Вивчення впливу гіпоксії та оксиду азоту на кальцієві струми сенсорних нейронів мишей
Роль оксиду азоту та пероксинітриту на гіпоксичне пошкодження нервових клітин. Вплив на кальцієві канали мишей через активацію гуанілатциклази та підвищення синтезу циклічного гуанізінмонофосфату. Оборотне інгібування як наслідок нейронів гіпоксії.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 05.01.2014 |
| Размер файла | 64,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національна академія наук
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
14.03.03 - Нормальна фізіологія
Вивчення впливу гіпоксії та оксиду азоту на кальцієві струми сенсорних нейронів мишей
Соловйова Наталія Анатоліївна
Київ 1999
Дисертацією э рукопис
Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
Науковий керівник: академік НАН України Костюк Платон Григорович
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, завідуючий відділом експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, академік Мойбенко Олексій Олексійович
доктор біологічних наук, заступник директора Інституту біохімії ім. О.М. Палладіна Косткрін Сегрій Олексійович
Провідна установа: кафедра нормальної фізіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця
Захист відбудеться “22” червня 1999 р. о “14-00” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-96.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою:: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інститутку фізіології ім. О.О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4
Автореферат розісланий “21” травня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна
1. Загальна характеристика роботи
азот гіпоксичний нервовий кальцієвий
Актуальність проблеми. Висока чутливість клітин центральної нервової системи (ЦНС) до гіпоксії/ішемії загальновідома. Іноді навіть короткочасні зміни співвідношення між постачанням та витратами кисню приводять до необоротних порушень функцій нейронів, які страждають в певній мірі через вплив надлишку оксиду азоту (NO) та споріднених сполук, що утворюються, на іонні канали плазматичної мембрани та внутрішньоклітинну сигналізацію. Такі порушення функцій нейронів зумовлені цілою низкою явищ і продукція оксиду азоту (NO) є одним з компонентів у їх послідовності. Є загально прийнятим, що загибель нейронів при ішемії та гіпоксії в більшості випадків пов'язана з активацією NMDA рецепторів, активацією кальцієвих каналів та зумовленим цим перенавантаженням цитоплазми клітин іонами кальцію. Наступна активація кальцій-залежних синтаз оксиду азоту веде до підвищення внутрішньоклітинної концентрації NO. Тому вважається, що медіатором такого аноксичного, NMDA - опосередкованого пошкодження нейронів є оксид азоту або родукт його взаємодії з супероксиданіоном, пероксинітрит (ONOO-).
В значно меншому ступені вивчено вплив нестачі кисню на нейрони периферичної системи, зокрема, на сенсорні нейрони або нейрони задньо-корінцевих гангліїв (ЗКГ), що забезпечують передачу сенсорної інформації від рецепторів до структур ЦНС. Такі експериментальні дані нечисленні та, в кращому випадку, дають феноменологічний опис явища без деталізації його клітинних механізмів.
Мета роботи полягала у вивченні можливості участі оксиду азоту та одного з його метаболітів - пероксинітриту у механізмах гіпоксичного пошкоження нейронів задньо-корінцевих гангліїв мишей.
Головні задачі дослідження:
1. Вивчити вплив зниження оксигенації та блокади окислювального фосфорилування на низьно- (НПК) та високопорогові (ВНК) кальцієві канали в нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей.
2. Вивчити вплив аутентичного оксиду азоту, його донорів та пероксинітриту низько- та високопорогові кальцієві канали в нейронах ЗКГ мишей.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчена дія аутнтичного оксиду азоту та його похідного - пероксинітриту - на низькопорогові та високопорогові кальцієві канали в нейронах ЗКГ мишей. Вивчено вплив різних донорів оксиду азоту на НПК та ВПК в нейронах ЗКГ мишей. Встановлено, що ці два типи каналів в більшості нейронів середнього діаметру ЗКГ мишей мають високу резистентність до гіпоксії та, волдночас, всі вони є високочутливими до аутентичного NO. Продемонстровано, що поряд з нейронами, кальцієві струми яких є резистентними гіпоксії, ЗКГ мишей містять також незначну кількість нейронів, кальцієві канали яких чутливі до зниження стуненю оксигенації зовнішнього розчину. В таких нейронах нестача кисню приводить до оборотного інгібування низько- та високопорогових кальцієвих струмів. Вперше показано, що пероксинітрит необоротно блокує обидва типи вищезгаданих струмів.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження суттєво доповнюють сучасні уявлення про механізми участі NO та одного з його похідних - пероксинітриту - в регуляції кальцієвогоо гомеостазу в Подальші дослідження чутливості НПК та ВПК до фармакологічних речовин в умовах зниженої оксигенації можуть привести до виявлення лікарських засобів, що впливають на виживання нейронів при їх ішемічному пошкодженні.
