Активність ферментів трансмембранного транспорту та вплив на них регідратаційної терапії у хворих на холеру

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

Академія медичних наук України

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського

СКРИПНИК ЛЮДМИЛА МИХАЙЛІВНА

УДК 616.932 - 092 - 08: 577.334

АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ ТРАНСМЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТУ ТА ВПЛИВ НА НИХ РЕГІДРАТАЦІЙНОЇ ТЕРАПІЇ У ХВОРИХ НА ХОЛЕРУ

14.01.13 - інфекційні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеню кандидата медичних наук

Київ - 2001



Дисертація є рукописом

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Нікітін Євген Васильович,

завідувач кафедри інфекційних хвороб з епідеміологією Одеського державного Медичного університету МОЗ України

Офіційні опоненти:

Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Андрейчин Михайло Антонович, завідувач кафедри інфекційних хвороб Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського;

Доктор медичних наук, старший науковий співробітник Матяш Віктор Іванович, головний лікар інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Провідна установа: Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького, місто Львів.

Захист відбудеться “24” травня 2001 року об 11 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради в інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського Академії медичних наук України (252150, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського.

Автореферат розісланий 21 квітня 2001р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.м.н. Ж.Б. Клименко



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Починаючи з другої половини Х1Х століття поширення холери помітно зросло. Крім холери, що викликається класичним вібріоном, та локалізується в природних її осередках, важливу роль в епідемічному поширенні хвороби в останні десятиліття набув холерний вібріон Ель-Тор (Онищенко Г.Г. і співавт., 1993; Марамович А.С. і співавт., 1995; Савельєва В.Н. і співавт., 1995).

З цим збудником пов'язане виникнення 7-ої пандемії холери, захворюваність на яку поширилася на більшість країн Земної кулі, включаючи й Україну. У 1970 року епідемічні спалахи холери, викликаної вібріоном Ель-Тор, зареєстровані в Одеській та Херсонській областях. В наступні роки в Південному регіоні України реєструються окремі випадки даного захворювання. Поряд із хворими відзначена досить велика кількість носіїв вібріона, що дозволило говорити про здатність вібріона Ель-Тор утворювати вторинні постійні епідемічні осередки. Такий погляд не безпідставний і підтверджений новим підйомом захворюваності на холеру в 1991 році в Одеській, Миколаївській та Херсонській областях. Найбільша кількість випадків холери в цьому регіоні спостерігалася в 1994-1995 роках. Всього по Україні в зазначений період зареєстровано 1400 хворих на холеру (Андрейчин М.А., 1994; Алексєєнко В.В., Лисенко З.А., 1996).

Істотну роль у циркуляції збудника Ель-Тор на півдні України відіграє погане забезпечення населення питною водою, постійне забруднення водоймів стічними та каналізаційними водами. Екологічні зрушення внаслідок господарської діяльності створюють сприятливі умови для тривалого виживання збудника в довкіллі. Таким чином, прогноз стосовно холери в регіоні на сьогодні залишається несприятливим (Могилевський Л.Я., 1997).

На даний час досить глибоко вивчені етіологія, епідеміологія, особливості клінічного перебігу холери, що викликається як класичним вібріоном, так і вібріоном Ель-Тор. Відомі основні механізми, які викликають гіперсекрецію рідини в просвіт кишечника, детально описано механізм розвитку гіповолемічного шоку (Малєєв В.В., 1973; Хотько Н.І., 1987; Barua D. et аl., 1992; Barkla D.H. et аl., 1992).

Однак, глибші механізми трансмембранного транспорту у хворих на холеру залишаються нерозкритими. Не вивчене енергетичне забезпечення трансмембранного транспорту іонів, не розкрита роль Na+-, K+- та Ca2+-АТФ-аз у цих процесах, не вивчене значення циклічних амінофосфатів для розвитку зневоднення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами: дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Одеського державного медичного університету, затвердженим Міністерством ОЗ України, та є фрагментом наукової праці кафедри інфекційних хвороб на тему: ”Стан ПОЛ/АОС хворих на вірусні гепатити, холеру та корекція їх. № держ. реєстрації 0199 У 002024”.

Мета роботи. Поглибити знання патогенезу холери шляхом розкриття особливостей трансмембранного транспорту у хворих на холеру, що даст змогу удосконалити патогенетичну терапію.

Завдання. Відповідно до поставленої мети визначені наступні завдання:

Вивчити вміст ДК и МДА, активність ферментів глутатіонової системи і концентрацію тіолових сполук в єритроцитах хворих на холеру в залежності від періода та тяжкості хвороби.

Вивчити активність Na+-, K+- та Ca2+-АТФ-аз хворих на холеру залежно від ступеня зневоднення.

Визначити вміст аденілових, гуанілових та піридинових нуклеотидів в еритроцитах хворих на холеру з різним ступенем зневоднення.

Визначити вміст цАМФ та цГМФ в еритроцитах хворих на холеру з різним ступенем зневоднення.

Визначити ефективність впливу регідратаційних розчинів на зазначені метаболічні процеси та перебіг хвороби.

Об'єкт дослідження - хворі на холеру Ель-Тор

Предмет дослідження. Ферменти трансмембранного транспорту, дієнові кон'юганти, малоновий діальдегід, піридинові нуклеотиди, відновлені форми глутатіону, тіолові сполуки, супероксиддисмутаза, каталаза, гуанілові нуклеотиди, аденілові нуклеотиди, аденілатциклаза, гуанілатциклаза, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, глутатіонтрансфераза.

