Вплив стафілококового білка А та його різних форм на імунну відповідь

Визначення ролі основного фактора патогенності стафілококів - білка А та його різних форм у формуванні імунної антигенності. Вивчення впливу на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин та системи неспецифічної резистентності.

Рубрика Медицина
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 04.03.2014
Размер файла 59,0 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 612.017.1.: 579.861.097.2

ВПЛИВ СТАФІЛОКОКОВОГО БІЛКА А ТА ЙОГО РІЗНИХ ФОРМ НА ІМУННУ ВІДПОВІДЬ

14.03.08 - імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Холодна Лідія Степанівна

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, Алексеєва Ірина Миколаївна, старший науковий співробітник, завідувач відділу імунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України;

доктор біологічних наук, Остапченко Людмила Іванівна, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка ;

доктор медичних наук, Мельников Олег Федосійович,. професор, завідувач лабораторії патофізіології та імунології Київського НДІ отоларингології ім. О.С. Коломийченка.

Провідна установа: інститут фтизіатрії та пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України.

Захист дисертації відбудеться “ 8 ” січня2002 р. о14 гoдині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий ,, 5 ,, __грудня2001 р_

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради к.б.н. Молчанець О.В.

АНОТАЦІЯ

Холодна Л.С. Вплив стафілококового білка А та його різних форм на імунну відповідь. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.03.08 - імунологія та алергологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено визначенню ролі основного фактора патогенності стафілококів - білка А та його різних форм у формуванні імунної відповіді, з'ясуванню механізмів імуномодулюючої дії, вивченню впливу на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин та системи неспецифічної резистентності. Досліджено вплив факторів, що змінюють продукцію та активність білка А, що може впливати на його антигенність. резистентність патогенність стафілокок імунний

Вперше проведено комплексне дослідження впливу на клітини імунної системи очищеного, кон'югованого, сорбованого, модифікованого, клітинно-зв'язаного білка А. Встановлено основні закономірності впливу досліджуваних антигенних субстанцій стафілококів на розвиток гуморальної та клітинної ланок імунної відповіді, неспецифічних факторів природної резистентності організму, виявлено протекторні властивості. На основі даних по вивченню впливу досліджуваних антигенів на штучні та природні мембрани, на продукцію регуляторних цитокінів та на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин висунуто гіпотезу про можливі механізми імуноактивуючої дії білка А за рахунок залучення Са2+ - залежних процесів. Встановлено клітини-мішені, що активуються. Знайдено протекторні властивості серед досліджуваних субстанцій в експериментальній стафілококовій інфекції. Показано можливість індукції продукції ними фактора переносу клітинної імунної реактивності. Досліджено фармакологічні властивості одержаних препаратів. Антигенспецифічність та відсутність побічних ефектів дозволяють рекомендувати досліджувані препарати для практичного використання.

Ключові слова: імунітет, імунокомпетентні клітини, стафілококова інфекція, антигени стафілококів, білок А, фактор переносу клітинної імунної реактивності.

АННОТАЦИЯ

Холодная Л.С. Влияние стафилококкового белка А и его разных форм на иммунный ответ. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.03.08 - иммунология и аллергология. - Киевский национальний университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.

Диссертация посвящена определению роли основного фактора патогенности стафилококков - белка А и его разных форм в формировании иммунного ответа, изучению механизмов иммуномодулирующего действия, влияния на функциональную активность отдельных популяций иммунокомпетентних клеток и системы неспецифической резистентности. Исследованы факторы, которые изменяют продукцию и активность белка А, что может вплиять на его антигенность и формирование иммунного ответа к нему. Установлено, что среди исследуемых факторов, облучение стафилококка электромагнитными волнами миллиметрового диапазона нетепловой интенсивности изменяет чувствительность культур к антибиотикам, модифицирует продукцию и активность белка А. Индуцированные облучением изменения не связаны с модификацией гена spa, что подтверждено результатами полимеразной цепной реакции.

Впервые проведено комплексное исследование влияния на клетки иммунной системы очищенного, конъюгированного, сорбированного, модифицированного и клеточно-связанного белка А. В диссертации установлены основные закономерности вплияния исследуемых антигенных субстанций стафилококков на развитие гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа, неспецифических факторов природной резистентности организма, определены их протекторные свойства. Белок А стафилококка в разных формах модифицирует функциональную активность клеток иммунной системы, опосредуя ее как специфическим так и неспецифическим взаимодействием с иммуноглобулинами, что приводит к изменению отдельных этапов развития иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Иммуностимулирующее действие является разноплановым и проявляется уже на уровне процессов миграции стволовых кроветворных клеток, активации Т- и В- клеток и их кооперативного взаимодействия.

На основе даных изучения влияния исследуемых антигенов на исскуственные и природные мембраны клеток, продукцию регуляторных цитокинов и функциональную активность отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток выдвинута гипотеза о механизме иммуноактивирующего действия белка А с участием Са2+.- зависимых процессов транслокации через плазматические мембраны. Установлены клетки-мишени, которые активируются. Найдены протекторные свойства среди исследуемых субстанций при экспериментальной стафилококковой инфекции.

Влияя на стимуляцию пролиферации стволовых клеток, регенерацию эритропоэза, кооперативные взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, продукцию цитокинов, митогенное действие как Т- так и В-лимфоцитов, неспецифические факторы резистентности организма, белок А способствует восстановлению иммунной реактивности организма и выживаемости облученных животных, что свидетельствует о его противолучевом действии.

Показана возможность индукции исследуемыми антигенами продукции фактора переноса клеточной иммунной реактивности. Исследованы фармакологические свойства полученных препаратов. Антигенспецифичность и отсутствие побочных эффектов позволяют рекоммендовать данные препараты для практического использования.

Ключевые слова: иммунитет, иммунокомпетентные клетки, стафилококковая инфекция, антигены стафилококков, белок А, фактор переноса клеточной иммунной реактивности.

ABSTRACT

Kholodna L.S. Influence of staphylococcal protein A and its different forms on immune response. - Manuscript.

Doctoral degree thesis, speciality 14.03.08 - immunology and allergology - T. Shevchenko National University, Kiеv, 2001.

