Регуляція тироксином мієлопоезу та лімфопоезу у ранньому постнатальному періоді

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

УДК 591.133.2:612.119:612.017.1:591.147.1

Регуляція тироксином мієлопоезу та лімфопоезу у ранньому постнатальному періоді

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

БАБИЧ НАТАЛІЯ ОЛЕГІВНА

Львів 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького.

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор Тимочко Михайло Федорович, Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького;

доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович, Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького завідувач кафедри біологічної хімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця (м. Київ), кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії;

доктор біологічних наук, професор Смолянінов Борис Вікторович, Одеський державний аграрний університет, завідувач кафедри фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться “ 21 ” грудня 2001р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, ауд. 333 .

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 20 ” листопада 2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Д.І. Санагурський

тироксин мієлопоез лімфопоез постнатальний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З'ясування механізмів регуляції тироксином процесів мієлопоезу та лімфопоезу є однією з важливих проблем сучасної біології і медицини. Актуальність досліджень у цьому напрямі зумовлена зростанням в Україні частоти захворювань, пов'язаних з розладами діяльності щитоподібної залози [Касаткина и др. 1997; Пантелеев и др. 1997; Klugbauer et al. 1998; Thomas et al. 1999; Santoro et al. 2000]. В основі цих захворювань лежать функціональні порушення у багатьох ланках обміну речовин, що зумовлені впливом тиреоїдних гормонів на метаболізм клітин, в тому числі, імунокомпетентних [Павловський та співавт. 1986; Калиман 1992; Marsh, Erf 1996; Ром-Богуславская и др. 1997; Hulbert 2000]. Важливе значення мають дослідження дії тироксину на процеси лейкоцитопоезу у неонатальному періоді в зв'язку з високими концентраціями тиреоїдних гормонів у крові ссавців у ранньому постнатальному періоді [Girard, Ferre 1982; Slebodzinski 1988; Polk 1995].

Дані щодо регуляторної ролі тиреоїдних гормонів у процесах мієлопоезу і лімфопоезу, а також внутрішньоклітинних механізмів впливу тироксину на функціонування кровотворних клітин і лейкоцитів є суперечливими [Paavonen 1982; Gupta et al. 1983; Bachman, Mashaly 1987; Montecino-Rodriguez et al. 1996; 1997]. Оскільки в реалізації функціональної активності імунокомпетентних клітин важлива роль належить як синтетичним, так і енергетичним процесам в кровотворних клітинах і лейкоцитах, важливими є дослідження вмісту тиреоїдних гормонів в організмі у взаємозв'язку з обмінними, зокрема з окисно-відновними процесами в даних популяціях клітин. Відомо, що чутливість клітин до дії тироксину в значній мірі зумовлена наявністю ферменту, який каталізує перетворення молекул гормону до більш активної форми - трийодтироніну [Kohrle 1994, 2000; Braverman 1994; Larsen 1997; St.Germain 1999; Sabatino et al. 2000], однак функціональні характеристики процесу дейодування тироксину в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах тварин на даний час не з'ясовані. Тому актуальними є дослідження активності і властивостей йодотиронін-5'-дейодинази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові, що дасть можливість з'ясувати роль тироксину у формуванні імунної реактивності організму. Дослідження такого плану є особливо актуальними для виявлення впливу тироксину в ранньому постнатальному періоді як людей, так і тварин, коли часто виникають захворювання кровотворної та імунної систем [Снітинський та співавт. 1994].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідної роботи Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (бюджетна тема “Сучасні підходи до хіміотерапії раку з врахуванням системного впливу пухлини і токсичної дії цитостатиків”, ІН.18.00.001.97 № держреєстрації 0198V000870).

Мета та завдання дослідження. Вивчити регуляторний вплив тироксину на інтенсивність лейкоцитопоезу та процеси, що забезпечують функціональну активність лейкоцитів крові поросят у ранньому постнатальному періоді та з'ясувати особливості характеру дії гормону.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:

1. Вивчити регуляторний вплив тироксину на популяційний склад мієлоїдних клітин кісткового мозку і лейкоцитів крові поросят раннього віку.

2. Дослідити вплив тироксину на інтенсивність включення позначених радіоактивними мітками попередників у молекули ДНК і білків у мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу та лейкоцитах крові.

3. З'ясувати вплив тироксину на інтенсивність енергетичних процесів, процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і функціональну активність антиоксидантної системи в мієлокаріоцитах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах крові.

4. Вивчити функціональні характеристики процесу дейодування тироксину та властивості йодотиронін-5'-дейодинази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах.

Об'єкт дослідження: метаболічний і функціональний стан гемопоетичної тканини кісткового мозку та клітин крові і тимусу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді.

Предмет дослідження: механізми регуляції тироксином мієлопоезу, лімфопоезу та функціональної активності лейкоцитів крові в організмі поросят.