Методи досліджень. Біохімічні методи з вирокистанням спектрофотометрії та іонообмінної хроматографії.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в комплексі вивчені активність АТФ-аз, стан компонентів енергетичного обміну (АМФ, АДФ, АТФ), показане значення циклічних нуклеотидів у процесах втрати іонів та води у хворих на холеру з різним ступенем зневоднення.

Вперше встановлено, що у хворих на холеру зі зневодненням активація процесів ПОЛ супроводжується збільшенням вмісту ДК і МДА, зниженням активності ферментативної антиоксидантної системи еритроцитів, зменшенням концентрації відновленого глутатіону та сульфгідрильних груп і накопиченням дисульфідних груп.

Зроблен висновок, що процеси зневоднення та ацидозу у хворих на холеру призводять до разбалансування функції глутатіонової протиперекисної системи.

Вперше вивчено вплив стандартної регідратаційної терапії на активність метаболічних процесів у хворих на холеру. Доведена відсутність суттєвого впливу полііонних розчинів на активність ферментів трансмембранного транспорту та стан глутатіонової редокс-системи .

Доведено, що внаслідок дисбаланса в прооксидантно-антиоксидантному статусі еритроцитів активується аденілатциклазна і пригнічується гуанілатциклазна системи.

Практичне значення отриманих результатів. Проведені дослідження розкрили нові ланки патогенезу холери, виявили значні порушення у функціонуванні систем, які беруть участь у трансмембранному транспорті іонів і води через мембрану еритроцитів. Доведено, що ці порушення стійкі і залежать від ступеню зневоднення та періоду хвороби. Регідратаційні розчини, що вводили хворим на холеру не справляли помітного впливу на стан та функцію досліджуваних систем. Результати роботи можуть бути вихідними для подальшого удосконалення патогенетичної терапії холери.

Запропоновано визначати вміст відновленого глутатіону та сульфгідрильних груп в крові хворих для оцінки тяжкості метаболічних порушень при зневодненні.

Впровадження результатів дослідження. Отримані результати роботи впроваджені в учбовий процес Тернопільської державної медичної академії імені І.Я. Горбачевського та Одеського державного медичного університету, а також в Одеську міську клінічну інфекційну лікарню.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації розроблена програма та методика наукових досліджень. Під час спалахів холери в м.Миколаїв та в Одеській області, працюючи в епідемічних осередках, здобувач самостійно збирала матеріал, виконала біохімічні дослідження, провела статистичну обробку та аналіз отриманих даних, здійснила аналіз літератури, сформульовала основні положення та висновки роботи. Лабораторні дослідження проводились на кафедрі інфекційних хвороб і кафедрі біохімії ОДМУ. Щиро дякуємо за надану можливість і консультативну допомогу в проведенні досліджень професору Напханюку Володимиру Клеонтійовичу.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації, положення та висновки обговорювалися на наукових конференціях Одеського державного медичного університет, науково-практичних конференціях обласного товариства інфекціоністів (м.Одеса, 1993, 1998 р.р.). Зроблено доповідь з даної теми на 1У з'їзді інфекціоністів України (м.Вінниця, 1993 р.) та на науково-практичній конференції у Львові 2000 року.

Публікації. За темою дисертації надруковано 9 робіт, із них 4 - в наукових журналах та виданнях, зареєстрованих ВАК.

Об'єм та структура дисертації. Матеріали дисертації викладені на 135 сторінках, з них власне текст займає 115 сторінок. Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи досліджень”, двох розділів із викладом отриманих результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних джерел. Цифрові дані досліджень викладені в 11 таблицях та на 9 малюнках. Список використаної літератури складається з 233 джерел, серед них вітчизняних - 118, зарубіжних - 115.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

холера еритроцит зневоднення хворий

Матеріали та методи досліджень. Ми спостерігали 90 хворих з бактеріологічно підтвердженим діагнозом холери. Серед них жінок - 36, чоловіків - 54. З метою отримання стабільних результатів до розробки залучені лише особи молодого та середнього віку, які лікувалися в холерних госпіталях міст Вілково, Кілії та Миколаєва. Всі хворі, які перебували під спостереженням, залежно від ступеня зневоднення розділені на три групи. Тяжкість хвороби визначали за ступенем зневоднення. Для цього використовували класифікацію, запропоновану ВООЗ, яка передбачає 3 ступені зневоднення: перший ступінь - втрата маси тіла від 1% до 5%, другий - 6-9%, третій - 10% і більше. У хворих з першим ступенем зневоднення їх загальний стан оцінювався як легкий, з другим ступенем - середньої тяжкості, з третім - як тяжкий. Поряд із втратою маси тіла під час визначення тяжкості хвороби враховувалися також основні її клінічні прояви, такі як: загальний вигляд хворого, ціаноз, тургор тканин, судомний синдром, вологість слизових оболонок, частота пульсу, величина артеріального тиску, частота дихальних рухів, частота випорожнень і діурез.

Всього з легким перебігом хвороби (перший ступінь зневоднення) обстежено 30 хворих, середньотяжким - 30 хворих і тяжким (третій ступінь зневоднення) - 30.