The dissertation is devoted to investigation of role of the main staphylococcal patigenic factor - protein A and its different forms in formation of immune response, mechanisms of immunomodulative action, influence on functional activity of various populations of immune cells, nonspecific resistance. Conditions that can change synthesis and antigenic properties of protein A have been evaluated.

A new complex study of immunoloical effects of different forms of protein A (purified, conjugated, absorbed, modified, cell-bound) was conducted to characterize their influence on cellular and humoral immune response, nonspecific resistance; protective effects have been found. Based on data from experiments on protein A influence on artificial bilipid and native membranes, cytokine production, activity of certain sub-populations of immune cells, a hypothesis on mechanisms of immunoactivity of protein A has been proposed. Protein A is found to be able to incorporate in bilipid membranes and to influence Са2+-dependent cellular membrane transport. Protein A induceable target cells have been determined. Protective properties of investigated substances were found in experimental staphylococcal infection in mice. A possibility for production of specific anti-staphylococcal transfer factor was estimated. Pharmacological studies of investigated staphylococcal substances have been performed. Antigenspecifity and absence of negative side effects of these preparations provide practical approaches for protein A usage in various diseases.

Кey words: immunity, immunocompetitive cells, staphylococcal infection, staphylococcal antigens, protein A, transfer factor.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема імунітету та інфекції не втрачає своєї актуальності і на початку ХХ1 століття [Медуницын Н.В., 1999; А.Ройт и соавт., 2000]. Імунітет, головним чином, визначає антиінфекційну резистентність організму. Особливий інтерес викликає питання різноманітності факторів патогенності мікроорганізмів, їх мінливості і здатності впливати на імунну систему [Смирнов В.В., Вершигора А.Е., 1988; Авербах М.М. и соавт., 1995].

Представлена до розгляду робота присвячена одному з актуальних напрямків сучасної імунології - дослідженню імунної відповіді та з'ясуванню механізмів імуномодулюючої дії структурних бактеріальних антигенів, зокрема стафілококових. Актуальним є визначення впливу одного з основних факторів патогенності стафілококів - білка А, який є видоспецифічним та має унікальні імунобіологічні властивості [Вершигора А.Е. и соавт., 1981; Bjork L. et al., 1984; Kronvall G. et al., 1999].

Роль окремих антигенів стафілокока в патогенезі стафілококовіх інфекцій та становленні антистафілококового імунітету на сьогодні вивчена недостатньо [Акатов А.К. и соавт., 1983; Покровский В.И. и соавт., 1999].

Експериментальні роботи, присвячені дослідженню цієї проблеми, розкривають в основному структуру та фізико-хімічні властивості білка А [Movitz J. et al., 1979; Cheung A.L. et al,. 1988; Sting R. et al., 1990]. Не з'ясованими залишаються питання: про біологічне значення унікальних властивостей неспецифічної взаємодії білка А з імуноглобулінами для організму тварин та людей, яким чином це впливає на патогенність стафілокока, механізми його імунобіологічої дії, роль у формуванні імунної відповіді та створенні протективного захисту, чи можна впливати на антигенність білка А як одного з основних факторів патогенності .

Не вирішеними також залишаються питання про те, на які популяції лімфоцитів білок А чинить активуючий або супресуючий вплив, чи відбуваються зміни у функціонуванні системи неспецифічної резистентності і продукції цитокінів, адже вони відіграють ключову роль в індукції імунної відповіді.

Вивчення закономірностей розвитку імунної відповіді, імунологічної пам'яті, специфічних та неспецифічних впливів білка А дозволить оцінити можливості його використання для цілеспрямованої імунорегуляції і, можливо в подальшому, для корекції імунної відповіді при стафілококових інфекціях та для запобігання їх розвитку.

Враховуючи вище викладене, комплексне дослідження впливу білка А стафілококів та його різних форм на індукцію та розвиток імунної відповіді є важливим та актуальним напрямком.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи лабораторії мікробіологічних та імунологічних проблем біотехнології кафедри мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана в рамках тем, відповідальним виконавцем чи науковим керівником яких був дисертант: №31 "Вивчити закономiрностi i шляхи регуляцii функцiональної активностi iмунної системи при специфiчнiй вiдповiдi на мiкробнi антигени", номер держреєстрації 0193U042387 (1991-1993 р.р.), №54 "Вивчити закономірності і шляхи регуляції клітинної імунної відповіді на мікробні антигени", номер держреєстрації 0195U025815 (1994-1996 р.р.), №97/085 "Механізми розвитку та регуляції імунної відповіді на антигенні субстанції умовно-патогенних бактерій", номер держреєстрації 0197U003569 (1997-2000 р.р.) комплексної наукової програми "Здоров'я людини"; №391 "Вивчення механізмів дії речовин мікробного походження з імуномодулюючими та ад'ювантними властивостями, які можуть бути використані для реабілітації імунної системи", держ. наук.-тех. програма "Захист та реабілітація імунної системи населення України", п. 1.1.2., номер держреєстрації 1.01.04090, шифр 1.1.2-8058 (1992-1994 р.р.); №472-91 "Вплив КХЧ-електромагнітного опромінення на імунобіологічні властивості умовно-патогенних бактерій", замовник ІРЕ РАН м. Москва, (1991-1996 р.р.); №556 "Розробка ефективних iмунологiчних методiв дiагностики захворювань стафiлококової етiологiї у дiтей в умовах забрудненого середовища (на основi iмуноферментного аналiзу та реакцii коагглютинацiї)", напрямок згiдно додатку №2 до наказу Мiносвiти України вiд 23.11.92 №187 "Здоров'я людини"; №461-97, №462-98 "Вплив КХЧ-електромагнітного опромінення на імунну систему", замовник ІРЕ РАН м. Москва, номер держреєстрації 0198U007821 (1997-1999 р.р.); №737 "Механізми модулюючої дії субстанцій стафілокока на електричні та механічні властивості гладком'язевої клітини", Державний комітет України з питань науки і технологій (1993-1994 р.р.); №962 "Розробка методів одержання та застосування в медицині та ветеринарії фактора переносу", номер держреєстрації 0195U025814 (1994-1997 р.р.) та №98500 "Розробка методів одержання та застосування високоефективних імуностимулюючих препаратів природного походження на основі фактора переносу", номер держреєстрації 0198U007822, замовник МОЗ України (1998-2000 р.р.).