Методи дослідження: експериментальні фізіологічні, морфологічні, спектрофотометричні, радіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено дослідження впливу тироксину на інтенсивність процесів мієлопоезу та лімфопоезу в організмі поросят у ранньому періоді після народження. Встановлено інгібуючу дію гормону на проліферативну активність мієлоїдних попередників із стимуляцією дозрівання клітин до функціонально зрілих лейкоцитів крові та стимулюючий вплив тироксину на процес лімфопоезу. Виявлено значну чутливість ферментних систем окремих метаболічних шляхів клітин мієлоїдного ряду до впливу тироксину і меншу - в клітинах системи лімфопоезу. Показано інтенсифікацію процесів ПОЛ у процесі розвитку гіпертиреоїдного стану та активацію ферментів антиоксидантного захисту в досліджуваних клітинах на окремих етапах експерименту, що свідчить про наявність внутрішньоклітинних компенсаторних механізмів детоксикації кисневих радикалів та продуктів неповного окислення ліпідів. Вперше встановлено функціонування системи перетворення тироксину до більш активного 3,3',5-трийодтироніну в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та вивчено кінетичні характеристики йодотиронін-5'-дейодинази в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах поросят.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають фундаментальне значення для поглиблення сучасних положень стосовно ролі тиреоїдних гормонів у механізмах регуляції процесів мієлопоезу і лімфопоезу та функціональної активності лейкоцитів, функціонування системи дейодування тироксину як однієї з ланок у механізмах активації гормону для реалізації його регуляторного ефекту в клітинах кровотворної системи.

Результати досліджень впроваджені у навчальний процес кафедри біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького при вивченні механізмів дії тиреоїдних гормонів. Отримані результати можуть бути застосовані в клінічній практиці для прогнозування можливих наслідків порушень функціональної активності щитоподібної залози та для розробки ефективних засобів з метою їх корекції; для розробки імуно- і гемомодуляторів.

Особистий внесок дисертанта. Відповідно до поставленої мети і завдань автором особисто виконано всі експериментальні дослідження, проведено статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи та разом із співавторами (Тимочком М.Ф., Скляровим О.Я., Антоняк Г.Л., Сологубом Л.І. та ін.) підготовано до друку публікації за матеріалами дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи представлені на 2-ій та 3-ій міжнародних конференціях ім. Я. Парнаса (Гданськ, 1998; Львів, 2000), на 4-му міжнародному конгресі студентів-медиків (Катовіце, 1998), на 3-ій міжнародній конференції з ендокринології тварин (Брюссель, 1998), на Міжнародному з'їзді з експериментальної біології (Вашінгтон, 1999), на міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000) та на засіданнях кафедри біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (1998-2001).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 17 публікаціях, серед них 9 статей у наукових фахових виданнях та тези доповідей на наукових конференціях.

Структура і об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, описання методів досліджень, результатів досліджень, обговорення, висновків, практичних рекомендацій і списку літературних джерел із 400 найменувань. Робота викладена на 134 сторінках, ілюстрована 10 рисунками і 12 таблицями.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В експериментах використано 40 поросят віком від народження до 10-ти днів з живою масою 1-3 кілограми, отриманих від свиноматок великої білої породи. Модель гіпертиреоїдного стану створювали шляхом введення тваринам внутрішньоочеревинно тироксину (“Reanal”) в дозі 4,0 мг/кг маси через кожні 12 год починаючи з 2-ї доби після народження. Ефекти гормону вивчали при різній тривалості його дії [Кеворков, Бахметьев 1984; Сухомлинов и др. 1986; Калиман 1992]. З гемопоетичних органів та периферійної крові тварин виділяли популяції мієлоїдних клітин та лейкоцитів шляхом диференціального центрифугування клітинних суспензій [Boyum 1968; Ling, Kay 1975; Mishell, Shiigi 1980; Freshney 1987]. Для розділення клітин застосовували градієнти густини фіколу і верографіну [Harrison et al.1981; Сибирная и др. 1991]. У виділених клітинах вивчали процеси синтезу ДНК і білків за інтенсивністю інкорпорації в молекули вказаних біополімерів позначених радіоактивними позначками тимідину та суміші амінокислот [Mishell, Shiigi 1980; Вовк, Янович 1988; Karsten et al. 1994]. В лізатах досліджуваних клітин вивчали активність ферментів енергетичного обміну (гексокінази, 6-фосфофруктокінази, піруваткінази, лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази, цитохром с-оксидази) [Wharton, Tzagoloff 1967; Bergmeyer 1983] та антиоксидантної системи (cупероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази) [Pinto, Bartley 1969; Дубинина та співавт. 1983; Моин 1986], а також вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів [Мирончик 1984; Коробейников 1989]. Для з'ясування інтенсивності процесу внутрішньоклітинного перетворення тироксину до 3,3',5-трийодтироніну в гомогенатах клітин визначали активність та деякі кінетичні характеристики йодотиронін-5'-дейодиназ І та ІІ типів радіологічним методом з використанням позначеного радіоактивною міткою реверсійного ¹²⁵І-трийодтироніну (рТ₃) [Leonard, Rosenberg 1980; Jack et al. 1994].



РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вплив тироксину на вміст клітинних популяцій у кістковому мозку і крові поросят раннього віку. В процесі досліджень встановлено, що під впливом тироксину в гемопоетичній тканині кісткового мозку поросят 3-10-денного віку змінюються співвідношення між вмістом клітин окремих популяцій мієлоїдних клітин. Так, після ін'єкцій гормону в гемопоетичній тканині 5- і 10-денних поросят вірогідно зменшується відносний вміст популяцій проліферуючих клітин: мієлобластів (на 28-33%), промієлоцитів (на 38%) і мієлоцитів (31-35%), (р<0,05-0,01). Водночас у кістковому мозку поросят дослідних груп на окремих стадіях експерименту спостерігається зменшення вмісту дозріваючих і зрілих клітин гранулоцитарного ряду: паличкоядерних нейтрофільних гранулоцитів (на 26%, p<0,05) і сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів (на 33%, p<0,01). Цей ефект супроводжується інтенсифікацією вивільнення зрілих гранулоцитів у кров, що зумовлює кількісне збільшення популяції сегментоядерних клітин та загального вмісту лейкоцитів у крові 3-денних тварин (р<0,05). Водночас після введення гормону в крові поросят 3-5-добового віку вірогідно зменшується вміст метамієлоцитів (р<0,01), в зв'язку з чим показник співвідношення між вмістом популяцій молодих і зрілих форм гранулоцитопоезу в крові тварин знижується. Такий ефект свідчить про вплив тироксину на процес остаточного дозрівання мієлоїдних клітин.