Особистий внесок здобувача. Приготування фериентативно ізольованих нейронів ЗКГ мишей та всі електорфізіологічні експерименти по дослідженню впливу оксиду азоту та гіпоксії на кальцієві струми були виконані автором особисто. Здобувач брав активну участь у обговоренні результатів та формулюванні висновків.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладались та обговорювались на семінарах Інституту фізіології ім. О.О, Богомольця НАН України (1996-!998 рр.), XV з`їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), конференції фізіологічного товариства Великобританії (Ліверпуль, 1998).
Публікації. За результами роботи опубліковано три статті та тези двох доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, метеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та вступу використаних джерел зі 162 найменувань. Робота викладена на 105 сторінках та ілюстрована 11 рисунками.
2. Основний зміст дисертації
Матеріали та методи досліджень.
В експериментах використовувались нелінійні миші віком 4 тижні, що утримувались на стандартій лабораторній дієті.
Метод ферментативного виділення нейронів ЗКГ. Після ефірного наркозу та декапітації тварин виділяли грудні та крижові задньо-корінцеві ганглії в чашку Петрі з охолодженим до +4С модифікованим розчином Тироде такого складу (в мМ): NaCl - 140, KCl - 4, MgCl2 - 2, CaCl2 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10 (рН = 7.4). Після цього ганглії переносили у флакон з 2 мл підігрітого до 36С розчину такого ж складу із додаванням 1 мл/мг протеази (типXIV, Sigma, США) та 1 мг/мл колагенази (Wortington, США) та витримували в термостаті при вказаній температурі на протязі 11 хвилин, після чого 10 хвилин відмивали в безферментному розчині. Для отримання клітинної суспензії ганглії дисоціювали за допомогою оплавлених Пастерівських піпеток. Отриману суспензію переносили в експериментальну камеру та витримували в термостаті при 36С на протязі 1 години для прикріплення клітин до дна камери.
Електрофізіологічні вимірювання.
Реєстрацію кальцієвих струмів мембрани ізольваних нейронів проводили методом фіксації потенціалу (“петч-клемп”) в конфігурації “цілі клітина”, використовуючи скляні мікропіпетки, що виготовлялись у дві стадії за описаною методикою (Neher & Sakmann, 1976; Neher et al., 1978; Hamill et al., 1981). CsCl - 130, TEACl - 20, MgCl2 - 5, ATP - 5, EGTA - 2, BAPTA - 2, HEPES - 10 (рН - 7.3). Для виключення натрієвих струмів іони натрію заміщували іонами холіна хлоріду. Після заповнення мікропіпетки внутрішньоклітинним розчином її опір складав 2-3 МОм. Для сепарації НПС та ВПС були використані відповідні експериментальні протоколи. НПС, що швидко інактивується, отримували шляхом деполяризації мембраник клітини до -35 мВ від підтримуючого потенціалу -80 мВ, а ВПС - шляхом деполяризації до 0 мВ від підтримуючого потенціалу -50 мВ. Через камеру постійно проходив зовнішньоклітинний розчинзі швидкістю 0.5 - 1 мл/хв та з температурою 36С. Послідовний опір компенсувався апаратно на 50-70%. Вихідний сигнал підсилювача фільтрували на частоті зрізу 2 кГц за допомогою 4-полюсного фільтра Беселя. Збір даних та їх аналіз виконувались за допомогою пакетів програм рСlamp, версія 6.0.3 (Axon Instruments Inc., США), Origin, версія 4.0 (MicroCal software, США).
Методи вимірювання напруги кисню в розчинах. Для вимірювання рО2 в експериментальній камері та буферних розчинах використовувались стандартні полярографічні методи. До рабочої камери був прилаштований відкритий сферичний платиновий електрод діаметром 100 мкм та хлорсрібний індиферентний електрод. Як полярограф, використовувався прилад LP-7Е (Чехословакія). Також вимірювання рО2 в розчинах виконувалось за допомогою газового аналізатора АВС-1 (данія) з використанням закритого прлатинового електрода тина Кларка.