Метою представленої роботи є визначення впливу стафілококового білка А та його різних форм на розвиток імунної відповіді, з'ясування механізмів імуномодулюючої дії, вивчення впливу досліджуваних антигенів на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин, системи неспецифічної резистентності, закономірностей формування імунної відповіді та імунологічної пам'яті, можливості індукції продукції цитокінів, що регулюють її розвиток і становлення, визначення протекторних властивостей. На основі одержаних даних, оцінити можливість застосування на практиці досліджуваних субстанцій.

Основні задачі роботи :

- з'ясувати вплив білка А стафілокока та його різних форм на основні етапи становлення та розвитку імунної відповіді, функціональну активність імунокомпетентних клітин, дослідити механізми імуномодулюючої діі;

- дослідити вплив різних чинників на продукцію та активність білка А (БА) як основного фактора патогенності стафілококів, що може вплинути на його антигенність; а також одержати різні форми білка А стафілококів;

-охарактеризувати ранні активаційні процеси в клітинах при антигенній стимуляції на основі данних по взаємодії білка А зі штучними біліпідними та природними мембранами;

- в експериментах in vitro та in vivo дослідити особливості проліферативної відповіді лімфоїдних клітин різних видів тварин для визначення популяції лімфоцитів, що відповідають на дію декількох форм БА;

- з'ясувати специфічні та неспецифічні впливи даної субстанції;

- дослідити закономірності розвитку імунної відповіді до БА в різних формах, динаміку, рівень гуморальної відповіді, клас індукованих антитіл, можливість розвитку імунологічної пам'яті;

- вивчити особливості поліклональної дії досліджуваних субстанцій та модифікацію гуморальної імунної відповіді на Т-залежний антиген за їх участю;

- вивчити вплив БА та його різних форм на функціональну активність природних кіллерів, фагоцитарну та бактерицидну активність клітин;

- оцінити особливості продукції цитокінів за умов застосування БА та при експериментальній стафілококовій інфекції і визначити протекторні властивості його різних форм;

- охарактеризувати гістоморфологічні зміни в органах імунної системи під впливом білка А та інших стафілококових антигенів;

- дослідити можливості корекції імунної відповіді при застосуванні різних форм білка А стафілокока та фактора переносу клітинної імунної реактивності.

Об'єкт дослідження: структурні бактеріальні антигени клітинної стінки стафілокока та їх вплив на імунокомпетентні клітини. Визначення впливу основного фактора патогенності стафілококів білка А та його декількох форм на різні ланки становлення та розвитку імунної відповіді, фактори неспецифічної резистентності, дослідження механізмів імуномодулюючої дії, протекторних властивостей.

Предмет дослідження: стафілококи, антигенні субстанції, імунна система. В роботі з'ясовуються антигенні властивості білка А та його різних форм: розчинного, клітинно-зв'язаного, кон'югованого, сорбованого, модифікованого ультразвуком та опроміненням електромагнітними хвилями мм-діапазону та індукованого ними фактора переносу клітинної імунної реактивності, низькомолекулярного діалізованого екстракту лейкоцитів, отриманого та очищеного згідно запропонованої нами модифікації.

Методи дослідження: у наших дослідженнях визначення впливу основного фактора патогенності стафілококів білка А та його різних форм на імунну відповідь, з'ясування механізмів імуномодулюючої дії, вивчення їх впливу на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин, систему неспецифічної резистентності проводили на підставі комплексного використання мікробіологічних, фізико-хімічних, імунологічних та радіологічних методів дослідження, цитологічних методів визначення гістоморфологічних змін лімфоїдних органів імунної системи: селезінки, тимусу, лімфоїдних вузлів, фармакологічних методів оцінки досліджуваних препаратів білка А і індукованого ними специфічного фактора переносу клітинної імунної реактивності.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати проведених комплексних досліджень дозволили отримати цілий ряд принципово нових даних, які значно розширюють і доповнюють сучасні уявлення про імунобіологічну активність і механізми імуномодулюючої дії стафілококового білка А в різних формах, його специфічні та неспецифічні впливи. Основні результати роботи одержані вперше і є новими.

З'ясовано вплив різних чинників на продукцію та активність одного з основних факторів патогенності стафілококів білка А. Вперше виявлено модулюючу активність короткохвильового електромагнітного виромінювання мм-діапазону (КХЧ), що може впливати на антигенність даної субстанції та формування імунної відповіді. Індуковані опроміненням зміни не пов'язані з модифікацією гену spa, що підтверджується результатами полімеразної ланцюгової реакції.

Отримані результати свідчать про те, що КХЧ опромінення відміняє екрануючий ефект імуноглобулінів: стафілококи втрачають здатність неспецифічно зв'язуватись з Fc-фрагментами імуноглобулінів, що, в свою чергу, сприяє їх фагоцитозу макрофагами, антигенній презентації стафілококів та формуванню повноцінної антигенспецифічної імунної відповіді.

Вперше комплексно досліджено імунну відповідь до різних форм білка А: розчинного, клітинно-зв'язаного, кон'югованого, сорбованого, модифікованого ультразвуком та опроміненням електромагнітними хвилями мм-діапазону. Проаналізовано антигенні властивості білка А. Встановлено його значення в індукції специфічних антитіл в процесі розвитку стафілококової інфекції та охарактеризовано його можливу патогенетичну роль в розвитку аутоімунних захворювань.

Охарактеризовано вплив білка А стафілокока на етапи становлення імунної відповіді до Т-залежного антигену. Білок А впливає на міграцію Т- та В-лімфоцитів та їх кооперативну взаємодію. Регулююча дія опосередковується Т-лімфоцитами та макрофагами. Імунізація білком А та його видозміненими формами впливає на продукцію антитілоутворюючих клітин класів ІgМ та ІgG, що свідчить про розвиток імунологічної пам'яті.

Встановлено відмінності у імуномодулюючій активності стафілококів з різним вмістом білка А в клітинній стінці. Віддиференційовано його неспецифічні та специфічні впливи.