Поряд із зменшенням вмісту клітинних популяцій мієлопоезу в кістковому мозку 10-денних поросят спостерігається збільшення частки лімфоїдних клітин (р<0,05), не зважаючи на те, що відносний вміст лімфоцитів у периферійній крові тварин вірогідно не змінюється. Це свідчить про стимулюючий вплив тироксину на процес лімфопоезу в кістковому мозку та підтверджує дані літератури про роль тиреоїдних гормонів у регуляції імунної функції тварин [Dardenne et al 1988; Erf 1993; Marsh, Erf 1996].

Вплив тироксину на синтез ДНК і білків у мієлоїдних клітинах, клітинах тимусу і лімфоцитах поросят у ранньому постнатальному періоді. При дослідженні впливу тироксину на синтез ДНК і білків встановлено, що дія гормону щодо інтенсивності цих процесів у клітинах систем мієлопоезу і лімфопоезу є неоднозначною. Так, у мієлоїдних клітинах кісткового мозку 10-денних поросят, яким вводили тироксин, спостерігається пригнічення синтезу ДНК при відносно стабільній інтенсивності синтезу білків (табл.1).

Таблиця 1 Інтенсивність включення мічених попередників у молекули ДНК і білків у клітинах поросят 3- і 10-денного віку (Mm, n=5)

Умови досліджень Клітини	3-денні тварини	10-денні тварини
	Контроль	Після введення Т4	Контроль	Після введення Т4
Включення 3Н-тимідину (кількість розпадів за хвилину на 108 клітин)
Мієлоїдні клітини	35948	31738	47154	32027*
Клітини тимусу	36727	31653	46050	22718*
Лімфоцити крові	24522	26031	23220	18417
Включення 14С-амінокислот (кількість розпадів за хвилину на 108 клітин)
Мієлоїдні клітини	3860340	3925603	6531518	4556453
Клітини тимусу	4280250	5497404*	4161421	4042300
Лімфоцити крові	1338109	140080	1450160	1607205

Примітка:* - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин (р<0,05).

Подібний ефект виявлено за присутності тироксину в середовищі інкубації мієлоїдних клітин (1х10^-8 М) (табл.2).

Водночас, у клітинах тимусу тварин, яким вводили тироксин до 10-денного віку, інтенсивність включення 3Н-тимідину в молекули ДНК зменшується (р<0,05), а після інкубації клітин за присутності гормону - вірогідно не змінюється. Рівень використання позначених радіоактивною міткою амінокислот при синтезі білків тимоцитів вірогідно збільшується як у клітинах, отриманих від 3-денних тварин, яким вводили тироксин, так і за присутності тироксину в середовищі інкубації клітин 10-денних поросят (р<0,05) (табл.2,3). На відміну від клітин лімфоїдного органу, інтенсивність інкорпорації мічених попередників у молекули білків і ДНК лімфоцитів крові під впливом тироксину вірогідно не змінюється, що свідчить про їх низьку чутливість до дії гормону. Однак інтенсивність інкорпорації радіоактивних попередників у молекули білків збільшується у клітинах, активованих під впливом фітогемаглютиніну (5 мкг/мл) (р<0,05) (табл.2,3).

Таблиця 2 Вплив тироксину на інтенсивність включення мічених попередників у молекули білків і ДНК у клітинах поросят 10-добового віку (кількість розпадів за хвилину на 10⁸клітин , Mm, n=5)

Умови досліджень,показник Клітини	Включення 14С-амінокислот	Включення 3Н-тимідину
	Контроль	Тироксин	Котроль	Тироксин
Мієлоїдні клітини кісткового мозку	6531518	6430400	47154	28437*
Клітини тимусу	5161340	6553415*	46050	49520
Лімфоцити крові	1450160	1448205	23220	21728
Активовані лімфо-цити (ФГА, 5 мкг/мл)	5890601	9200974*	722100	1040145

Примітка: * - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин ( р<0,05)

Аналізуючи отримані результати, необхідно відмітити, що напрямок змін інтенсивності біосинтетичних процесів у досліджуваних клітинах поросят після ін'єкцій тироксину в певній мірі залежить від дози введеного гормону. Адже відомо, що тиреоїдні гормони можуть зумовлювати як катаболічні, так і анаболічні ефекти [Greer 1990; Utiger 1995]. Крім того, певну роль в метаболічних ефектах тироксину можуть відігравати зміни у гормональному статусі тварин, зокрема, підвищення в їх крові концентрацій глюкокортикоїдів та інсуліну - регуляторів процесів синтезу білків і нуклеїнових кислот [Girard, Ferre 1982].

Вплив тироксину на окремі ланки енергетичного метаболізму в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах поросят. Результати досліджень каталітичної активності регуляторних ферментів гліколізу, клітинних дегідрогеназ і цитохром с-оксидази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах поросят 3-10-денного віку свідчать про те, що під впливом тироксину відбуваються зміни у співвідношеннях між інтенсивністю протікання окремих стадій енергетичного метаболізму (табл.3).