При цьому враховували, що головною причиною метаболічних порушень в організмі хворих є процеси зневоднення із втратою основних електролітів і порушенням гемодинаміки, що призводить до зрушень у кислотно-лужному балансі та метаболізмі.

Так як механізми метаболічних порушень під час холери лише частково вивчені і лише в експерименті, а в клініці цим питанням приділялося вкрай мало уваги, саме їх вивченню і присвячена наша робота.

Методи досліджень. Кров для досліджень брали з вени до оброблених гепарином градуйованих центрифужних пробірок об'ємом 3,0 мл і центрифугували (3000 об./хв.) протягом 10 хв за температури 0-+4оС. Плазму видаляли, отриманий осад формених елементів тричі промивали в десятикратному об'ємі фізіологічного розчину, усували лейкоцити та інші клітини крові. Відмиті еритроцити піддавали гемолізу і отриманий гемолізат використовували для проведення біохімічних досліджень. Для визначення вмісту субстратів кров об'ємом 3,0 мл збирали до градуйованих пробірок, які містили охолоджену 0,6N хлорну кислоту, у співвідношенні: кров - кислота 1:1.

Активність супероксиддисмутази визначали за здатністю ферменту пригнічувати реакцію відновлення нітросинього тетрозолу супероксиданіон-радикалом (R.Fried, 1975). Швидкість утворення супероксиданіонрадикала оцінювали по швидкості відновлення нітросинього тетрозолу в середовищі, що містить NADН. Відновлення нітросинього тетрозолу вивчали по зміні оптичної щільності при довжині хвилі 540 нм. Вимір оптичної щільності проводили через 1, 3, 5 хв. на СФ-46 проти контрольної проби, що не містить NADН. Активність виражали в умовних одиницях оптичної щільності на 1 мл еритроцитарної маси.

Про каталазну активність судили по швидкості руйнування перекису водню в нмоль за 1 хв. при довжині хвилі 240 нм (M. Ensinger, 1976). Активність ферменту виражали в міжнародних одиницях (МО) по кількості зруйнованого субстрату за хвилину і відносили до 1 мл еритроцитарної маси.

Активність глутатіонредуктази визначали методом, описаним А.М. Герасимовим і співавт. (1976), і виражали в нмоль/хв. NADРН на 1 мл еритроцитарної маси.

Активність глутатіонпероксидази (ГП) до перекису водню оцінювали за методом D.E. Palgia, W.N. Valentine (1967). Активність ферменту виражали в нмоль/хв NADРН на 1 мл еритроцитарної маси.

Визначення активності глутатіонтрансферази (ГТ) до дінітробензолу проводили за допомогою методу W.H. Habig і співавторів (1974). Активність ферменту виражали в нмоль кон'югованого субстрату за хвилину на 1 мл еритроцитарної маси.

Вміст відновленого глутатіону в тканинах визначали за методом М.І. Прохорової (1982). Метод грунтується на тому, що глутатіон, реагуючи з надлишком алоксану, утворює сполуку, яка має максимум поглинання при 305 нм. Вміст відновленого глутатіону в еритроцитах визначали за допомогою реактиву Еллмана методом Bentler (1969), і кількість його виражали в нмоль на 1 мл еритроцитарної маси.

Визначення вмісту і ступеня відновлення піридинових нуклеотидів здійснювали за методом Спайтера і співавторів у модифікації В.М. Телепньової (1982). Принцип методу полягає в роздільній екстракції окислених і відновлених форм піридинових нуклеотидів й використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної реакції для визначення кількості NADPH. Концентрацію його виражали в нмоль на 1 мл еритроцитарної маси.

Вміст аденілових і гуанілових нуклеотидів визначали методом іонообмінної хроматографії. Нуклеотиди екстрагували з еритроцитів трихлороцтовою кислотою і розділяли методом іонообмінної хроматографії на ектеола-целюлозі ЕТ-30 у CL-формі. Вміст визначали за поглинанням в ультрафіолеті на СФ-46 (у нмоль на 1 мл еритроцитів).

Активність Na+ -, K+-АТФ-ази визначали за різницею в активності за відсутності уабаїну та з його додаванням. Внаслідок гідролізу АТФ під впливом АТФ-ази накопичується неорганічний фосфат, який переводиться молібденокислим амонієм до комплексної сполуки, що відновлюється аскорбіновою кислотою до метиленової сині. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту неорганічного фосфату. Розмірність концентрації - нмоль на 1 мл еритроцитів.

Активність Са2+-АТФ-ази визначали за зростанням неорганічного фосфату і виражали в нмоль на 1 мл еритроцитів. В еритроцитах крові визначали активність аденілатциклази та гуанілатциклази й виражали її в нмоль на 1 мл еритроцитів.

Вміст сульфгідрильних груп визначали методом, що грунтується на використанні реагенту Еллмана (1975) -5,51-дітіобіс-2-нітробензойної кислоти, яка кількісним чином взаємодіє зі сульфгідрильними групами, утворюючи змішаний дисульфід і звільнюючи аніон 2-нітро-51-меркаптобензойної кислоти, яка поглинається при довжині хвилі 412 нм. Кількість сульфгідрильних груп розраховували з урахуванням коефіцієнта молярної екстинції рівного при 412 нм-13100 М1 см1 і виражали в нмоль на 1 г тканини.