Методи вимірювання концентрації оксиду азоту в розчинах. Вимір концентрації NО в буферних розчинах проводився за допомогою ISO-NO-метра фірми World Precision Instruments Inc. (США) з мембранним NO-сенсором діаметром 2 мм. Принцип виміру концентрації оксиду азоту зоснований на амперометричному методі: NO шляхом дифузії проходить через селективну мембрану електрода-сенсора, де окислюється на робочому електроді, що і приводить до появи електричного струму, амплітуда якого пропорціональна концентрації NO в розчині.
Метод приготування аутентичного оксиду азоту. В експериментах був використаний водний розчин газоподібного NO (такий NO іменують аутентичним на відміну від того, що одержується з речовин - донорів). Для приготування водного розчину NO через герметичний флакон (20 мл) протягом 30 хв продували 99% NO. Потім цей флакон заповнювали 20 мл деіонізованої та деоксигенованої води, після чого 5 мл газоподібного NO за допомогою шприця ін'єктували в цей об'єм води, отримуючи таким чином розчин NO, концентрація якого становила близько 3 мМ.
Синтез пероксинітритів. Для приготування базового розчину пероксинітриту використовувались наступні розчини: 1) розчин А, 0.6 М NaNO3; 2) розчин В, 0.72 М Н2О2 + 0.68 М HCl; 3) розчин С, 1.25 М NaOH. Після змішування підсумковий розчин оброблявся порошком окису магнія та фільтрувався. Концентрація пероксинітриту в середньому дорівнювалася 140 20 мМ. Базовий розчин розводився безпосередньо перед додаванням в робочу камеру.
Результати досліджень
Розподіл нейронів задньо-корінцевих гангліїв за розмірами.
На рис.1 зображена гістограма розподілу за розмірами нейронів ферментативно ізольованих нейронів ЗКГ. Апроксимація даної гістограми функцією Гауса (пунктирна лінія на рисунку) дозволила виявити три групи клітин з середніми розмірами 29, 40 та 51 мкм, що добре узгоджується з даними інших авторів (Scroggs & Fox, 1992). Для експериментів відбиралися клітини, розміри яких були близькі до вищезгаданої середньої величини - 40 мкм. Їх умовно називали середніми. Значення потенціалу спокою таких нейронів знаходились у межах від -75 мВ до -50 мВ. В клітинах цієї групи реєструвались як низькопорогові (НПС) так і високопорогові (ВПС) кальцієві струми (IСa). На рис. 2 відображена залежність напруги кисню в зовнішньому розчині від тривалості його продування газоподібним азотом. Видно, що після 3-4 хвилин інтенсивного продування рівень рО2 знижується зі 145-147 мм рт. ст. до мінімальних значень порядку 5 - 7 мм рт.ст. та підтримується на такому рівні на протязі всього часу пропускання газу. Перфузія експериментальної камери розчином з рО2 5-7 мм рт. ст. дозволяє мати у її дна значення рО2 рівні 10 - 12 мм рт. ст., а при рО2 в перфузійній посудині 10 мм рт. ст., рО2 в робочій камері дорівнювало 20 - 22 мм рт. ст. Відомо, що критична величина для мозкового рО2 дорівнює 19 - 23 мм рт. ст. (Doppenberg et al. 1998), тому саме такі та менші величини й використовувались нами у більшості експериментів при моделюванні гіпоксичних умов. У 80% досліджених нейронів зниження ступеню оксигенации зовнішнього розчину зі 145 до 20 мм рт. ст. не викликало ніяких змін кальцієвих струмів, а зниження ще на 10 мм рт. ст. приводило до незначного зменшення амплітуди як НПС, так і ВПС, яке, однак, не було статистично вірогідним (рис. 4 А, В). Інкубація інших 20% нейронів в розчині з рО2 20 мм рт. ст. викликала оборотне зниження максимальної амплітуди кальцієвого струму через НПК в середньому з 3.1 0.2 до 2.3 0.2 нА (n=6, Р<0.05), а через ВПК - з 4.5 0.3 до 3.4 0.2 нА (n=6, P<0.05) (рис. 4 Б,Г). В усіх випадках відновлення контрольного рівню оксигенації зовнішнього розчину в камері (145 - 147 мм рт. ст.) вже в кінці 2 - 3 хвилини приводило до 60% відновлення вихідної амплітуди IСa. Ступінь блокади кальцієвих струмів в цих нейронах при рО2 в робочій камері 10 мм рт. Ст. вірогідно не відрізнялась від такої, коли рО2 дорівнювало 20 мм рт. ст. Вилучання із зовнішнього розчину глюкози в умовах зниженої оксигенації не змінювало характер та вираженість реакції кальцієвих струмів в обох типах нейронів. На відміну від гіпоксії, викликаної зниженням напруги кисню як кінцевого акцептора електронів в дихальному ланцюжку мітохондрій, блокада транспортування електронів на етапі від нікотинамідаденіндінуклеотиду до флавінмононуклеотиду за допомогою ротенона (10 мкМ) викликала вірогідне зменшення амплітуди НПС - з 3.0 0.3 до 1.8 0.3 нА (n=6, P<0.05), а ВПС - з 4.3 0.3 до 2.3 0.2 нА (n=6, P<0.05) в усіх без вийнятку досліджених нейронах (рис.5). Особливістю цієї реакції було необоротне блокування обох типів струмів в 90% нейронів навіть через 5 - 7 хвилин відмивання.