Таблиця 3 Вплив тироксину на активність ферментів у мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофільних гранулоцитах поросят 3-10-денного віку (M m, n=5)

Ферменти	3 дні	10 днів
	Контроль	Введення тироксину	Контроль	Введення тироксину
Мієлоїдні клітини кісткового мозку
Гексокіназа	20,50 1,16	23,44 1,48	16,50 1,20	11,39 0,42
6-Фосфофруктокіназа	93,2 12,3	376,2 22,3***	154,4 21,7	180,8 14,7
Лактатдегідрогеназа	157,0 8,0	195,7 8,3*	78,5 6,8	76,3 7,1
Цитохром с-оксидаза	2,94 0,15	12,56 0,75***	3,58 0,32	8,03 0,79***
Нейтрофільні гранулоцити
Гексокіназа	3,53 0,41	7,15 0,59**	7,74 0,41	7,98 0,53
6-Фосфофруктокіназа	89,9 4,5	117,4 7,9*	133,2 5,2	154,0 12,8
Лактатдегідрогеназа	37,6 2,1	75,3 7,9**	166,5 9,9	135,2 9,2
Цитохром с-оксидаза	3,28 0,14	3,76 0,40	4,35 0,51	5,83 0,27*

Примітки: 1) активність гексокінази виражали в нмоль NADP/хв на 1 мг білка; 6-фосфофруктокінази, лактатдегідрогенази - в нмоль NADH/хв на 1 мг білка; цитохром с-оксидази - в умовних одиницях на 1 мг білка; 2) у цій і наступній таблицях *,**,*** - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Так, на початкових стадіях досліджень спостерігається підвищення активності гліколітичних ферментів: 6-фосфофруктокінази і лактатдегідрогенази у мієлоїдних клітинах, а в нейтрофільних гранулоцитах - гексокінази, 6-фосфофруктокінази і лактатдегідрогенази (р<0,05-0,001).

На кінцевій стадії експерименту - в клітинах 10-денних тварин функціональна активність ферментів гліколізу знижується до контрольних значень, що, очевидно, зумовлюється більш виразною активацією процесів окислювального катаболізму субстратів. На збільшення активності окисних процесів вказують дані щодо активації цитохром с-оксидази в мієлоїдних клітинах поросят протягом всього періоду досліджень, а в нейтрофільних гранулоцитах - у 5- і 10-денних тварин. Такий ефект, очевидно, свідчить про стимулюючий вплив тироксину на синтез молекул цитохром с-оксидази в мієлокаріоцитах, подібно до інших клітин організму, в яких гормон є позитивним регулятором експресії гена ферменту [Wiesner et al. 1992].

Встановлено, що тироксин впливає на активність енергетичних процесів і в лімфоїдних клітинах, на що вказує вірогідне підвищення активності піруваткінази та ізоцитратдегідрогенази в тимоцитах 10-денних поросят, яким вводили гормон (р<0,05).

Відомо, що інтенсифікація під впливом тироксину окисних процесів веде до підвищення концентрацій реакційноздатних продуктів неповного відновлення кисневих молекул у клітинах [Storz et al. 1990; Зенков, Меньщикова, 1993; Rosen et al. 1995; Тимочко та ін. 1998]. В зв'язку з цим важлива роль у захисті від окислення білкових компонентів внутрішньоклітинних плазматичних мембран та інших клітинних структур належить системі антиоксидантного захисту клітин. Згідно до результатів досліджень, після ін'єкцій тироксину активність одного з основних ферментів-антиоксидантів - супероксиддисмутази - на окремих стадіях експерименту збільшується в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і в нейтрофільних гранулоцитах тварин дослідних груп (табл.2). Активація цього ферменту узгоджується з даними інших дослідників, згідно з якими підвищення вмісту активних форм кисню в клітині супроводжується адаптаційним синтезом ферментів-антиоксидантів [Storz et al. 1990; Pahl, Baeuerie 1994; Sen, Packer 1996]. Водночас, в активності ферментів глутатіонової системи клітин тварин, яким вводили тироксин, спостерігаються протилежні зміни. Так, активність глутатіонпероксидази знижується в мієлокаріоцитах кісткового мозку, тимоцитах і нейтрофілах крові 10-денних поросят дослідної групи (р<0,05), глутатіонредуктази - в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофілах тварин (р<0,05).

Що стосується процесів ПОЛ, то на початкових стадіях вміст малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів зменшується в мієлоїдних клітинах і нейтрофільних гранулоцитах 3-денних поросят (р<0,05-0,01). При розвитку гіпертиреоїдного стану (у 10-денних тварин) активність ПОЛ є стабільною в усіх досліджуваних клітинах, за винятком нейтрофілів, де концентрації малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів збільшуються під впливом гормону (р<0,05-0,01) (табл.4).

Очевидно, в умовах зниження активності глутатіонзалежних ферментів активація супероксиддисмутази в клітинах відіграє компенсаторну роль у детоксикації кисневих радикалів, які є ініціаторами процесів пероксидації ліпідних молекул. Це сприяє підтриманню інтенсивності ПОЛ на стабільному рівні. Разом з тим, у нейтрофільних гранулоцитах низька активність глутатіонпероксидази на тлі активації окисних процесів може зумовлювати виникнення дисбалансу між рівнем утворення кисневих радикалів і активністю захисних механізмів, що веде до нагромадження в цих клітинах продуктів пероксидації ліпідних сполук.