Доведено, що після імунізації білком А, його вплив проявляється вже на рівні гемопоетичних стовбурових клітин. Одержані вперше дані про чисельність ендоколоній, які розвивались в селезінці мишей декількох ліній, імунізованих різними формами білка А в різні строки після опромінення, свідчать про вплив досліджуваних препаратів на стовбурові клітини. Стимулюючий ефект спостерігали і в тесті екзоколонієутворення після обробки трансплантованих клітин названими антигенами in vitro. Не відмічено впливу на транзиторні ендогенні колонії в селезінці.

Виявлено прискорення регенерації еритропоезу після опромінення, що підтверджує включення [59Fe] в еритроїдні клітини кісткового мозку і селезінки мишей. Встановлено вплив і на післярадіаційне виживання опромінених мишей та щурів, що показує протипроменеву дію білка А і має практичне значення.

Досліджено вплив білка А стафілокока на властивості штучних і природних мембран. Вперше показано зміни властивостей штучних фосфоліпідних мембран, які обумовлені проникненням білка А в біліпідні мембрани, а не поверхневою активністю. Результати свідчать про незворотнє вмонтування білка А. Встановлено здатність білка А формувати іон-провідникові структури в біліпідних мембранах.

Вперше виявлено, що білок А посилює кальційзалежну калієву провідність клітинних мембран. Встановлене явище впливу білка А на процеси мембранної транслокації Са2+ є одним з ключових компонентів процесу сигнальної трансдукції, що може забезпечувати активацію синтетичних та активаційних процесів в лімфоцитах.

Вперше показано стимулюючий вплив досліджуваних препаратів на продукцію ІЛ-1 та ІЛ-2, ІФН та ФНП, які є визначальними в розвитку клітинної імунної відповіді. Як свідчать одержані результати, дія білка А полягає у стимуляції продукції цитокінів, які ініціюють каскадну функціональну активацію імунокомпетентних клітин. Такі процеси є важливими факторами регуляції підтримки балансу росту та визначення шляху розвитку клітин, що має значення для регуляції імунного гомеостазу та апоптозу клітин, формування протипухлинного захисту, регенерації лімфопоезу та становлення імунної відповіді.

Проліферація клітин імунної системи є основою формування імунної відповіді гуморального і клітинних типів. Комплексно досліджено вплив білка А та його декількох форм на проліферативну активність лімфоцитів мишей, щурів та безтимусних мишей nude і встановлено, що активація починається через 24 години, а максимум синтезу ДНК відбувається через 48 годин культивування. Визначено особливості мітогенної дії досліджуваних антигенів. Мітогенний ефект білка А не пов'язаний з присутністю IgG в середовищі. Отже неспецифічна взаємодія білка А з Fc-фрагментом IgG не є основним стимулом активації лімфоцитів. Досліджено популяції лімфоцитів, що активуються під впливом білка А в різних формах. Виявлено його мітогенну дію на Т- та В-лімфоцити декількох видів тварин, яка є Т-В-залежним процесом.

Вперше виявлено антипроменеві ефекти білка А. При порівняльній оцінці функціональної активності імунокомпетентних клітин щурів лінії Вістар, опромінених у дозі 0,5 Гр та 1,0 Гр, під впливом стандартних мітогенів спостерігається зниження проліферації у відповідь на ФГА, Кон А, ЛПС порівняно з контролем та її відновлення під впливом білка А, що залежало від часу введення антигену після опромінення. Поліклональна активація Т- та В-лімфоцитів, вплив на продукцію цитокінів, неспецифічні фактори резистентності сприяє відновленню як Т-, так і В-систем імунітету опромінених тварин.

При дослідженні впливу білка А на функціонування системи неспецифічної резистентності встановлено, що розчинний та клітинно-зв'язаний білок А в дозах 10 і 100 мкг/мишу посилюють цитотоксичну реакцію природних кіллерних клітин (ПКК) периферійної крові. Кіллерна активність має фазовий характер і залежить від дози препарату.

Виявлено, що білок А значно (в 2 і більше разів) підсилює бактерицидну активність макрофагів перитонеального ексудату в нестимульованому і стимульованому тестах, що свідчить про підвищення функціонального резерву фагоцитуючих клітин. Стимуляція фагоцитарної активності є важливою ланкою етапу ініціації імунної відповіді.

Під впливом білка А спостерігається дозозалежне, фазове підвищення рівня інтерферону в сироватці мишей з експериментальною стафілококовою інфекцією, стимуляція продукції фактора некрозу пухлин, активація ПКК.

При експериментальній стафілококовій інфекції профілактичне введення мишам білка А та клітинно-зв'язаного білка А, починаючи з 3-ї доби, призводить до зменшення кількості колонієутворюючих одиниць (КУО) в гомогенаті нирок. Динаміка кількості КУО в гомогенаті свідчить про протекторну дію попереднього введення досліджуваних препаратів білка А.

Охарактеризовано гістоморфологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока з різним вмістом білка А, що відображають підсилення функції ретикуло-гістеоцитарної системи та процеси розвитку клітинної імунної відповіді при імунізації антигенами стафілокока.

Після імунізації різними формами білка А у тварин формується стан гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ), інтенсивність якого залежить від використаного антигену. Обробка очищеного та клітинно-зв'язаного білка А (КЗБА) електоромагнітним випромінюванням мм-діапазону, використання сорбованого на силікагелі антигену змінює формування стану гіперчутливості. Впливаючи на Th1 та продукцію ІЛ-2 за допомогою циклоспорину А, можна модифікувати інтенсивність реакції гіперчутливості сповільненого типу до різних форм білка А. Показано, що індукований стан ГСТ можна перенести від імунного організму до інтактного з допомогою отриманого специфічного фактора переносу клітинної імунної реактивності, що за дуже короткий термін, минаючи етапи вакцинації, без будь-яких негативних впливів, забезпечує підсилення специфічної імунологічної реактивністї. Охарактеризовано імуноактивуючі властивості досліджуваних форм БА та індукованих ними препаратів фактора переносу імунної реактивності та вивчено їх основні фармакологічні властивості.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені вперше комплексні дослідження імунної відповіді та імуномодулюючої дії різних форм білка А стафілококів та індукованого ними фактора переносу клітинної імунної реактивності. Ефективність створеного ними антигенспецифічного імунітету та відсутність негативних побічних реакцій досліджених препаратів дозволяють рекомендувати їх для застосування в якості протистафілококових препаратів для імунізації, які здатні ефективно індукувати чи швидко переносити специфічний імунітет, минаючи вакцинацію. Запропоновані методи одержання препаратів можуть бути покладені в основу розробки промислових технологій їх отримання з метою розширення використання як імуномодулюючих засобів, а також для імунореабілітації.

