является причиной происходящей в настоящее время пандемии холеры (О1 El Tor), V.cholerae О139 содержит дополнительный участок ДНК, который замещает часть О-антигенного кластера О1-штамма. Вставленная ДНК содержит открытую рамку считывания, гомологичную протеину, вовлеченному в синтез капсулы и О-антигена -- двух факторов, по которым можно провести различия между О139 и О1 Е1 Тог. Тем самым повышается способность возбудителя холеры к инвазии.



ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОП

В настоящее время применяется несколько подходов.

Первый распространённый способ - идентификация участков генома, содержащих атипичный состав нуклеотидов, например, отличное от остального генома содержание G+C. Хотя этот подход достаточно простой, с его помощью можно не выявить более «древние» ОП, т.к. в процессе эволюции их нуклеотидный состав приближается к составу нативного генома.

Другой подход - поиск генов, продукты которых участвуют в механизмах горизонтального переноса (мобильные гены, интегразы, транспозазы, фаговые гены), а также генов с необычным сходством с генами чужеродных видов. Также помогает скрининг тРНК-генов.

Третий подход - прямое сравнение генома эволюционно близких видов или сероваров и идентификация уникальных регионов.

РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ ОП

Возрастающее число расшифрованных геномов бактерий и использование методов сравнения близкородственных геномов показало, что ОП присутствуют во многих филогенетически далёких организмов. Список обнаруженных ОП очень внушительный. ОП присутствуют как в грамотрицательных, так и в грамположительных бактериях - патогенах человека, животных, растений.

У грамотрицательных бактерий ОП найдены у: H.pylori, разных штаммов E.coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Citrobacter rodentium, L.pneumophila, pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, V.cholerae, D.nodosus, Erwinia amylovora, Bacteroides fragilis, Porphyromonas gingivalis.

У грамположительных бактерий: Listeria spp., S.aureus, Streptococcus spp., Enterococcus faecalis, Clostridium difficile.

Важно отметить, что горизонтальный перенос генов есть не только у прокариот. Пример генов, полученных горизонтальным переносом, встречаются у одноклеточных эукариотов - у рубцовых грибов Orpinomyces joyonii гены получены от рубцовых бактерий Fibrobacter succinogenes. Также горизонтальный перенос есть у патогенных грибов Ustilago hordei и паразитических видов простейших.

У бактерий в основном наличие конкретного ОП специфично для данного патогена, или даже для штамма или серовара. Однако некоторые ОП встречаются у разных видов.

Также очевидно, что многие виды патогенных бактерий имеют более одного ОП.

Кроме того, у некоторых патогенов нет ОП, например у Mycobacterium spp., Chlamydia spp., у спирохет. Причина отсутствия ОП не совсем понятна, однако есть некоторые догадки. Расшифровка генома этих облигатных внутриклеточных паразитов показала, что они высокоспециализированы и адаптированы к специфической окружающей среде.

Этот образ жизни привёл к редукции размера генома и потери способности к размножению вне клетки. Т.к. цена высокой специализации - редукция генома, вполне возможно, что такая редукция привела к делеции большей части участков, приобретённых горизонтальным переносом генов. Кроме того, адаптация к облигатному внутриклеточному паразитизму может привести к органиченному доступу к «гибкому» генофонду - источнику мобильных генетических элементов.

Напротив, большинство патогенов, содержащих ОП, могут существовать в разных средах.



РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ВИРУЛЕНТНОСТИ

Многие гены бактерий экспрессируются лишь при необходимости в их продуктах. Это относится и к генам, кодирующим факторы вирулентности.

В различных условиях окружающей среды микроорганизмы используют различные стратегии жизнедеятельности. При существовании микроорганизма в почве или воде необходимость в синтезе факторов вирулентности отсутствует. При контакте же с организмом хозяина или при попадании в его внутреннюю среду для микроорганизма возникает необходимость в синтезе факторов, обеспечивающих его адаптацию к новым условиям.