Таблиця 4 Вплив тироксину на активність антиоксидантних ферментів і вміст продуктів ПОЛ в клітинах систем мієлопоезу і лімфопоезу 10-денних тварин (M±m; n=5)

Умови до-сліджень	Супероксид-дисмутаза	Глутатіонпероксидаза	Глутатіонредуктаза	Малоновий діальдегід	Гідроперекиси ліпідів
Мієлоїдні клітини кісткового мозку
Контроль	18,25±1,38	40,34±1,76	32,70±1,56	12,28±0,67	0,105±0,01
Тироксин	26,27±2,10*	32,2±1,5*	22,5±1,5*	15,93±1,85	0,126±0,01
Нейтрофільні гранулоцити
Контроль	20,68 1,50	21,4 1,1	29,2 1,8	11,37±0,75	0,112±0,01
Тироксин	28,5 1,7*	16,7 1,0*	20,5 1,0*	17,1±0,7**	0,17±0,02*
Клітини тимусу
Контроль	7,70 0,40	44,803,15	18,55 1,30	7,54 0,48	0,1800,01
Тироксин	20,3 2,7*	27,6 2,9*	24,9 3,5*	12,652,61	0,1750,02
Лімфоцити
Контроль	16,28 0,93	24,021,67	25,700,85	7,40 0,55	0,1040,01
Тироксин	15,30 1,62	25,31 2,45	20,441,64	10,581,38	0,0830,01

Примітка: активність супероксиддисмутази виражали в умовних одиницях в перерахунку на 1 мг білкa; глутатіонпероксидази - в нмоль глутатіону / хв на 1мг білка; глутатіонредуктази - в нмоль NАDН / хв на 1 мг білка, вміст малонового діальдегіду виражали в нмоль/10⁸ клітин, вміст гідроперекисів ліпідів - в од.Е480/5^.10⁸ клітин.

Характеристика процесу дейодування йодотиронінів у мієлоїдних клітинах і лейкоцитах поросят. При дослідженні процесу 5'-дейодування йодотиронінів у мієлокаріоцитах кісткового мозку і лейкоцитах поросят 10-денного віку встановлено домінування у вказаних клітинах йодотиронін-5'-дейодинази ІІ типу (Д2). Встановлено, що інтенсивність дейодування йодотиронінів у клітинних гомогенатах є залежною від часу інкубації зразків, концентрацій білка в гомогенаті, субстрату реакції ¹²⁵І-рТ₃ та донаторів сульфгідрильних груп.

При концентраціях білка 5-20 мкг/мл залежність є лінійною і виражається формулами y=0,042x та y=0,036x для мієлоїдних клітин і нейтрофільних гранулоцитів,відповідно(рис.1).

Рис.1 Залежність інтенсивності процесу йодотиронін-5'-дейодування від концентрації білка в пробах мієлоїдних клітин кісткового мозку і нейтрофільних гранулоцитів поросят

Залежність інтенсивності йодотиронін-5'-дейодування від часу інкубації є лінійною в досліджуваних клітинах в інтервалі 0-60 хвилин і виражається формулами y=1,7x (для мієлоїдних клітин) (рис.2а) та y=1,53x (для нейтрофільних гранулоцитів) (рис.2б).

Залежність активності йодотиронін-5'-дейодинази мієлоїдних клітин і нейтрофільних гранулоцитів від концентрації рТ3 характеризується гіперболічною кривою (рис.3).

Водночас активність ферменту залежить від концентрації донатора сульфгідрильних груп - дитіотреітолу або глутатіону (табл.5).

Рис. 2 Залежність процесу 5'-дейодування ¹²⁵І-субстрату від часу інкубації

Таблиця 5 Активність процесу йодотиронін-5'-дейодування в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофільних гранулоцитах поросят при застосуванні сульфгідрильних реагентів (n=5)

Застосована сполука	Концентрація	Активність йодотиронін-5'-дейодинази (%)
		Мієлоїдні клітини	Нейтрофільні гранулоцити
Дитіотреітол	10 мМ	100	100
	1 мМ	58	57
	0,1 мМ	44	41
Відновлений глутатіон	10 мМ	42	20
	5 мМ	40	18
	1 мМ	35	10

Встановлено, що кінетичні характеристики йодотиронін-5'-дейодиназ у клітинах мієлоїдного ряду є близькими до таких, що виявлені у клітинах деяких тканин іншими авторами [Leonard 1990; Kцhrle 1994]. При цьому V_max і K_m становлять, відповідно, 6,71±0,50 пмоль рТ₃/хв на 1 мг білка і 0,94±0,08 мкМ в мієлоїдних клітинах та 5,00±0,42 пмоль рТ₃/хв на 1 мг білка і 0,78±0,12 мкМ в нейтрофільних гранулоцитах.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Таким чином, результати досліджень вказують на те, що тироксин, який виявляє регуляторний вплив на багатьох рівнях метаболізму в організмі тварин і людини, відіграє важливу роль у регуляції обмінних процесів у клітинах систем мієлопоезу та лімфопоезу. В клітинах мієлоїдного ряду цей гормон активує процеси енергетичного метаболізму, проте знижує функціональну активність глутатіон-залежних ферментів-антиоксидантів. Така метаболічна ситуація в клітинах може виявлятися в дисбалансі між рівнем утворення кисневих радикалів та активністю захисних механізмів, зумовлюючи розвиток оксидаційного стресу [Кения и др.1993; Dice 1993; Тимочко та співавт. 1998; Sies 1997]. Так, тривале введення тироксину веде до нагромадження проміжних і кінцевих продуктів перекисного окислення ліпідів у нейтрофільних гранулоцитах, що, очевидно, знижує функціональну активність клітин.