Практичне значення мають дослідження активності та продукції одного з основних факторів патогенності стафілокока - білка А, які можуть бути використані для пояснення відомих лікувальних ефектів КХЧ-терапії при захворюваннях стафілококової етіології.

Зважаючи на те, що в даних екологічних умовах ведеться пошук речовин, які поряд з антипроменевими властивостями могли б забезпечити антиінфекційний імунітет та мали б адаптивні властивості, отримані результати експериментальних досліджень стимуляції білком А відновлення проліферації стовбурових гемопоетичних клітин, регенерації еритропоезу, виживаності експериментальних тварин після опромінення можуть мати практичне значення і у його використані для імунореабілітації після опромінення. На користь цього також свідчить здатність БА впливати на продукцію цитокінів, неспецифічні фактори резистентності, його поліклональна дія на Т- і В-лімфоцити системи імунітету.

Результати проведенних досліджень мають загальнотеоретичне значення для адекватної оцінки імуномодулюючих ефектів білка А стафілокока та його видозмінених форм, а також сприяють більш глибокому розумінню механізмів регуляції функціональної активності лімфоцитів за їх участю. Ідентифікація шляхів ініціації імунної відповіді різними формами білка А, продукції регуляторних цитокінів, впливу названих антигенів на функціонування окремих ланок клітинного і гуморального імунітету, факторів природної резистентності має велике значення для встановлення шляхів і способів імунокорекції, що дає практичний внесок в розробку стратегії імунорегуляції за допомогою засобів природного походження.

Матеріали проведених досліджень використовуються в навчальному процесі кафедри мікробіологіі та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка у теоретичних і практичних спецкурсах `'Імуномодулятори'', `'Прикладна імунологія`', `'Радіоімунологія''.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно розроблено програму та методологію проведених досліджень, виконано основні експериментальні дослідження, проаналізовано їх результати, сформульовано основні положення і обгрунтовано науково-практичні висновки. Оформлення роботи виконано самостійно. Автор висловлює вдячність за науково-консультативну допомогу д.м.н., проф. Н.М. Бережній, Інститут експериментальної онкології, патології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ; д.м.н. О.В. Проніну, НДІ епідеміології та мікробіології ім. М.Ф. Гамалеї РАМН (Москва); ст.н.с, к.м.н. В.А. Степанчуку, НДІ гематології та переливання крові МОЗ України; ст.н.с., к.б.н. О.Л. Шатурському, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна; методологію та експериментальне забезпечення досліджень розд. 4.2.2. здійснено акад. НАНУ М.Ф. Шубою, проф., д.б.н М.С. Мірошниченком, н.с., к.б.н. І.Б. Філіповим, доц., к.б.н. Т.Л. Давидовською, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, кафедра біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Автор висловлює глибоку шану д.м.н., проф. А.Ю. Вершигорі , ініціатору цих досліджень.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації представлено у доповідях на вітчизняних та міжнародних конференціях: “Новые направления в биотехнологии” (Киев, 1984), Всесоюзному з'їзді імунологів (Москва, 1989), Міжнародному симпозіумі по алергії і клінічній імунології (Алма-Ата, 1992), VІ (Київ, 1992) та VІІ (Київ, 1997) Українських біохімічних з'їздах, Мікробіологічному з'їзді (1994), Радіологічних з'їздах (Дніпропетровськ, 1995; Москва, 1997), 1 та 2 Українських з'їздах біофізичних товариств (Київ, 1994, 1998), Міжнародних Симпозіумах по міліметровим хвилям в біології і медицині (Москва, 1995, 1997, 1999) та імунореабілітації (Ізраїль, 1995). Результати досліджень були обговорені на Міжнародних симпозіумах по фактору переносу (Італія, 1995; Мексика, 1999) та представлені на фахових Міжнародних конференціях в Росії, Німеччині, Ізраілі, Італії, Австрії (1996-1999), наукових конференціях біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (1999, 2001 р.р.).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 64 наукових працях. З них 35 статей у наукових журналах та 29 - у матеріалах конгресів і наукових конференцій. У фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 29 статей.

Структура та об'єм дисертації. Роботу побудовано за загальноприйнятою структурою. Дисертація викладена на 348сторінках машинопису, ілюстрована 32 таблицями та 54 рисунками, серед яких 7 фото. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 10 розділів власних досліджень, підсумкового розділу, висновків, списку використаних джерел, додатку. Перелік посилань включає 479 першоджерел, серед яких 165 робіт авторів України та країн СНД і 314 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження

У роботі були використані такі тварини: бики, кролі, морські свинки, щурі лінії Wistar, безпородні миші і миші лінійні СВА, C57BL/6, BALB/C, C3H/Hej, гібриди: (СВАС57BL/6)F1 та (С57BL/6A/Sn)F1, безтимусні миші nude. Проводились дослідження на биках 1 річного віку вагою 150-200 кг дослідного господарства Національного аграрного університету та на нелінійних морських свинках вагою 200-250 г і лінійних мишах, отриманих з віварію Інституту експериментальної онкології, патології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ та з розплідника “Столбовая”, Москва, безтимусних мишах nude з онкологічного наукового центру РАМН. Щурів лінії Wistar вагою 150-200 г отримували з віварію НДІ ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМНУ. Тварини утримувались в стандартних умовах віварію. Донорів-людей імунізували тричі, з проміжком у тиждень, підшкірно (під лопатку) у дозі 5 одиниць сенсибілізації СА та ДА на базі Київського НДІ гематології та переливання крові МОЗ України.

В експериментальних дослідженнях використовували Staphylococcus aureus штамів Wood-46 (ССМ2351), Cowan-1 (ССМ2352), Smіth (ССМ 2287), ССМ3272, 209, Candida albicans, Esсherihia coli, Micrococcus lisodeicticus, РРД Mycobacterium tuberculosis. Стафілококовий анатоксин (СА), дифтерійний анатоксин (ДА), дифтерійно-правцевий анатоксин (ДПА) виробництва НДІ епідеміології та мікробіології РАМН (Москва). Національним аграрним університетом (Київ) надано антигени Rota virus і Нью Кастл.