Вплив аутентичного оксиду азоту на низько- та високопорогові кальцієві канали в нейронах задньо-корінцеих гангліїв мишей.
Результати дослідів ряда авторів свідчать, що кількість NO в крові та тканинах в реальних умовах лежить в діапазоні від 0.3 до 0.85 мкМ (Bohlen, 1998; Clough et al., 1998). Ми емпірично встановили, що для отримання концентрації NO в камері 1 мкМ необхідно додати в камеру на порядок більшу концентрацію аутентичного оксиду азоту, тобто 10 мкМ. На рис. 6 А, Б відображені типові зразки відповіді нейронів на аутентичний NO (10 мкМ). В середньому, амплітуда НПС зменшувалась з 3.5 0.3 до 1.2 0.2 нА (n=11, P<0.001), а амплітуда ВПС - 4.5 0.1 до 2.7 0.2 нА (n=11, P<0.001). Цей ефект був практично повністю оборотним, усувався після приблизно 1 хвилини відмивання та не викликав зсуву максимумів вольт-амперної характеристики загальних кальцієвих струмів (рис.6 В). Діаграма на рис. 6 Г дозволяє відзначити, що аутентичний оксид азоту викликав більш значне інгібування низькопорогового кальцієвого струму у порівнянні з високопороговим.
Вплив донорів оксиду азоту на низько- та високопорогові кальцієві струми в нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей.
Виміри концентрації NO в базовому розчині при розчиненні різних NO-донорів показали значне розходження між концентрацією відповідної субстанції та ефективною концентрацією NO, що вивільнюється. Вірогідне зниження амплітуди кальцієвих струмів під впливом нітропрусиду натрію спостерігалось лише при використанні його субстанції в концентрації не менше 10 мкМ (як показали виміри NO в робочій камері за допомогою NO-селективного електроду, ефективна концентрація NO в зовнішньому розчині складала порядка 0.001 мкМ). При цьому зниження амплітуди кальцієвих струмів обох типів було значно меншим, ніж при дії аутентичного NO в аналогічній концентрації (рис.7). НПС зменшувався з 3.5 0.2 до 2.7 0.3 нА (n=7, P<0.05), а ВПС - з 4.1 0.3 до 3.2 0.2 нА (n=7, P<0.05). В більшості випадків ефект нітропрусиду натрію був необоротним. На рис.8 відображений ефект другого донору оксиду азоту SIN-1, який є осноовою препарата молсідамін (корватон) на високопороговий струм. SIN-1 в концентрації 10 мкМ оборотно блокував лише ВПС з 4.2 0.3 до 2.5 0.3 нА (n=7, P<0.05). Реальна ефективна концентрація NO при аплікації цього донору складала в камері 0.003 мкМ. Для того, щоб мати в робочій камері концентрацію NO 1 мкМ, необхідно було б додати з зовнішній розчин не менше 10 мМ SNP або SIN-1, що могло б привести до появи неспецифічних ефектів.
Вплив метиленового синього та дітіоеритритолу на блокування кальцієвих струмів під впливом аутентичного оксиду азоту.