Разом з тим, розвиток гіпертиреоїдного стану в організмі тварин раннього віку супроводжується зниженням проліферативної активності мієлоїдних клітин та підвищенням інтенсивності їх дозрівання до функціонально активних клітин крові. Такий ефект, очевидно, в значній мірі зумовлюється інгібуючим впливом тироксину на процес синтезу молекул ДНК в мієлокаріоцитах. Проте, при аналізі молекулярних механізмів впливу тироксину на мієлопоез необхідно приймати до уваги низку ефектів, які мають місце при навантаженні організму тварин раннього віку екзогенним гормоном, зокрема: зміни в гормональному статусі тварин, динаміку рецепції мієлоїдними клітинами інших регуляторів і, відповідно - перебудову численних ланок у механізмах регуляції метаболічних процесів в мієлокаріоцитах [Goetzl, Sreedharan 1992; Акмаев 1997; Mandrup-Poulsen et al 1997]. Разом з тим, безпосередні і опосередковані ефекти тироксину в клітинах мієлоїдного ряду дають підставу стверджувати про участь тиреоїдних гормонів у регуляції процесів кровотворення у тварин в ранньому постнатальному періоді онтогенезу. Важливу роль у механізмах регуляторного впливу тироксину на метаболізм мієлоїдних клітин відіграє система конверсії гормону до трийодтироніну, основним компонентом якої є фермент йодотиронін-5'-дейодиназа [Babych et al 1999].

Що стосується системи лімфопоезу, то функціональна активність лімфоїдних клітин залежить від поєднаного впливу багатьох чинників, що зумовлюється наявністю в них широкого спектру рецепторів гормонів, нейромедіаторів і цитокінів [Coffey, Hadden 1985; Корнева, Шхинек 1988; Духанин 1990]. Згідно до даних літератури, гормони щитоподібної залози належать до регуляторів метаболізму в імуноцитах, проте результати окремих експериментальних робіт є суперечливими. Так, в ряді досліджень встановлено, що видалення щитоподібної залози веде до лімфопенії та зниження активності гуморальних імунних реакцій [Fabris 1973; Hsu et al 1976; Erf 1993], а самі тиреоїдні гормони виявляють стимулюючий вплив на процеси В-лімфопоезу [Balazs et al 1980, Keast et al 1980, Montecino-Rodriguez et al 1996]. В інших роботах показано, що введення тваринам тироксину зумовлює зниження інтенсивності синтезу антитіл та пригнічення проліферативної відповіді лімфоїдних клітин на дію мітогенів [Wall et al 1981; Gupta et al 1983; Ong et al 1986]. Таким чином, на даний час нема одностайної думки відносно впливу гормонів щитоподібної залози на імунну систему.

В наших дослідженнях встановлено, що під час неонатального періоду розвитку тироксин стимулює процеси енергетичного обміну як у клітинах тимусу, так і в мієлоїдних клітинах поросят. Однак, в зв'язку з активуючим впливом тироксину на активність антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази і глутатіонредуктази, антиоксидантний статус клітин лімфоїдного органу тварин, яким вводили гормон, є вищим, ніж у мієлокаріоцитах і нейтрофільних гранулоцитах. Очевидно, при високих концентраціях тиреоїдних гормонів у крові тварин під час неонатального періоду цей ефект сприяє підтриманню функціональної активності клітин імунної системи на відповідному рівні. Водночас регуляторні ефекти тироксину щодо енергетичного обміну та антиоксидантної системи разом зі стимулюючим впливом на синтез білків в імуноцитах можуть частково пояснювати роль стимулюючого впливу тиреоїдних гормонів на процеси лімфопоезу [Balazs et al 1980; Paavonen 1982; Gupta et al 1983; Bachman and Mashaly 1987; Montecino-Rodriguez 1997].



ВИСНОВКИ

Згідно з поставленими завданнями проведено дослідження впливу тироксину на процеси мієлопоезу та лімфопоезу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді. Встановлено, що тироксин бере участь у регуляції процесів лейкоцитопоезу та метаболізму в клітинах системи гемолімфопоезу.

1. Під впливом тироксину в кістковому мозку 5- і 10-денних поросят зменшується відносний вміст проліферуючих клітин (мієлобластів, промієлоцитів, мієлоцитів), паличкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів. Водночас вміст лімфоцитів в кістковому мозку 10-денних поросят збільшується, порівняно з таким у тварин контрольної групи.

2. Під впливом тироксину збільшується інтенсивність синтезу білків у тимоцитах і пригнічується інтенсивність включення ³Н-тимідину в молекули ДНК мієлоїдних клітин кісткового мозку поросят.

3. У мієлоїдних клітинах кісткового мозку, тимоцитах і нейтрофільних гранулоцитах тварин раннього віку тироксин стимулює процеси енергетичного обміну, зумовлюючи в мієлоїдних клітинах активацію 6-фосфофруктокінази і лактатдегідрогенази у 3- і 5-денних поросят, цитохром с-оксидази у 3-, 5-, 10-денних тварин; в нейтрофільних гранулоцитах - активацію гексокінази, 6-фосфофруктокінази і лактатдегідрогенази у 3- і 5-денних, а цитохром с-оксидази - у 5- і 10-денних тварин; в тимоцитах - активацію піруваткінази та ізоцитратдегідрогенази у 10-денних тварин.