Рівень циклічних нуклеотидів цАМФ і цГМФ визначали за допомогою наборів фірми Amercham (Великобританія). Розмірність концентрації - нмоль на 1 мл еритроцитарної маси.

Вміст дієнових кон'югатів визначали за допомогою метода І.Д. Стальної (1971). Кількість їх розраховували у нмоль на 1 мл еритроцитарної маси, виходячи з величини молярного коефіцієнта екстинції при 233 нм для спряжених дієнів поліненасичених вищих жирних кислот, що дорівнює 2,2х105 см-1 х М-1.

Малоновий диальдегід визначали за допомогою методу І.Д. Стальної і Т.Г. Гарішвілі (1971). Принцип методу полягає в тому, що при високій температурі в кислому середовищі малоновий диальдегід реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою, утворюючи забарвлений триметиловий комплекс з максимумом поглинання при 532 нм. Кількість малонового диальдегіду розраховували з урахуванням молярного коефіцієнта екстинції, рівного при 532 нм 1,56х105 см-1 хМ-1, і виражали в нмоль на 1 мл еритроцитарної маси.

Вірогідність отриманих результатів визначали, використовуючи критерій Ст'юдента- Фішера (1975). Відхилення вважались вірогідними при Р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Враховуючи той факт, що в експерименті останнім часом велика увага приділяється вивченню редокс-системи та мембранного апарата клітин, першим етапом нашої роботи було визначення взаємовідношень функціонального стану ПОЛ/АОС при розвитку холери, так як основною структурою клітинних мембран є фосфоліпіди, які інтенсивно залучаються до процесів вільнорадикального окислення. Проведені дослідження активності процесів ПОЛ показали, що їхні зміни за своєю спрямованістю та глибиною носять неоднозначний характер. Ступінь виявлених змін у процесах ПОЛ залежали від тяжкості та періоду хвороби (мал. 1).

Зазвичай під час надходження хворих до холерного госпіталю знаходили підвищення вмісту як початкових, так і проміжних продуктів ПОЛ. Їх кількість знаходилась в прямій залежності від ступеня зневоднення. Привертав увагу той факт, що здійснені регідратаційні заходи в перші дні хвороби істотно не впливали на інтенсивність процесів ПОЛ в еритроцитах хворих. Характерним і важливим фактом є те, що інтенсивність накопичування початкових продуктів ПОЛ (ДК) після регідратаційних заходів у хворих на холеру за всіх ступенів зневоднення значно перевищувала кількість проміжних продуктів (МДА). Таке явище є істотним доказом нездатності антирадикальних механізмів захисту мембранних структур. З іншого боку, це є доказом того, що через таку дестабілізацію порушується фізіологічна рівновага редокс-потенціалу клітинної мембрани еритроцита внаслідок накопичування недоокислених і надлишку окислених метаболітів.

За нашими даними, відновлення фізіологічного стану ПОЛ у хворих на холеру - процес тривалий і не співпадає з одужанням, про що свідчать дані ДК та МДА під час виписування пацієнтів із стаціонару.

Враховуючи, що процеси ПОЛ в організмі перебувають під жорстким регуляторним контролем багаторівневої антиоксидантної системи, нами були проведені дослідження функціонального стану її ферментативної ланки. Встановлено, що глибина змін, а також їхня спрямованість залежали від періоду та тяжкості захворювання і від виду ферменту, що досліджується (табл.1).

У хворих з І ступенем зневоднення активність СОД у всі строки дослідження була суттєво вища за рівень контрольних показників. Максимальні зміни рівня ферменту виявлені після завершення регідратаційних заходів (третій день лікування). Активність каталази в цій групі пацієнтів на всіх етапах дослідження була статистично достовірно пригнічена. Цей факт, на наш погляд, є доказом того, що функціональна адаптивна ємність СОД є досить великою. З іншого боку, внаслідок високої супероксиддисмутазної активності утворюється велика кількість активних кисневих сполук, які, як відомо, пригнічують активність каталази. Це явище, як правило, супроводиться збільшенням вмісту органічних і неорганічних перекисів.

Дещо інша картина в функціональних взаємозв'язках між СОД та каталазою спостерігається у хворих з І та ІІІ ступенями зневоднення. На всіх етапах досліджень в еритроцитах крові хворих з ІІІ ступенем зневоднення під час госпіталізації відзначається пригнічення активності СОД. Це зумовлено, очевидно, значним накопичуванням кисню, що генерується клітинами внаслідок бурхливого холерного процесу, що призводить, як відомо, до інгібування функціональної активності СОД.

Важливе значення в процесах багатоступінчастого захисту еритроцитів від ушкоджувальної дії надлишкових кисневих інтермедіантів відіграє також так звана глутатіонова редокс-система, до якої входять ферменти глутатіонового циклу (ГР, ГП, ГТ), а також окислений та відновлений глутатіон. Виходячи з цього, для уточнення стану цієї головної ланки захисту еритроцитів від надлишку перекисів, нами проведені дослідження її функціонування у хворих на холеру із врахуванням ступеня зневоднення організму хворих. Встановлено (табл.1), що активність ГР у всіх хворих різко пригнічена. Виявлені зміни залежали від ступеня зневоднення. Однак, необхідно зазначити, що в групі хворих з І ступенем зневоднення активність ферменту перед виписуванням відновлювалася практично до рівня фізіологічних показників, тоді як за ІІ та ІІІ ступенів зневоднення вона залишалася на низькому рівні.