Культури стафілокока вирощували на МПА протягом 20-24 год при 37С або 41С, відмивали фізіологічним розчином, інактивували нагріванням при 80С 30 хв. чи формаліном і застосовували як корпускулярний антиген стафілокока (КАС). Продукцію та активність білка А визначали методом неспецифічної взаємодії з імуноглобулінами [Lind I., 1975; Walker K.N., 1995] та імунофлюоресценції [Forsgren A. et al., 1970; Svenson H.G., 1998].

Для оцінки впливу різних факторів на фізіологічні та патогенні властивості стафілококів, продукцію і активність білка А визначали культуральні властивості, пігментоутворення, плазмокоагулюючу здатність, лізоцимну, лецитовітелазну, гемолітичну, нуклеазну активності за загальноприйнятими методами [Лабинская А.С., 1972], динаміку росту, антибіотикочутливість. Використовували ультразвук і електромагнітне випромінювання міліметрового діапазону в якості модифікаторів стафілококових антигенів [Девятков Н.Д. и др., 1991].

Методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) визначали продукцію білка А штамами золотистого стафілокока, що оброблені електромагнітним опроміненням мм-діапазону нетеплової інтенсивності [Annemuler C. et al., 1999; Schmitz F.J. et al., 1998]. Наявність ампліфікатного продукту розміром 600 bp свідчила про функціонування гену, що кодує білок А - spa [Hoefnagels-Schuermans A. et al., 1997; Walker J. et al., 1998].

Клітинно-зв'язаний білок А (КЗБА) отримували методом механічного руйнування клітин з допомогою гомогенізатора Л-17 [Ражба Є.Я., 1972] з використанням лізостафіну (Sigma, США), видаляючи нуклеїнові кислоти з клітинної стінки обробкою ДНК-зою та РНК-зою [Thumm G. et al., 1997; Navarre W.W. et al., 1999]. Наявність білка А контролювали імунофлюоресцентним методом.

Білок А отримували комбінацією декількох методів [Bjork L., Kronvall G., 1984; Cheung AI. et al., 1988; Sting R. et al., 1990; Kronvall G., 1995] у модифікації [Вершигора А.Е. и соавт., 1981]. Для подальшої очистки одержаних препаратів проводили іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-целюлозі (DE32, Watman Ltd, Великобританія). Гель-фільтрацію здійснювали, використовуючи колонки з сефадексом G-100, G-200 [Cheung A.L. et al., 1988; Sting R. et al., 1990].

Електрофорез препаратів виконували за методом [Laemmli U.K., 1970]. Візуалізацію електрофореграм здійснювали фарбуванням гелей кумассієм блакитним R-250 (Serva, Німеччина). Для визначення відносних молекулярних мас використовували комерційний набір маркерних білків LMW (Pharmacia, Швеція). Визначення амінокислотного складу здійснювали на аналізаторах KLA-5 (Hitachi, Японія) і LC 5001 (ФРН).

Досліджено імуномодулюючу активність білка А стафілокока, який одержано в різних формах: очищений, клітинно-зв'язаний, корпускулярний та модифікований різними фізико-хімічними методами, кон'югований та сорбований. З цією метою визначали їх вплив на різні ланки становлення і розвитку імунної відповіді, зокрема, стан гемопоезу, функціональну активність клітинного та гуморального імунітету, функціонування системи неспецифічної резистентності, продукцію цитокінів.

Вплив білка А на гемопоез визначали методом ендо- та екзоколонієутворення в селезінці сублетально (5,5 Гр) та летально (8,5 Гр) опромінених мишей ліній BALB/с, CBA, (CBAC57BL/6)F1. Клонування гемопоетичних клітин в організмі летально опромінених мишей здійснювали за описаним в літературі методом [Till L.E., McCulloch E.M., 1961, 1964].

Післярадіаційну регенерацію еритропоезу вивчали за допомогою внутрішньовенного введення мишам (лінії B6AF1, (CBAC57BL/6)F1, (C57BL/6ASn/F1)) 0,5 мкКи [59Fe]. Радіоактивність в селезінці і задній кінцівці підраховували на гамма-спектрофотометрі Nuclear Chicago (США).

Вивчення впливу на штучні фосфоліпідні мембрани проводили за методом [Mueller P. et al., 1962]. Взаємодію білка А з ШФМ і межею фаз "розчин електроліту-ліпід" оцінювали за результатами вимірювання провідності [Афонін С.Е. і співавт., 1996].

Вплив білка А стафілокока на властивості природних мембран оцінювали як описано [Філіпов І.Б. і співавт., 1996]. Досліджували вплив білка А на кальційзалежну калієву провідність мембрани та процеси мембранної транслокації Са2+. Вплив білка А на активність потенціалзалежних трансмембранних Ca2+ каналів досліджували на гладком'язевих препаратах taenia coli морських свинок, а також на кільцевих сегментах артерії свині. Їх скоротливу активність реєстрували в ізометричному режимі при оптимальній довжині за допомогою п'єзоелектричного датчика (Єкатиренбург, Росія). БА заданої концентрації вносили в розчин Кребса, який омивав препарати, за 30 хв. до вивчення механічної активності, спричиненої фізіологічно активними речовинами. В дослідах використовували ацетилхоліна хлорид (10-7-5.10-3М), прокаїн (2,5.10-4М), кофеїн (2.10-2М), ніфедипін (10-5М) (Sigma, США), індометацин (10-6М) (Дарниця, Україна), натрій аденозинтрифосфат (10-5-104М) (Reanol, Угорщина). Дослідження виконані у співробітництві з кафедрою біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка (зав. кафедри, д.б.н., проф. Мірошниченко М.С.) та Інститутом фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (акад. НАН України Шуба М.Ф.).

Продукцію ІЛ-1 визначали традиційним методом по посиленню проліферації тимоцитів мишей лінії C3H/Hej в присутності субоптимальної концентрації фітогемаглютиніну (ФГА) [Smith K.A. et al., 1981].