4. Тироксин зменшує активність ПОЛ в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і крові тварин 3-денного віку, збільшує інтенсивність цього процесу у нейтрофільних гранулоцитах 10-денних тварин і не впливає на інтенсивність ПОЛ в тимоцитах поросят раннього віку.

5. Тироксин зумовлює активацію супероксиддисмутази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофільних гранулоцитах 5- і 10-денних поросят, в тимоцитах 10-денних тварин, проте пригнічує активність глутатіонзалежних ферментів у мієлоїдних клітинах і нейтрофільних гранулоцитах 5- і 10-денних поросят, глутатіонпероксидази - в тимоцитах 10-денних тварин.

6. Дія тироксину на функціональну активність лейкоцитів і кровотворних клітин опосередковується функціонуванням системи конверсії тироксин трийодтиронін та активністю йодотиронін-5'-дейодинази. В мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові активність йодотиронін-5'-дейодинази представлена головним чином ферментом ІІ типу. Активність йодотиронін-5'-дейодиназної реакції в клітинах значною мірою залежить від концентрації субстрату і донаторів сульфгідрильних груп - дитіотреітолу або відновленого глутатіону.

7. Кінетичні характеристики (V_max і K_m) йодотиронін-5'-дейодинази в клітинах мієлоїдного ряду поросят становлять, відповідно, 6,71±0,50 пмоль рТ₃/хв на 1мг білка і 0,94±0,08 мкМ в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та 5,00±0,42 пмоль рТ₃/хв на 1 мг білка і 0,78±0,12 мкМ в нейтрофільних гранулоцитах.



ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Результати досліджень можуть бути використані при розробці тиреотропних препаратів, адаптогенів, гемо- та імуномодуляторів, можуть бути застосовані в клінічній практиці для прогнозування можливих наслідків порушень функціональної активності щитоподібної залози.

2. Отримані результати можуть бути використані у вищих навчальних закладах в курсах лекцій з цитології, гематології, молекулярної біології, біохімії гормонів.



СПИСОК ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тимочко М.Ф., Снітинський В.В. Вплив тироксину на енергетичний метаболізм в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та лейкоцитах крові поросят //Вісник проблем біології і медицини. - 1998. - 22. - С.33-37.

2. Антоняк Г.Л. Снітинський В.В., Бабич Н.О. та ін. Характеристика окремих ланок енергетичного метаболізму та антиоксидантної системи в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах поросят //Укр. біохім. журн. - 1999. - 71, №3. - С.44-50.

3. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тимочко М.Ф., Снітинський В.В. Вплив тироксину на активність ферментів енергетичного обміну та антиоксидантної системи в нейтрофільних гранулоцитах поросят //Фізіол. журн. - 2000. - 46, № 3. - С.84-91.

4. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тымочко М.Ф. Влияние тироксина на активность некоторых ферментов энергетического обмена в миелоидных клетках костного мозга и нейтрофилах крови поросят // Вопросы медицинской химии. - 2000. - 46, Вып.2. - С.162-168.

5. Babych N., Antonyak Y., Sklyarov A.Ya. The influence of thyroxine on intensity of energy metabolism in bone marrow myeloid cells and neutrophilic polymorphonuclear leukocytes of neonatal pig //Endocrine regulations. - 2000. - 34. - P.73-81.

6. Бабич Н.О., Скляров О.Я., Антоняк Г.Л. Вплив тироксину на вміст клітинних популяцій у кістковому мозку і крові поросят у неонатальному віці // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2000. - 2, №10. - С.28-32.

7. Антоняк Г.Л., Игнатенко Ю.В., Бабич Н.О., Снитинский В.В. Структура и функции рецепторов тиреоидных гормонов //Цитология и генетика. - 2000. - 34, №5. - С.68-80.

8. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Утворення активних форм кисню та система антиоксидантного захисту в організмі тварин //Біологія тварин. - 2000. - 2, № 2. - С.34-43.

9. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Структура і функції високомолекулярних протеїназ в клітинах тварин і людини //Укр. біохім. журн. - 2001. - 73, № 1. - С.5-16.

10. Babych N., Antonyak H., Tymochko M., Slebodzinski A.B. The developmental changes in thyroxine deiodinating system in animal myeloid cells and leukocytes /Abstrасt. The 2nd Parnas Conference. Gdansk, Poland. Sept.11-13, 1998.- P. 33.

11. Babych N. The participation of thyroxine 5'-deiodinating system in the regulatory mechanisms of haemopoiesis /Congress book of 4^th International Medical Students Congress (Nov. 5-8, 1998. Katowice, Poland).

12. Babych N., Antonyak H., Snitynsky V., Tymochko M., Solohub L., Slebodzinski A.B. The participation of iodothyronine-5'-deiodinase in the regulatory mechanisms of myelopoiesis and immunogenesis / Abstracts of the 3^rd International Conference on Farm Animal Endocrinology (Dec. 7-10, 1998. Brussels, Belgium).

13. Babych N., Antonyak H, Tymochko M., Snitynski V. The participation of thyroid hormone in regulation of myeloid and lymphoid cell metabolism / Abstracts of the 3^rd International Conference on Farm Animal Endocrinology (Dec. 7-10, 1998. Brussels, Belgium).

14. Babych N., Antonyak H., Sklyarov A. Ya. Developmental switches in the functioning of iodothyronine-5'-deiodinase in haemopoietic tissue /Abstracts of Experimental Biology Meeting '99. (April 17-21, 1999. Washington, USA). //FASEB J. - 1999. - 13, N 5. - A1039.