Активність ГП в еритроцитах крові хворих на холеру з різним ступенем зневоднення також була різко пригнічена. Таке пригнічення, очевидно, зумовлене недостатністю утворення відновленого глутатіону, який є донором SH-груп для забезпечення реакцій, які каталізуються ГП. Підтвердженням цієї точки зору є динаміка змін активності ГП у хворих на холеру з різним ступенем зневоднення. Найбільшим і стійким змінам активність ферменту піддавалась у хворих з ІІІ ступенем зневоднення. Можливо, що таке явище зумовлене надмірним накопиченням в організмі хворих і, зокрема в мембранах еритроцитів, недоокислених органічних сполук, особливо фосфоліпідів, які в надлишковій кількості можуть виявляти субстратне пригнічення ферменту.

Крім того, такі продукти здатні різко міняти електричний потенціал білкової молекули ферменту, викликаючи конформаційні зміни його структури. Підтвердженням цього припущення є динаміка змін відновленого глутатіону, з якої видно, що в перших двох групах хворих на холеру, у яких зневоднення менш виразне, спостерігаються відносно незначні зміни концентрації GSH, які супроводжуються меншими змінами активності ГП.

З іншого боку, накопичення киснеактивних токсичних продуктів може бути зумовлене різким пригніченням активності одного з провідних ферментів детоксикаційного характеру глутатіонової системи - ГТ. Відомо, що ГТ забезпечує знешкодження токсичних продуктів органічної природи шляхом приєднання киснеактивних інтермедіантів до водню GSH, який окислюється в цій реакції.

У хворих на холеру спостерігались значні зміни вмісту відновленого глутатіону в єритроцитах. Під час госпіталізації хворих з І та ІІ ступенем зневоднення вміст відновленого глутатіону був нижчим за фізіологічні показники. Після регідратації тенденція до зниження відновленого глутатіону в їх еритроцитах зберігалась, і лише в період ранньої реконвалесценції вміст цієї сполуки підвищувався.. У групі хворих з ІІІ ступенем зневоднення зниження відновленого глутатіону в еритроцитах було більш виражене.

З вище зазначеного слід зробити висновок, що процеси зневоднення та ацидозу призводять до розбалансування функції глутатіонової протиперекисної системи. Її нормалізація настає значно пізніше за клінічне одужання.

Такі глибокі зміни функціонального стану глутатіонової протиперекисної системи є свідченням того, що вона фактично заблокована при ІІ і особливо ІІІ ступені зневоднення організму.

Глутатіонова редокс-система є визначальною в резистентності мембран еритроцитів. Не виникає сумнівів, що від глибини її змін залежить і структурно-функціональна організація мембран еритроцитів хворих.

Характеристика змін редокс-системи в динаміці зневоднення та холерної інтоксикації була б неповною без результатів дослідження стану тіол-дісульфідного обміну в еритроцитах крові хворих. Встановлено, що у хворих з різним ступенем зневоднення відбуваються істотні та неоднозначні за глибиною й спрямованістю зміни вмісту сульфгідрильних і дісульфідних груп, які перебувають в повній зележності від ступеня зневоднення. Особливість змін полягає в різному вмісті сульфгідрильних груп і накопичуванні їх окислених форм. Зміни співвідношення між сульфгідрильними та дісульфідними групами призводять до зниження редокс-потенціалу мембран та їхньої резистентності до дії несприятливих факторів. Глибші зміни редокс-потенціалу супроводжуються нижчою резистентністю мембрани. Викладене добре узгоджується з динамікою перебігу холери: що вищий ступінь зневоднення, тим нижчий редокс-потенціал. Можна припустити, що резистентність організму до дії холерного ентеротоксину прямо пов'язана з ендогенним пулом сульфгідрильних груп в патологічному процесі, що і визначає ймовірність розвитку того чи іншого ступеня зневоднення.

Як відомо, багато ферментів у своїх молекулах містять сульфгідрильні групи. Зміна їх ферментативної активності зумовлена деструкцією останніх, що призводить до втрати здатності активним центром зв'язувати кофермент. Не виключається, що зниження концентрації сульфгідрильних груп у хворих на холеру зумовлене інтенсифікацією процесів ПОЛ і накопичуванням їх проміжних та кінцевих продуктів.

Всі вищезазначені зміни у хворих на холеру призводять до деструкції структури мембран, змін їх проникності та сприяють порушенню трансмембранного транспорту.

Підтвердженням глибоких змін у мембрані еритроцита та його стійкості є отримані дані про вміст окислених і відновлених форм NADP. Як свідчать проведені нами дослідження, зневоднення та втрата електролітів у хворих на холеру призводять до зниження вмісту NADPH та накопичування NADP уже за 1 ступеня зневоднення. У хворих з ІІ та ІІІ ступенем зневодненн відмічене зниження вмісту як відновлених, так і окислених форм піридинових нуклеотидів. Важливим, на наш погляд, є зменшення вмісту NADPH, так як його кількість вказує на стан ендогенного пулу піридинових нуклеотидів. У зв'язку з тим, що динаміка вмісту NADPH співпадає з тяжкістю перебігу хвороби та ступенем зневоднення, ендогенна інтоксикація, що розвивається внаслідок зневоднення, вірогідно, блокує синтез цих сполук на відповідному рівні. Дефіцит окислених форм NADPH у таких випадках, очевидно, також сприяє зниженню їх відновлених форм і редокс-потенціалу загалом, що й призводить до метаболічних порушень та ендогенної інтоксикації.