Блокатор розчинної гуанілатциклази, метиленовий синій, в концентрації 50 мкМ ефективно запобігав блокуванню як НПС, так і ВПС під впливом NO. Дітіоеритритол (5 мМ), що має здатність підтримувати SH-групи у відновленному стані і таким чином запобігати їх нитрозилуванню, практично не перешкоджає блокуванню кальцієвих струмів обох типів (рис. 9).
Вплив пероксинітриту на кальцієві струми в нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей.
На рис.9 помітно, що ступінь блокування пероксинітритом (ONOO-) кальцієвих струмів можна порівняти з впливом NO в аналогічній концентрації, але на відміну від NO дія ONOO- була необоротною в 90% нейронів.
Обговорення результатів досліджень.
Прямі виміри концентрації оксиду азоту показали, що в умовах гіпоксії/ішемії кількість NO в тканинах мозку дійсно збільшується (Sato et al.,1993). Слід зауважити, що надмірна продукція NO під час ішемії обумовлена, зокрема, активацією NMDA-підтипу глутаматних рецепторів, наступною активацією кальцій-залежних NO-синтаз та входом в клітину іонів Са, може мати подвійні наслідки: негативні (наприклад, за рахунок утворення пероксинітритів) та позитивні, які полягають в тому, що NO сприяє розширенню мозкових судин (Dalkara et al., 1994) та може приводити до ретроградної блокади NMDA-рецепторів. (Manzoni et al., 1992).
Нами показано, що низько- та високопорогові кальцієві канали більшості нейронів задньо-корінцевих гангліїв мишей є резистентними до зниження ступеню оксигенації зовнішнього розчину зі 145 -147 до 10 мм рт.ст. навіть після вилучання з нього глюкози як субстрату енергетичного метаболізма. Тільки 20% нейронів відповідали незначним оборотним зниженням амплітуди як НПС, так і ВПС. В той же самий час амплітуда струмів через обидва типи кальцієвих каналів вірогідно зменшувалась під впливом ротенону, що блокує транспорт електронів в дихальному ланцюжку мітохондрій від нікотинамідаденіндінуклеотиду до флавінмононуклеотиду. Отже, моделювання гіпоксії за допомогою блокади окислювального фосфорилування не може в повний мірі відображати реальний гіпоксичний стан. Також це може означати, що на відміну від клітин ЦНС, нейрони ЗКГ здатні ефективно підтримувати кальцієвий гомеостаз навіть при незначній кількості кисню в навколишньому середовищі.
Таким чином, можна припустити, що зниження оксигенації само по собі не є серйозною небезпекою для нейронів периферичної системи, зокрема для нейронів ЗКГ. Небезпека полягає в ланцюжку наступних біохімічних перетворень, які гіпоксія може запустити. Одним з таких наслідків є активація кальцій-залежних NO-синтаз та утворення NO, який при взаємодії з супероксиданіоном перетворюється на пероксинітрит, що руйнує різні біологічні структури, зокрема мембрани, шляхом їх окислення та нитрозилування.
Нами показано, що аутентичний оксид азоту в концентрації, близької до фізіологічної, вірогідно та оборотно блокує обидва типи кальцієвих каналів в усіх без виключення досліджених нейронах ЗКГ і механізм його дії на кальцієвий канал є переважно класичним, тобто реалізується через збільшення рівня цГМФ завдяки активації гуанілатциклази (Murad, 1994; Husseini et al., 1998). Це підтверджується експериментами з блокатором гуанілатциклази, метиленовим синім, який ефективно запобігав блокуванню кальцієвих струмів оксидом азоту. Крім цього відомо, що важливою мішенню для NO в клітині є білки, що містять SH-групи (Busse et al., 1995). Очевидно, саме механізм нитрозилування таких білків іонного каналу лежить в основі поки що мало вивченного прямого або цГМФ-незалежного механізму дії NO. В наших експериментах дітіоеритритол, здатний підтримувати SH-групи у відновленому стані і таким чином запобігати їх нитрозилуванню, практично не перешкоджав блокуванню кальцієвих струмів оксидом азоту. Отже, цей механізм реалізується в меншому ступені в нейронах ЗКГ мишей. Пероксинітрит, як і оксид азоту, викликав зменшення кальцієвого струму через низько- та високопорогові кальцієві канали, але на відміну від NO його ефект не був оборотним у більшості досліджених нейронів, що може свідчити про порушення нормального функціонування каналів.