15. Babych N., Antonyak H., Lacka K., Sklyarov A. Ya., Trzeciak W.H. Type 2 iodothyronine deiodinase mRNA levels in human peripheral blood lymphocytes of hypo- and hyperthyroid patients /Abstract. The 3^rd Parnas Conference "Mechanisms of Cellular Signal Transduction and Communication". - Lviv, Ukraine. Oct. 14-18, 2000. - P.64.

16. Babych N., Antonyak H., Lecybyl R., Lacka K, Sklyarov A. Ya., Trzeciak W.H. Thyroid hormone regulates type 2 iodothyronine deiodinase mRNA levels in cultured human peripheral blood lymphocytes /Abstract. The 3^rd Parnas Conference "Mechanisms of Cellular Signal Transduction and Communication". - Lviv, Ukraine. Oct.14-18, 2000. - P.65.

17. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Роль гормонів і цитокінів в адаптаційних змінах метаболізму в клітинах системи гемопоезу у тварин в неонатальному періоді розвитку /Тези доповіді. Міжнародний симпозіум “Біологічні механізми старіння”. Харків, 2000. - С.102.



АНОТАЦІЇ

Бабич Н.О. Регуляція тироксином мієлопоезу та лімфопоезу у ранньому постнатальному періоді. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. - фізіологія людини і тварин. - Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2001.

Проводились дослідження механізмів участі тироксину в регуляції процесів мієлопоезу і лімфопоезу в організмі поросят протягом 10-денного періоду після народження. Встановлено, що при розвитку гіпертиреоїдного стану в кістковому мозку тварин зменшується відносний вміст проліферуючих і дозріваючих клітин мієлоїдного ряду водночас з пригніченням інтенсивності інкорпорації ³Н-тимідину в молекули ДНК мієлоїдних клітин. Під впливом гормону в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і нейтрофільних гранулоцитах активуються енергетичні процеси, відбуваються зміни в інтенсивності ПОЛ та у функціональному стані системи антиоксидантного захисту. Дія тироксину на функціональну активність лейкоцитів і кровотворних клітин опосередковується функціонуванням системи конверсії тироксин трийодтиронін та активністю йодотиронін-5'-дейодинази, яка в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах представлена, головним чином, ферментом ІІ типу. Встановлено кінетичні характеристики йодотиронін-5'-дейодиназної реакції в клітинах мієлоїдного ряду кісткового мозку і крові, залежність активності ферменту від донаторів сульфгідрильних груп - дитіотреітолу або відновленого глутатіону.

Ключові слова: лейкоцитопоез, мієлопоез, лімфопоез, імунна система, тироксин, тиреоїдні гормони, йодотиронін-5'-дейодиназа.



БАБИЧ Н.О. Регуляция тироксином миелопоэза и лимфопоэза в раннем постнатальном периоде. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2001.

Проводились исследования механизмов участия тироксина в регуляции процессов миелопоэза и лимфопоэза в организме поросят на протяжении 10-дневного периода после рождения. Показано, что при развитии гипертиреоидного состояния в костном мозгу животных уменьшается относительное содержание пролиферирующих и созревающих клеток миелоидного ряда одновременно со снижением интенсивности включения ³Н-тимидина в молекулы ДНК миелоидных клеток. Под влиянием гормона в миелоидных клетках костного мозга, клетках тимуса и нейтрофильных гранулоцитах активируются энергетические процессы, происходят изменения в интенсивности ПОЛ и в функциональном состоянии системы антиоксидантной защиты. Влияние тироксина на функциональную активность лейкоцитов и кроветворных клеток опосредствуется функционированием системы конверсии тироксин трийодтиронин и активностью йодотиронин-5'-дейодиназы, которая в миелоидных клетках и лейкоцитах представлена, главным образом, ферментом ІІ типа. Установлены кинетические характеристики йодотиронин-5'-дейодиназной реакции в клетках миелоидного ряда костного мозга и крови, зависимость активности фермента от донаторов сульфгидрильных групп - дитиотреитола или восстановленного глутатиона.

Ключевые слова: лейкоцитопоэз, миелопоэз, лимфопоэз, иммунная система, тироксин, тиреоидные гормоны, йодотиронин-5'-дейодиназа.



BABYCH N.O. Regulation of myelopoiesis and lymphopoiesis in the early postnatal period by thyroxine. - Manuscript.

The thesis is subjected for the granting of a degree for a candidate оf biological sciences with speciality 03.00.13 - human and animal physiology. - The Lviv National University, Lviv 2001.

The mechanisms of thyroxine participation in regulation of myelopoiesis and lympohopoiesis in the pig during 10-day period after birth were investigated. It was established, that during development of hyperthyreoid state the percentages of proliferating and maturing myeloid cells in bone marrow decreased simultaneously with inhibition of ³Н-thymidine incorporation to myeloid cell DNA molecules. Thyroxine promotes the activation of energy processes, changes in lipid peroxidation intensity and alterations in antioxidant system state in thymocytes, myeloid cells of bone marrow and blood. The action of thyroxine is mediated by functional activity of iodothyronine-5'-deiodinase, which is presented in myeloid cells and leukocytes mainly by the II type of enzyme. The kinetics of iodothyronine-5'-deiodinase reaction and dependence of enzyme activity on concetrations of sulfhydryl reagents (dithyotreithol or reduced glutathione) are established.

Key words: leukocytopoiesis, myelopoiesis, lymphopoiesis, immune system, thyroxine, thyroid hormones, iodothyronine-5'-deiodinase.

Размещено на Allbest.ru