У світлі викладених суджень важливими, на нашу думку, є отримані результати досліджень активності Na+-, K+- та Ca2+-АТФ-аз. Як свідчать наведені дані (мал.2), зневоднення організму викликає в еритроцитах досить глибокі та стійкі зміни активності ферментів трансмембранного транспорту. У всіх випадках виявлене пригнічення обох ферментів. Ця обставина вказує на різке зниження трансмембранного транспорту іонів Na+, K+ та Ca2+ через еритроцитарну мембрану. Однак, зауважимо, що глибина виявлених змін менш виражена у хворих з І ступенем зневоднення, під час якого спостерігаються незначні водно-електролітні втрати.

Наростання симптоматики зневоднення супроводиться інтенсифікацією пригнічення активності вищезазначених ферментів, найвиразніше у хворих з ІІІ ступенем зневоднення, у яких на час виписування із стаціонару показники були значно нижчі порівняно з контрольною групою.

Таким чином, виявлені зміни є свідченням структурних порушень білкової молекули ферментів внаслідок накопичування у високих концентраціях активних кисневих сполук. Для уточнення механізмів порушення трансмембранного транспорту в еритроцитах хворих на холеру з різними ступенями зневоднення було досліджено вміст макроергічних сполук, які забезпечують трансмембранний транспорт іонів, а також вміст універсальних внутрішньоклітинних регуляторів метаболізму цАМФ і цГМФ (табл.2).

Встановлено, що в динаміці хвороби відбуваються різної спрямованості зміни аденілових нуклеотидів у еритроцитах. При цьому кількість АМФ у хворих з І та ІІ ступенями зневоднення перевищує фізіологічні показники здорових людей, а в осіб з ІІІ ступенем зневоднення - знижується. Остання обставина є свідченням, на наш погляд, посиленого гідролізу АТФ і зниження його ендогенного пулу.

У хворих з І ступенем зневоднення концентрація АДФ перебувала на рівні контрольних показників.В еритроцитах осіб із ІІ та ІІІ ступенями зневоднення вміст цієї сполуки у всі строки хвороби нижчий, ніж у контрольній групі. Особливо глибокі зміни вмісту АДФ в еритроцитах спостерігалися в осіб з ІІІ ступенем зневоднення під час закінчення регідратації. Поряд з цим істотних змін зазнавав також вміст АТФ в еритроцитах залежно від періоду хвороби та ступеня зневоднення.

Таким чином, порушення водно-електролітного балансу та зневоднення супроводяться значними змінами ендогенного пулу аденілових нуклеотидів, що в свою чергу є причиною порушення енергозабезпечення клітини і призводить до зміни транспорту електронів дихальним ланцюгом. Очевидно, що такі глибокі зміни ключових ферментів багатьох метаболічних процесів внаслідок енергетичного дефіциту клітини, який розвивається, негативно відбиваються на трансмембранному транспорті метаболітів та іонів, а також є одним із механізмів ацидозу.

З метою уточнення механізмів порушень метаболізму та визначення ролі їх у патогенезі холери проведені дослідження вмісту гуанілових нуклеотидів в еритроцитах крові хворих залежно від періоду хвороби та ступеня зневоднення (табл.2). Встановлено, що кількість гуанілових нуклеотидів в еритроцитах осіб з І та ІІ ступенями зневоднення у всі строки дослідження вища, ніж у контрольній групі, а у хворих з ІІІ ступенем зневоднення - суттєво нижча.

Вміст гуанілтрифосфату у хворих з різними ступенями зневоднення був нижчий, ніж у здорових осіб. Особливо низький рівень відзначався у пацієнтів з ІІІ ступенем зневоднення в період гострих клінічних проявів хвороби.

Аналіз отриманих даних свідчить, що кількісні та якісні зміни вмісту гуанілових нуклеотидів в еритроцитах залежать від ступеня зневоднення та періоду хвороби. Можна припустити, що одним з механізмів зазначених порушень є зниження їхнього внутрішньоклітинного пулу внаслідок посилення процесів гідролізу надлишкової кількості киснеактивних сполук, які підсилюють процес катаболізму.

І все ж таки, обговорювати особливості обміну циклічних нуклеотидів під час холери не уявляється можливим без вивчення активності ферментів, які беруть участь в їх синтезі . У зв'язку з цим досліджена активність аденілатциклази - ферменту, який каталізує реакцію утворення цАМФ в клітині, та гуанілатциклази, яка бере участь в утворенні цГМФ. Встановлено, що зміни активності цих ферментів мали протилежну спрямованість і фазовий характер. Глибина цих змін і спрямованість визначались ступенями зневоднення. Найменш виразні, як за силою, так і за тривалістю, зміни активності ферментів виявлені в групі хворих на холеру з І ступенем зневоднення, а найяскравіші - у хворих з ІІІ ступенем зневоднення. При цьому активність аденілатциклази посилювалась, а гуанілатциклази - пригнічувалась. Привертав увагу той факт, що зміни активності ферментів за характером і спрямованістю співпадали із зміною вмісту відповідних циклічних нуклеотидів (табл.2).