Ці дані дозволяють дійти висновку, що, по-перше, в нейронах периферичної нервової системи, зокрема в нейронах ЗКГ мишей, NO може досить істотно впливати на клітинні мембранні механізми не тільки як фактор процесів, індукованих гіпоксією, по-друге - одним з медіаторів опосередкованого оксидом азоту пошкодження нейронів є, очевидно, пероксинітрит. Механізми такого пошкодження ще невідомі, проте можна припустити, що вони пов'язані із здібністю ONOO- ініціювати процеси пероксидного окислення ліпідів в плазматичній мембрані (Beckman et al., 1990).
Як вже було зазначено, вивільнення глутамата може бути однією з ланок в реалізації ефектів гіпоксії в ЦНС. Однак, як відомо, нейрони ЗКГ не мають синаптичних входів (Urban & Somjen, 1990) і, отже, в даному випадку глутумат не повинен відігравати головної ролі при гіпоксичному/ішемічному пошкодженні. Разом з тим, хоча нейрони задньо-корінцевих гангліїв не мають синаптичного входу, є дані, що їх сома здібна до секретування глутамату і має до нього ауторецептори (Li, 1993; Sato et al., 1993). Але такий аутодеполяризуючий вплив навряд чи може бути значним. Тому функціональний ефект гіпоксії в цих клітинах реалізується, в основному, за участю якихось інших механізмів.
Висновки
1. Кальцієві струми більшості нейронів задньо-корінцевих гангліїв мишей (80%) є резистентними до зниження ступеню оксигенації зовнішнього розчину; лише 20% нейронів реагують на гіпоксію зниженням амплітуди як низько- так і високопорогових струмів.
2. Вилучання глюкози із зовнішнього розчину в умовах зниженої оксигенації не змінює характер та вираженість реакції як чутливих, так і резистентних до гіпоксії низько- та високопорогових кальцієвих каналів нейронів задньо-корінцевих гангліїв.
3. Як низькопорогові, так і високопорогові кальцієві канали відповідають на блокаду окислювального фосфорилування ротеноном необоротним зниженням амплітуди кальцієвого струму.
4. Аутентичний оксид азоту в концентраціях, близьких до фізіологічних, оборотно блокує вхід позаклітинного кальцію через обидва типи кальцієвих каналів.
5. Прямий донор оксиду азоту - нітропрусид натрію - викликає незначне та необоротне інгібування кальцієвих струмів, в той час як інший прямий донор - SIN-1 - оборотно зменшує амплітуду лише високопорогового кальцієвого струму.
6. Інгібуюча дія аутентичного оксиду азоту на кальцієвий струм в більшому ступені зумовлена активацією розчинної гуанілатциклази та в меншому ступені - прямим впливом оксиду азоту на сульфгідрильні групи білка кальцієвого каналу.
7. Пероксинітрит необоротно блокує вхід позаклітинного кальцію через низько- та високопорогові кальцієві канали в більшості нейронів задньо-корінцевих гангліїв.
8. Одержані дані вказують, що низько- та високопорогові кальцієві канали в нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей мають високу чутливість до дії оксиду азоту та особливо до його похідного - пероксинітриту, що дає підстави вважати останній одним з основних медіаторів пошкодження нейронів принестачі кисню. В той же час відсутність вираженого ефекту гіпоксії на кальцієві канали свідчить про складний механізм запуску синтезу оксиду азоту при гіпоксії в реальних умовах, пов'язаний, ймовірно, з необхідністю попередньої дії на клітинну мембрану глутумату.
Перелік праць, опублікованих за матеріалами дисертації
1. Соловйова Н.А., Костюк П.Г. Вплив оксиду азоту та гіпоксії на низько- та високопорогові кальцієві струми в нейронах дорсальних гангліїв мишей // Нейрофізіологія. - 1999. - Т.31. - №1. - С. 70-73.
2. Соловйова Н.А., Костюк П.Г. Подібність та відмінність у дії терапевтичних донорів оксиду азоту й аутентичного оксиду азоту на кальцієві струми у нейронах задньокорінцевих гангліїв мишей // Ліки. - 1999. - №1, С.73-76.
3. Соловйова Н.А. Порівняльне вивчення дії оксиду азоту й пероксинітриту на кальцієві струми у нейронах задньокорінцевих гангліїв мишей // Ліки. - 1999. - №2, С.61-64.