Основными факторами, сигнализирующими микроорганизму о попадании во внутреннюю среду организма хозяина, являются:

· повышение температуры;

· осмолярность;

· реакция среды;

· концентрация двухвалентных катионов, прежде всего железа;

· присутствие антибиотика и т.д.

Для "переключения" от одного образа жизни к другому должны существовать системы сигнальной трансдукции, которая заключается в распознавании сигнала, его проведении и активации соответствующих генов. Реализацию перечисленных функций осуществляют двухкомпонентные системы передачи сигналов (или двухкомпонентные регуляторные системы), состоящие из сенсорной гистидинкиназы и регулятора ответа.

Механизм функции двухкомпонентных систем приведен ниже. Сенсорная киназа является белком, осуществляющим трансформацию внешнего сигнала в химическую связь и его передачу к белку (регулятору ответа). Сенсорные киназы локализованы в цитоплазматической мембране микробной клетки и, как правило, состоят из двух доменов.



Схема устройства двухкомпонентной системы сигнальной трансдукции прокариот

Действие сигнала приводит к взаимодействию лиганда, связанного с рецептором, и сенсорной киназы - первого компонента сигнальной трансдукции. Специфичность распознаваемых стимулов определяется структурой сенсорного домена, которая отличается выраженной вариабельностью у отдельных ферментов. Связывание сенсорного домена с внешним стимулом приводит к его конформационным изменениям и аутофосфорилированию передающего домена (димера киназы). В процессе аутофосфорилирования г-фосфат с АТФ переносится на остатки гистидина киназы. Структура передающего домена у различных киназ высококонсервативна.

Следующим этапом в передаче сигнала является перенос фосфата к родственной молекуле белка-регулятора ответа, состоящего из двух доменов: регуляторного и ДНК-связывающего. Взаимодействие киназы и регулятора сопровождается переносом фосфатной группы с гистидина на остатки аспартата в составе регулятора ответа, в результате чего происходит активация гена или их группы. В связи с тем, что сенсорная киназа обладает способностью дефосфорилировать регулятор ответа, то уровень экспрессии гена контролируется и приводится в соответствие с уровнем сигнала.

Двухкомпонентные сигнальные системы могут находиться друг с другом в сетевых взаимодействиях. Например, один из генов, активированный сигналом А необходим для продукции сигнала В, таким образом гены, индуцированные сигналом В зависят от сигнала А.

Двухкомпонентная сигнальная система у патогенных микроорганизмов может приводить к инициации паразитического образа жизни и развитию инфекционного заболевания, а также формированию антибиотикорезистентности. Например, резистентность энтерококков типа VanA и VanB к ванкомицину регулируется сенсорной киназой VanS и регулятором ответа VanR, активирующих транскрипцию генов, ответственных за синтез депсипептид - d-аланил-d-лактата, который инкорпорируется в пептидогликан и приводит к увеличению уровня резистентности к ванкомицину. У Streptococcus pneumonia двухкомпонентная сигнальная трансдукция ciaH - ciaR активирует синтез пенициллин связывающего белка, обеспечивающего высокие уровни резистентности к пенициллину.

Пример. Двухкомпонентные системы передачи сигналов широко распространены среди прокариотических организмов. Так, анализ генома P.aeruginosa позволил выявить у этого микроорганизма 64 гистидинкиназы и 63 регулятора ответа. Функции (полностью или частично) установлены менее чем для 20 систем. Они участвуют в регуляции захвата железа, хемотаксиса, продукции альгината, экспрессии адгезинов и других факторов вирулентности.

В регуляции экспрессии факторов вирулентности участвуют также несколько семейств белковых факторов. Общее свойство этих факторов - способность связываться с определенными участками ДНК и активировать транскрипцию ряда функционально связанных генов.

В качестве примера можно привести белок VirF, осуществляющий регуляцию экспрессии ряда детерминант вирулентности у иерсиний (Yop - Yersinia outer proteins). Активность фактора VirF проявляется только при температуре 37^oС и низком содержании Са²⁺ в окружающей среде.