Регідратаційні розчини, що вводилися хворим на холеру, згідно з отриманими даними, не справляли істотного впливу на стан і функцію досліджуваних метаболічних систем.

Підводячи підсумки проведеного комплексного дослідження, слід вважати, що в організмі хворих на холеру відбуваються каскадні порушення метаболічних процесів. Їх послідовність можна визначити наступним чином: холерний ентеротоксин зв'язується з мембранними білками-рецепторами і одночасно активує вільнорадикальні процеси, внаслідок чого накопичується надлишок продуктів ПОЛ; надмір їх призводить до змін структурно-функціонального стану клітинних мембран, модифікує їх плинність і порушує трансмембранний транспорт. Наслідком зазначених змін є модифікація метаболічних внутрішньоклітинних процесів, підвищення активності аденілатциклази з одночасним пригніченням функції гуанілатциклази, що призводить до виснаження пулу аденілових нуклеотидів, зниження енергозабеспечення активного трансмембранного транспорту іонів, що призводить до викачування натрій-калієвим насосом внутрішньоклітинної рідини та втрати електролітів. В результаті цього розвивається метаболічний ацидоз, що істотним чином впливає на перебіг хвороби.



ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі розв'язана важлива наукова задача: розкриті нові ланки патогенезу холери, які висвітлюють механізми трансмембранного транспорту та їх енергетичне забезпечення.

Активація процесів ПОЛ супроводжується суттєвим збільшенням вмісту їх початкових і проміжних продуктів (ДК і МДА), що, у свою чергу, призводить до зниження активності ферментативної антиоксидантної системи еритроцитів.

Проведені дослідження свідчать, що у хворих на холеру зі зневодненням П-Ш ступеня суттєво знижується концентрація відновленого глутатіону та сульфгідрильних груп. Запропоновано визначати вміст відновленого глутатіону та сульфгідрильних груп для оцінки глибини метаболічних порушень при зневодненні.

Зсунення функціональної рівноваги в системі ПОЛ/АОС, яке супроводжується надмірним накопиченням продуктів ПОЛ та неспроможністю їх утилізації АОС в еритроцитах хворих на холеру з 1 ступенем зневоднення, призводить до зниження вмісту відновлених форм і накопичення окислених форм піридинових нуклеотидів. У хворих з ІІ і ІІІ ступенями зневоднення спостерігається зниження ендогенного пулу обох форм піридинових нуклеотидів. Така перебудова вмісту і співвідношень NADP і NADPH у значній мірі послаблює функціональний стан глутатіонової редокс системи.

Зниження енергозабеспечення, функціональної активності та буферної ємкості ферментативної та неферментативної антиоксидантної системи викликає інактивацію Na+, K+ та Ca2+-АТФ-аз в еритроцитах. Глибина виявлених зрушень співпадає з тяжкістю перебігу хвороби.

Дисбаланс у прооксидантно-антиоксидантному статусі еритроцитів модифікує систему циклічних нуклеотидів, активуючи аденілатциклазну і пригнічуючи гуанілатциклазну системи. Порушення у системі циклічних нуклеотидів знаходиться у прямій залежності від ступеня зневоднення хворих на холеру.

Одержані результати свідчать про стійки порушення в системах, які досліджені. Регідратаційна терапія суттєво не впливала на активність ферментів трансмембранного транспорту та енергетичні системи їх забеспечення, що свідчить про необхідність удосконалення патогенетичної терапії.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ НАУКОВИХ ПРАЦЬ

1. Скрипник Л.М., Никитин Е.В. Нарушение водно-минерального обмена у больных холерой // Врачебное дело.- 1994. - №5-6. - С.163-165.

2. Скрипник Л.М. Клініко-лабораторні особливости холери Ель-Тор, зареєстрованої на півдні України у 1991-1992 рр. // Інфекційні хвороби. - 1999. - № 4. - С.67-69.

3. Скрипник Л.М., Напханюк В.К., Нікітін Є.В.Активність ферментів трансмембранного транспорту в еритроцитах крові хворих на холеру // Вісник морської медицини. - 2000. - №2. - С.80-82.

4. Скрипник Л.М. Клініка та патогенетична терапія тяжких форм холери. // Проблеми педагогіки вищої медичної освіти у вузах України. - Одеса, 1997. - С.251-255.

5. Скрипник Л.М. Клініко-епідеміологічні особливости холери Ель-Тор, зареєстрованої на півдні України у 1991-1992 рр. // Проблеми педагогіки вищої медичної освіти у вузах України. - Одеса, 1997. - С.378-380.

6. Скрипник Л.М., Нікітін Є.В. Оціночні значення лабораторних тестів визначення ступеня дегідратації у хворих холерою // Проблеми педагогіки вищої медичної освіти у вузах України. - Одеса, 1997. - С.255-256

7. Скрипник Л.М., Миронов В.Ю., Гудзь В.А. Клиническая характеристика холеры и организация помощи больным // IV з'їзд інфекціоністів України: тези доповідей - Київ, 1993. - С.74-75

8. Скрипник Л.М., Миронов В.Ю., Нікітін Є.В., Пясецький Б.М., Гудзь В.А. Невідкладна терапія алгідних форм холери // Актуальні питання невідкладної допомоги. - Одеса, 1993. - С.83-84.