Для визначення імунної реактивності та здатності антигенів стафілокока впливати на продукцію лімфоцитами інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) використовували культуру спленоцитів мишей лінії CBA, звільнену від макрофагів, оброблену імпульсним методом субоптимальною дозою ФГА (Sigma, США). Після культивування клітин з препаратами БА активність ІЛ-2 тестували в супернатантах, оцінюючи проліферацію тест-клітин, що відповідають на ІЛ-2. В якості тест-клітин використовували бласти мишей лінії СВА, що були одержані на 4-ту добу стимуляції лімфоцитів субоптимальною дозою Кон А (Difco, США) [Ковальчук Л.Б. и соавт., 1986; Кузьмина E..Г. и соавт., 1986.].

Число прямих антитілоутворюючих клітин (IgM-АУК) досліджували методом локального гемолізу в гелі [Jerne N. et al., 1963]. Для визначення кількості IgG-АУК використовували непрямий метод [Dresser D. et al., 1965].

Вивчення мітогенної дії різних форм БА проводили in vitro за допомогою мікрометоду реакції бласттрансформації лімфоцитів по включенню [3H]-тимідину в ДНК лімфоцитів [Каулен Д.Р. и соавт., 1979] з використанням стандартних мітогенів: фітогемагглютиніну (ФГА), конканаваліну А (Кон А), ліпополісахариду E. coli (ЛПС) (Sigma, США), декстрансульфату (ДС) (Pharmacia, Швеція).

Визначали вплив білка А та його модифікованих форм на функціональну активність лімфоцитів щурів лінії Wistar вагою 130-150 г. Тварин піддавали тотальному одноразовому опроміненню на рентгенівській установці РУМ-17 за таких експозиційних доз: 1,29 10-2 Кл/кг (поглинута доза - 0,5 Гр) та 2,5810-2 Кл/кг (поглинута доза - 1 Гр). Умови опромінення: потужність дози - 20 Р/хв, фільтри 0,5 мм (Cu + Al), напруга 180 кВ, сила струму 5 мА, фокусна відстань - 50 см.

Фагоцитарну активність макрофагів оцінювали по фагоцитозу мічених [51Cr] еритроцитів барана (ЕБ) і [3Н]-тимідин корпускул стафілокока. Вплив антигенів на фагоцитарну та бактерицидну активність нейтрофілів досліджували мікроскопічним методом. Визначали активність та індекс фагоцитозу. Зміни бактерицидної активності нейтрофілів периферійної крові визначали за допомогою спонтанного чи стимульованого НСТ-тесту [Петров Р.В. и соавт, 1992]. Функціонально-метаболічну активність клітин перитонеального ексудату визначали по відновленню НСТ [Грачова М.П., 1984]. Оцінку активності макрофагів проводили хемілюмінесцентним методом [Vas S.I., Nicole Z.A., 1983].

Кіллерну активність лімфоцитів селезінки визначали за допомогою колориметричного методу [Кузовкова Н.А., 1991] по здатності клітин-мішеней фібробластів мишей лінії L929, оброблених нейтральним червоним, лізуватись під впливом природних кіллерних клітин (ПКК). Активність ПКК периферійної крові мишей оцінювали методом [Nellsen et al., 1989]. В якості клітин-мішеней використовували культури лімфосаркоми Плісса, попередньо оброблені [51Cr] з активністю 4-5 мБк.

Гістоморфологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока, визначали за загальноприйнятим методом [Волков О.В. и соавт., 1982; Young B., Heath J.W., 2000].

Вивчали вплив препаратів білка А на продукцію ряду цитокінів. Оцінку продукції інтерферону проводили мікрометодом [Ершов Ф.И., 1996; Тазулахова Э.Б. и соавт., 1991]. Клітинами-мішенями були фібробласти мишей лінії L929. За титр ІФН в сироватці мишей, яким вводили різні препарати БА, приймали останнє розведення, що забезпечувало захист 50% клітин від дії віруса міокардиту в дозі ЦТД50.

Рівень фактора некрозу пухлин (ФНП) в сироватці крові мишей, яким вводили препарати БА, визначали за допомогою колориметричного методу [Пронин А.В. и соавт., 1996; Панютич Е.А. и соавт., 1992], оцінюючи тумороцидну дію ФНП на клітини-мішені: фібробласти мишей лінії L929. Перерахунок цитотоксичного індексу (ЦІ), вираженого в процентах, в міжнародні одиниці (МО) здійснювали за допомогою визначення ЦІ стандартного розчину рефналіну з вмістом ФНП 100 МО/мл.

При експериментальній стафілококовій інфекції персистенцію збудника в організмі мишей визначали методом прямого посіву на МПА гомогенату нирок - одного з органів, який найбільше інфікується при інтраперитонеальному введенні Staph. aureus [Четвертых В.А. и соавт., 1990].

В роботі була зроблена спроба одержати фактор переносу клітинної імунної реактивності (ФП) до декількох форм білка А та досліджена їх здатність швидко індукувати стан гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) у інтактних тварин з метою можливого подальшого застосування на практиці. З крові та лімфоїдних органів тварин, імунізованих різними формами білка А, і з крові здорових людей-донорів, імунізованих СА на базі НДІ гематології та переливання крові МОЗ України, виділяли лейкоцити. Отримували фактор переносу (ФП) з безклітинного діалізованого екстракту лейкоцитів (ДЕЛ) тварин та донорів, які знаходились у стані ГСТ, комбінацією методів [Lawrance S.H. еt al., 1974; Kirkpatrick C.H. et al., 1983] у модифікації [Холодна Л.С. і співавт., 2000]. Для цього, виділені за стандартною методикою та зруйновані лейкоцити, обробляли ДНК-азою в присутності Mg2+ для гідролізу. Проводили діаліз екстрактів (при 4С) протягом 24 годин проти стерильної бідистильованої апірогенної води з допомогою діалізних касет з інтервалом утримання 3,5 та 7,5 кДа (Pierce, CША). Cтерилізацію та контроль чистоти діалізатів здійснювали фільтруванням (0,22 мкм) (Fisher, CША), ФП, виділений з 5108 клітин, вважався 1 міжнародною одиницею (МО) ФП [Kirkpatrick C.H. et al., 1983]. Препарати кількісно стандартизували за вмістом нуклеїнових кислот та білка, який визначали спектрофотометрично по поглинанню УФ-світла (=260 і 280 нм, відповідно). Одержані препарати очищали гель-фільтрацією на Sephadex G-25 (Sigma, CША). Електрофорез дослiджуваних зразкiв проводили за Laemmli [Laemmli U.K., 1970]. Виділені, очищені, стандартизовані та розподілені на фракції фільтруванням (фільтри Аmicon, Голландія) з молекулярною масою 0-5 кДа, 5-10кДа та 10-15 кДа препарати зберігались в морозильній камері при 15С.