Поскольку указанные условия характерны для внутренней среды млекопитающих, то очевидно, что биологический смысл функций фактора VirF сводится к "включению" экспрессии факторов вирулентности при попадании микроорганизма во внутреннюю среду организма хозяина.

В регуляции экспрессии факторов вирулентности участвуют также альтернативные сигма-факторы. Они являются обязательным компонентом РНК-полимеразы - ключевого фермента транскрипции. В процессе роста микроорганизмы используют различные сигма-факторы, определяющие преимущественную экспрессию отдельных групп генов. При переходе в стационарную фазу роста или при недостатке питательных веществ микроорганизмы начинают использовать сигма-факторы, обеспечивающие экспрессию генов, необходимых для адаптации к неблагоприятным условиям. Под контролем таких сигма-факторов находится экспрессия ряда генов вирулентности у сальмонелл и эшерихий.

Практически важным является тот факт, что на уровне индивидуальной клетки экспрессия генов вирулентности регулируется одновременно несколькими системами. Иерархически наиболее высоким уровнем регуляции вирулентности, вероятно, является феномен кооперативной чувствительности, или чувства кворума ("quorum sensing").

Данный феномен можно рассматривать как пример "социального" поведения бактерий, поскольку его смысл заключается в модификации физиологических функций бактерий в ответ на изменение их численности. Механизм реализации феномена кооперативной чувствительности заключается в продукции микроорганизмами внеклеточных сигнальных молекул (аутоиндукторов, феромонов), детекции сигнальных молекул и генерации ответной реакции. Общая схема реализации феномена кооперативной чувствительности представлена ниже.

Феномен кооперативной чувствительности:

а) грамотрицательные бактерии, синтетаза аутоиндуктора - ген LuxI; аутоиндуктор гомосеринлактон свободно диффундирует через мембрану и непосредственно связывается с регуляторным протеином;

б) грамположительные бактерии, синтез предшественника аутоиндуктора (феромона) осуществляется на рибосомах, предшественник подвергается посттрансляционной модификации ; транспорт аутоиндуктора наружу осуществляется с помощью системы секреции, распознавание феромона и генерация ответа происходят посредством двухкомпонентной системы передачи сигналов.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУЛЕНТНОСТИ

Изменчивость вирулентности, так же как любого другого признака, может носить фенотипический и генотипический характер.

В первом случае ослабление вирулентности является нестойким явлением, которое может быть связано in vitro с неблагоприятными условиями культивирования бактерий или составом питательных сред. Однако в условиях организма механизм действия может быть связан не с изменением вирулентности бактерий, а с селекцией устойчивых маловирулентных клеток из гетерогенной бактериальной популяции. При последующем культивировании восстановления вирулентности полученной бактериальной культуры может не произойти.

Методы ослабления вирулентности патогенных микроорганизмов имеют большое практическое значение для получения вакцинных штаммов, т.е. таких авирулентных микробных культур, из которых получают живые вакцины для специфической профилактики инфекционных заболеваний.

Повышение вирулентности достигается путем культивирования бактерий in vitro в оптимальных условиях или при многократных пассажах маловирулентной культуры через организм чувствительного лабораторного животного. В данном случае также имеет место селекция вирулентных особей, содержащихся в гетерогенной бактериальной популяции, что в конечном итоге может привести к повышению ее вирулентности.

Генотипические изменения патогенных микроорганизмов имеют место при мутациях, рекомбинациях, а также миграции внехромосомных факторов наследственности (Is-элементы, транспозоны, плазмиды), контролирующих вирулентность и токсинообразование.

РЕГУЛЯЦИЯ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ

Генетический контроль токсинообразования осуществляется хромосомными генами или разнообразными плазмидами: F, R, Col и др., содержащими tox-транспозоны, а также конвертирующими бактериофагами.