9. Скрипник Л.М. Клініка і невідкладна терапія важких форм холери // Матеріали науково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів України “Нове в діагностиці і терапії інфекційних хвороб”. - Львів, 2000 - С.145.

АНОТАЦІЯ

Скрипник Л.М. “Активність ферментів трансмембранного транспорту та вплив на них регідратаційної терапії у хворих на холеру”. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.13 - інфекційні хвороби, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена вивченню патогенезу порушень трансмембранного транспорту у хворих на холеру Ель-Тор.

Обстежено 90 хворих на холеру з І, ІІ, ІІІ ступенями зневоднення. В еритроцитах в динаміці хвороби досліджували вміст дієнових кон'югатів (ДК), малонового діальдегіду (МДА), відновлених форм глутатіону (GSH), тіолових сполук (SS, SH), активність супероксиддисмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР), глутатіонтрансферази (ГТ), вміст NADPH, NADP, активність Na+-, K+- та Ca2+-АТФ-аз , вміст АМФ, АДФ та АТФ, гуанілових нуклеотидів, активність аденілатциклази, гуанілатциклази.

Встановлено, що від ступеня зневоднення та періоду хвороби залежить підвищення концентрації ДК, МДА, зниження вмісту GSH та SH, підвищення концентрації SS, зниження активності ферментів глутатіонової протиперекисної системи, вмісту NADPH і накопичення NADP, пригнічення Na+-, K+- та Ca2+-АТФ-аз, зниження вмісту АТФ, АДФ при П та Ш ступенях зневоднення та накопичення АМФ при 1 та П ступенях зневоднення, зниження пулу гуанілових нуклеотидів, особливо гуанілтрифосфату, активацію аденілатциклази та пригнічення гуанілатциклази.

Ключові слова: холера Ель-Тор, перекисне окислення ліпідів, антиоксидантна система, циклічні нуклеотиди, транспортні ферменти, макроергічні сполуки.



АННОТАЦИЯ

Скрипник Л.М. “Активность ферментов трансмембранного транспорта и влияние на них регидратационной терапии у больных холерой”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.13 - инфекционные болезни, Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В.Громашевского АМН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению патогенеза нарушений трансмембранного транспорта у больных холерой Эль-Тор.

Обследовано 90 больных холерой с І, ІІ, ІІІ степенью обезвоживания. В эритроцитах в динамике болезни исследовали содержание диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА), восстановленных форм глутатиона (GSH), тиоловых соединений (SS, SH), активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), глутатионтрансферазы (ГТ), содержание NADPH, NADP, активность Na+, K+, Ca2+-АТФ-аз, содержание АМФ, АДФ и АТФ, гуаниловых нуклеотидов, активность аденилатциклазы, гуанилатциклазы.

Установлено, что от степени обезвоживания и периода болезни зависит повышение концентрации ДК, МДА, снижение содержания GSH и SH, повышение концентрации SS, снижение активности ферментов глутатионовой противоперекисной системы, содержания NADPH и накопление NADP, угнетение Na+, K+, Ca2+-АТФ-аз, снижение содержания АТФ, АДФ при П и Ш степенях обезвоживания и накопление АМФ при І и ІІ степени обезвоживания, снижение пула гуаниловых нуклеотидов, особенно гуанилтрифосфата, активация аденилатциклазы и угнетение гуанилатциклазы.

Ключевые слова: холера Эль-Тор, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система, циклические нуклеотиды, транспортные ферменты, макроэргические соединения.

ANNOTATION

Skripnik L.M. “ Activity of enzymes of trans-membrane transport and the influence of re-hydration therapy on them in the cholera patients”. - Manuscript.

Thesis for candidats scientific degree by speciality 14.01.13 - infectious diseases, institute of epidemiology and infectious diseases of the Ukrainian Academy of Medical Science in the name of L.V. Groмаshevskii, Kiev, 2001.

Dissertation dedicated to pathogenesis of infraction in trans-membrane transport in the El-Tor cholera patients.

90 cholera patients with I, II and III level of dehydration were examined. In the disease dinamics the following was studied in the erythrocytes: the content of diene conjugate (DC), malonic dialdehyde (MDA), reduced shape of hlutathione(GSH), carbothiolic compounds (SS, SH), activity of superoxydysmutase (SOD), catalase, glutathioneperoxidase (GP), glutathionereduktase (GR), glutathionetrasferase (GT), content of NADPH, NADP, activity of Na+, K+, Ca2+-ATPh, content of AMPh, ADPh and ATPh, guanyl nucleotides, activity of adenylatcyclase, guanylatcyclase.

The increasing of concentration of DC, MDA and the oppression of content of GSH and SH, the increasing of concentration of SS, oppression of activity of enzymes of glutathione antioxidant system, content of NADPH and accumulation of NADP, oppression of Na+, K+, Ca2+-ATPh, oppression of content of ATPh, ADPh during II and III level of dehydration and accumulation of AMPh during I and II level of dehydration, oppression of pull of guanyl nucleotides, especially guanylthreephosphate, activation adenylatcyclase and oppression of guanylatcyclase was determined depending on level of dehydration and period of disease.

Key words: Cholera El-Tor, peroxide oxidation of lipids, antioxidant system, cyclic nucleotides, transport enzymes, microergine compounds.

Размещено на Allbest.ru