У тварин стан ГСТ визначали in vivo за допомогою шкірних проб на розрішуючу дозу відповідного антигена, а у людей in vitro, по інтенсивності гальмування міграції лейкоцитів./ макрофагів. Активність отриманих препаратів фактора переносу оцінювали за визнаними критеріями по їх здатності in vivo індукувати стан ГСТ у інтактних реципієнтів та in vitro за допомогою реакції інгібіції міграції (МІФ) [Fudenberg H.H., 1994].

Визначення мутагенних, канцерогенних та токсигенних [Maron D.M. et al., 1983; Ames B.N. et al., 1975] властивостей препаратів виконано у співробітництві з НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України. Алергенні та пірогенні [Пыцкий В.И. и соавт., 1991; Фрадкин В.А.,1990; Медуницын Н.В., 1999] властивості, стерильність препаратів оцінювали згідно методичних інструкцій по контролю препаратів МОЗ України. У співробітництві з НДІ гематології і переливання крові МОЗ України проводили визначення наявності антигенів вірусів гепатиту В, С та антигенів ВІЛ, збудника сифілісу радіоімунними або імуноферментними методами з використанням комерційних тест-систем у відповідності з доданими до них інструкціями (Abbott, США; Sanofi, Франція).

Достовірність числових відмінностей оцінювали за критерієм Стьюдента. Імовірність похибки p визначали згідно таблиць з допомогою розрахованого значення t. Різницю вважали статистично імовірною при р<0,05. Статистичну обробку здійснювали за допомогою програмного забезпечення Microcal Origin 5.0 for Windows 95 (Microcal Software Inc., Northamton, MA, USA, 1997) на комп'ютері.

Фізико-хімічна характеристика різних форм білка А стафілокока.

В дослідах були використані штами стафілокока, які містять білок А та ті, які не мають його в своєму складі. Виділений нами клітинно-зв'язаний білок А (КЗБА) отримували методом механічного руйнування клітин з допомогою гомогенізатора Л-17 і вилучення нуклеінових кислот з клітинної стінки обробкою ДНК-азою та РНК-азою та з використанням лізостафіну. Наявність білка А в препаратах контролювали імунофлюоресцентним методом. Білок А отримано зі стандартного штама-продуцента Staph. aureus Cowan-1 та очищено іонообмінною хроматографією і гельфільтрацією. Препарат було охарактеризовано фізико-хімічно та доведено його біологічну активність по здатності неспецифічно взаємодіяти з IgG.

Судячи з активності БА у фракціях, отриманих в результаті очистки, визначеної методом подвійної імунодифузії (ПІД) в агарі, мала місце неспецифічна взаємодія БА з IgG декількох видів тварин та людей, що підтверджує його вищезгадані властивості. Аналогічний результат був отриманий при використанні референс-препарату, отриманого від фірми Sigma (США).

При з'ясуванні амінокислотного складу нами встановлено, що БА містить 16 амінокислот: гістидин, гліцин, серин, аспарагінову кислоту, глютамінову кислоту, аланін, лейцин, валін, фенілаланін, метионін, лізин, аргінін, треонин, пролін, ізолейцин, серед наведених амінокислот переважають лізин, аспарагін та глутамін. Відмічено наявність тирозину. Молекулярна маса очищеного гельфільтрацією БА, визначена з допомогою SDS-електрофорезу в поліакриламідному гелі [Weber K., Osborn H., 1969], складала 42 кДа.

Проаналізовано імунну відповідь до слідуючих форм білка А: розчинного та клітинно-зв'язаного білка А,сорбованого на силікагелі (НДІ фізичної хімії НАНУ) за фізіологічних умов та модифікованого ультразвуком чи опроміненням електромагнітними хвилями мм-діапазону [Девятков Н.Д. и соавт., 1991]. кон'югованого з бичачим сороватковим альбуміном [Радавский Ю.Я. и соавт., 1993], гемоглобіном [Джонсон Д., 1981].

Оскільки БА вважається одним з основних факторів патогенності стафілококів, було досліджено умови, що впливають на його продукцію мікроорганізмами та активність і, виходячи з цього, на можливі зміни патогенності. Відомо, що продукція БА стафілококами та його активність залежать від ряду факторів та корелює з наявністю каталази, ДНК-ази, продукцією токсинів (зокрема, - і -гемолізину), позаклітинної ліпази, фібринолізину, стійкістю до антибіотиків та ін. Показано, що модифікація вмісту компонентів поживного середовища, терміну та температури культивування суттєво позначається на продукції білка А стафілококами.

Протягом останніх років почали проводитися дослідження по впливу електромагнітного випромінювання мм-діапазону нетеплової інтенсивності на різні біологічні об'єкти [Бецкий О.В 1992; Девятков Н.Д. и соавт., 1995]. Так, виявлено, що за умов дії електромагнітних хвиль мм-діапазону (4,9-7,6 мм) змінюються культуральні, біохімічні (в тому числі синтез білків) та деякі фізіологічні властивості бактерій, що знаходить практичне застосування в біології та медицині [Руденко А.В. и соавт., 1989; Реброва Т.В., 1992]. Досить розповсюдженим є використання фізичних факторів впливу (електромагнітне опромінення, ультразвук) для лікування запальних процесів різної етіології, в т.ч. і стафілококової [Брискин Б.С. и соавт., 1997]. Тому ми вважали за доцільне дослідити вплив КХЧ-випромінювання мм-діапазону та ультразвуку на патогенність стафілокока, а також на продукцію та властивості білка А як одного з основних факторів його патогенності, що могло б сприяти визначенню антигенної активності різних форм білка А та поясненню згаданого позитивного клінічного ефекту.


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.