Хромосомные tox-гены контролируют образование холерогена, эксфолиатина золотистого стафилококка, энтеротоксина Clostridium perfringens и др. В составе хромосомы лизогенных культур (лизогенными культурами являются такие культуры, которые обладают способностью продуцировать зрелые частицы фага без воздействия на них фагом извне), несущих профаг, обнаружены tox-гены, контролирующие образование дифтерийного гистотоксина, скарлатинозного эритрогенного токсина, ботулинического нейротоксина.

В некоторых плазмидах, находящихся в автономном, независимом от хромосомы состоянии, содержатся toe-гены, ответственные за образование термолабильного энтеротоксина кишечной палочки и других токсинов. Многие tox-плазмиды контролируют образование не самих токсинов, а протоксинов, требующих для своей активации дополнительного компонента. Этим активирующим компонентом являются протеазы, образование которых находится под контролем хромосомных генов. Протеазы участвуют в активации многих протоксинов, например дифтерийного гистотоксина, ботулинического нейротоксина и др. Таким образом, осуществляется совместный контроль плазмидными и хромосомными генами за образованием функционально активных токсинов.

СИСТЕМЫ СЕКРЕЦИИ БАКТЕРИЙ

Способность к секреции белков является важнейшей для патогенных бактерий, поскольку при развитии инфекционного процесса многие белки должны располагаться на внешней поверхности бактериальной клетки, либо секретироваться во внешнюю среду. У грамотрицательных бактерий такие белки проходят через две мембраны: внутреннюю, которая окружает цитоплазму, и внешнюю оболочку, которая является барьером между клеткой и окружающей средой. Между ними располагается периплазматическое пространство, через которое проходит общий путь секреции белков. У многих патогенных грамположительных бактерий были также обнаружены механизмы транспортировки эффекторных молекул непосредственно из цитоплазмы к клеточной поверхности.

Впоследствии способы секреции белка у бактерий были разделены на группы, внутри которых процесс секреции идентичен или очень схож. В настоящее время у грамположительных бактерий обнаружена высококонсервативная система III типа, а у грамотрицательных - 5 систем секреции белков-эффекторов (I, II, III, IV, V).

Секреторные системы I, II, III, IV типов.

Первый тип секреторной системы:Первая секреторная система (ПТСС) состоит из трех компонентов: белка-порина в наружной мембране, белка слияния мембран (MFP - membrane fusion protein), АТФ-связывающей кассеты в цитоплазматической мембране (АВС). Белки ПТСС секретируются во внешнюю среду через канал, насквозь пронизывающий оболочки клетки, и потому они не попадают в периплазматическое пространство и не образуют периплазматический интермедиат.

Секретируемая молекула подходит к АТФ-связывающей кассете (АВС) в цитоплазматической мембране, и в ответ на это белок слияния мембран MFP соединяет АТФ-связывающую кассету и белок-порин наружной мембраны, что приводит к образованию непрерывного канал, диссоциирующего только после прекращения секреции. Взаимодействие 3-х компонентов канала осуществляется без участия АТФ, но прохождение белка-эффектора по каналу требует затрат энергии.

Посредством этой системы E. coli секретирует -гемолизин (Hly A), Erwinia spp. - металлопротеазу, Pasteurella haemolytica - лейкотоксин, Bordetella pertussis - аденилатциклазу.

Второй тип секреторной системы:Секреция белков с помощью второго типа секреторной системы (ВТСС) осуществляется в две стадии: сначала белок через цитоплазматическую мембрану попадает в периплазматическое пространство, и только из него через наружную мембрану транспортируется во внешнюю среду. Все белки, секретируемые ВТСС имеют сигнальный пептид на N-конце. На генетическом и структурном уровне компоненты второй секреторной системы проявляют сходство с фимбриями IV типа.

Располагающийся в цитоплазматической мембране канал ВТСС, состоит из АТФ-азы -- sec A, сигнальной пептидазы и нескольких белков Sec D, Sec E, Sec F, Sec G, Sec Y. Цитоплазматический шаперон Sec В транспортирует секретируемый белок к этому каналу. Сигнальная пептидаза отщепляет сигнальную последовательность в секретируемом белке, Sec A расщепляет АТФ, благодаря чему белок поступает в периплазматическое пространство, где под действием некоторых шаперонов претерпевает конформационные перестройки, необходимые для транспорта через наружную мембрану.

Транспорт через наружную мембрану требует взаимодействия 12-16 дополнительных белков: мономеры протеина D, или секретина, полимеризуются с образованием кольцевидного канала, который стабилизируется липопротеином S. С помощью белка Е (киназы) происходит транслокация протеинов G-K и сборка из них поверхностных пилеподобных структур, псевдопилей, сходных с фимбриями IV типа. Протеины G-K имеют N-концевые повторы, которые отщепляются протеином О или препилиновой пептидазой.

Посредством ВТСС K. oxytoca секретирует разрушающий крахмал протеин (Pul A,), V. cholerae - холеротоксин, P. aeruginosa - экзотоксин А, другие микроорганизмы - белки, разрушающие клеточные стенки

Третий тип секреторной системы: Отличие третьего типа секреторной системы (ТТСС) состоит в следующем: 1) она доставляет секретируемые белки прямо в клетку-мишень и потому ее называют инжектосомой - “injectosome”; 2) активация секреции происходит только при соприкосновении бактерии с клеткой-мишенью, и потому ТТСС относят к контактной секреции (описаны исключения).

Секреция белков-эффекторов происходит через шприцеподобную структуру, состоящую из 20 различных по структуре белков. При контакте с клеткой-мишенью белки полимеризиуются и образуют канал, пронизывающий насквозь внутреннюю и наружную мембраны, а на поверхности формируют длинную пилеподобную структуру. Шприцеподобный канал в области наружной мембраны стабилизируется кольцеподобной структурой с большой центральной порой. Когда инжектосома сформирована, секретируемый белок с сигнальным пептидом (20 аминокислот) на N-конце связывается с цитоплазматическим шапероном, транспортируется по каналу ТТСС и впрыскивается в клетку-мишень.

Кодирующие ТТСС гены способны к одновременной горизонтальной внутривидовой и межвидовой передаче. Посредством ТТСС Yersinia pestis, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Escherichia coli, Chlamydia trachomatis секретируют белки, играющие ведущую роль в патогенезе вызываемых ими заболеваний.

Четвертый тип секреторной системы: Четвертый тип секреторной системы (ЧТСС) отвечает за перенос вирулентной ДНК и за секрецию факторов патогенности, проявляет сходство с системой конъюгации бактерий и эволюционно произошел из нее.

ЧТСС B. pertussis. Пертуссин относится к семейству А-В токсинов (состоят из двух субъединиц А и В) и секретируется во внешнюю среду в готовом виде в две стадии: 1) 5 субъединиц токсина S 1, S 2, S3, S4, S5 по отдельности секретируются через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство, где из S 2, S3, S4, S5 собирается субъединица В, а S1 (субъединица А) фиксируется на внутренней поверхности наружной мембраны; 2) субъединица В присоединяется к фиксированной субъединице А, после чего собирается Pt1-транспортная система и транслоцирует зрелый токсин во внешнюю среду. ЧТСС A. tumefaciens имеет более сложное строение.

Посредством четвертой секреторной системы B. pertussis секретирует пертуссин (Pt1), Legionella pneumophila - Dot/Icm. Эта система секреции описана у Brucella suis, Bartonella henselae (болезнь кошачьих царапин), Helicobacter pylori.

Пятый тип секреторной системы: Пятый тип секреторной системы (ССПТ) устроен наиболее просто и включает белки, секретируемые автотранспортным механизмом (Va). Недавно описаны двухкомпонентная Vb секреторная и малоизученная Vc.

Va секреторная система. Секретируемые белки обладают всем необходимым для транспорта и потому получили название - автотранспортеров. Автотранспортеры состоят из трех доменов: 1) сигнальной последовательности на N-конце, которая инициирует транспорт через цитоплазматическую мембрану; 2) транслоцируемого эффектора, или -домена; 3) автотранспортной субъединицы (синонимы: С-домен, -домен, хелпер), которая необходима для секреции через наружную мембрану. Сигнальная последовательность транспортирует эффектор к цитоплазматической мембране бактерии, откуда белок экспортируется в периплазматическое пространство, далее при помощи автотранспортного домена эффектор транспортируется через наружную мембрану, меняет конформацию и высвобождается от хелпера аутопротеолизом. В результате образуется стабильный белок. Таким образом, белок-эффектор начинает секретироваться в виде предшественника и в процесс транспорта созревает. Предшественник протеазы IgA1 гонококков имеет массу 169 кДа, а зрелая протеаза - массу 106 кДа.

Посредством V секреторной системы секретируется протеаза IgA1 гонококков, AlpA - H. pylori, SphB1 - B. pertussis, AspA/NalP - N. meningitidis.

Схема типов систем секреции бактерий. Для осуществления секреции все системы используют энергию АТФ-гидролиза. I и III типы секретируют белки через внутреннюю мембрану и клеточную оболочку бактерии за одну стадию; секретируемые белки не делают промежуточной остановки в периплазматическом пространстве, как это наблюдается при II типе секреции.

Системы I и III типа сходны еще тем, что они не удаляют какой-то части секретируемого белка. В противоположность этому, N-концы белков, секретируемых по второму пути, утрачиваются ими при прохождении периплазматического пространства. Первый тип систем секреции представлен значительно меньшим количеством компонентов, чем третий (на рисунке это показано различающимися по форме и размеру белками). Третий тип секреции зависит от контакта с поверхностью эукариотической клетки



Сравнительная характеристика наиболее изученных секреторных систем I,II,III типов

Превый тип секреторной системы	Второй тип секреторной системы	Третий тип секреторной системы
Использует энергию АТФ-гидролазы	Использует энергию АТФ-гидролазы	Использует энергию АТФ-гидролазы
Белковый канал пронизывает насквозь, без разрывов, цитоплазматическую мембрану, периплазматическое пространство и клеточную стенку	Белковый канал прерывается в периплазматическом пространстве: одна часть пронизывает цитоплазматическую мембрану, вторая - наружную мембрану	Аналогичен первому типу секреторной системе
Состоит из нескольких десятков компонентов, которые в отличие от II и III секреторных систем имеют более крупные размеры	Состоит из большого количества белков (>20), которые сходны с третьей секреторной системой по порядку расположения и сборки белков	Аналогичен второму типу секреторной системы
Секретирует белки-эффекторы, не модифицируемые в процессе транспорта	В процессе транспорта секретируемый протеин модифицируется с отщеплением N- сигнального пептида	Аналогичен первой секреторной системе
E.coli секретирует -гемолизин, B. pertussis - аденилатциклазу, Pasteurella haemolytica - лейкоцидин, P. aeruginosa и Erwinia spp. - протеазы	Секретирует ферменты-токсины: Erwinia spp. - целлюлазу, P. aeruginosa - эластазу, экзотоксин А, фосфолипазу С, амилазу, протеазу	Shigella spp. секретирует белки Ipa B, IpaC, IpgD, IpaA, приводящие к перестройке цитоскелета и эндоцитозу шигелл в клетку-мишень. Yersinia pestis секретируют YopB, YopH, препятствующие слиянию фагосом и лизосом, способствующие ускользанию от фагоцитоза и быстрому развитию септицемии



Список использованной литературы

1. «Медицинская микробиология, вирусология и иммунология» под ре. А.А. Воробьёва

2. «Микроорганизмы, токсины и эпидемии», Супотницкий М.В.

3. «Pathogenicity islands: a molecular toolbox for bacterial virulence», Ohad Gal-Mor and B. Brett Finlay

4. «Pathogenicity Islands in Bacterial Pathogenesis» Herbert Schmidt and Michael Hensel

Размещено на Allbest.ru