4. Cоловйова Н.А., Костюк П.Г. Вплив гіпоксії та окису азоту на високо- та низькопорогові кальцієві канали в сенсорних нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей. ХV з'їзд Українського фізіологічного товариства (Донецьк). - // Фізіологічний журнал. - 1998. -Т.44. - №3. - С.13
5. Kostyuk P. & Solovyova N. Nitric oxide inhibits predominantly low-voltage-activated calcium currents in mouse primary sensory neurones // J. Physiology (Lond.). - 1998. - V.509P. - P.62P.
Анотація
Соловйова Н.А. Вивчення впливу гіпоксії та оксиду азоту на кальцієві струми в нейронах задньо-корінцевих гангліїв мишей. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату медичних наук за спеціальністю 14.03.03 - нормальна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Київ - 1999.
Дисертація присвячена дослідженню ролі оксиду азоту та його похідного - пероксинітриту в гіпоксичному пошкодженні нервових клітин. Показано, що аутентичний NO (10 мкМ) оборотно інгібує низько- та високопорогові кальцієві струми нейронів задньо-корінцевих гангліїв мишей і механізм його впливу на кальцієві канали є переважно класичним, тобто реалізується через активацію гуанілатциклази та підвищення синтезу цГМФ. В той же самий час пероксинітрит необоротно блокує кальцієві струми в нейронах і, таким чином, порушує роботу кальцієвих каналів.
Встановлено, що низько- та високопорогові кальцієві канали переважної більшості сенсорних нейронів (80%) є резистентними до зниження рівню оксигенації зовнішнього розчину (рО2 = 10-20 мм рт.ст.) і лише у 20% нейронів гіпоксія викликає оборотне інгібування як низько-, так високопорогових кальцієвих струмів. Однак, амплітуда обох типів струмів в усіх досліджених клітинах необоротно зменшується під впливом ротенону, який блокує транспорт електронів в дихальному ланцюжку мітохондрій на етапі від нікотинамідаденіндінуклеотиду до флавінмононуклеотиду.
Ключові слова: оксид азоту, гіпоксія, низькопорогові кальцієві канали, високопорогові кальцієві канали.
Аннотация
Соловьева Н.А. Изучение влияния гипоксии и оксида азота на кальциевые токи в сенсорных нейронах мышей. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.03 - нормальная ффизиология. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины. Киев - 1999.
Диссертация посвящена исследованию роли оксида азота и его производного - пероксинитрита в гипоксическом повреждении нейронов спинно-мозговых ганглтев мышей. Для исследований были отобраны клетки среднего диаметра, которые экспрессируют как низко-, так и высокопороговые кальциевые каналы.
Нами показано, что кальциевые токи большинства нейронов среднего диаметра (80%) спинно-мозговых ганглиев мышей являются резистентными к снижению степени оксигенации наружного раствора. Уменьшение рО2 со 145 до 20 мм рт.ст. не вызывало в таких нейронах никаких изменений кальциевых токов, а снижение напряжения кислорода еще на 10 мм рт.ст. приводило к уменьшению амплитуди токов как через низкопороговые, так и через высокопороговые каналы, которое, однако, не было статистически достоверным. Инкубация других 20% клеток в среде с содержанием кислорода 20 мм рт.ст. вызывала обратимое снижение максимальной амплитуды кальциевых токов через оба типа каналов. Снижение рО2 в камере до 10 мм рт.ст. не приводило к статистически достоверному увеличению степени блокирования кальциевых токов в этих нейронах. Даже после удаления из наружного раствора глюкозы как субстрата энергетического метаболизма не изменялся характер и выраженность реакции кальциевых токов на снижение степени оксигенации в обоих группах нейронов.
В отличие от гипоксии, вызванной снижением напряжения кислорода, как конечного акцептора электронов в дыхательной цепи митохондрий, блокада транспорта электронов на этапе от никотинамидадениндинуклеотида до флавинмононуклеотида с помощью ротенона (10 мкМ) вызывала достоверное, но необратимое уменьшение амплитуды кальциевых токов через оба типа кальциевых каналов во всех исследованных нейронах.
Эти данные могут свидетельствовать о том, что гипоксия сама по себе, как нарушение соотношения между доставкой кислорода и его потреблением, не представляет для нейронов периферической нервной системы серьезной опасности. Опасность может представлять последующая цепочка биохимических превращений, которые гипоксия может запустить. Одним из механизмов действия гипоксии на нейрон считается последующая активация высвобождающимся глутаматом NMDA-рецепторов, вход в клетку ионов кальция, активация NO-синтаз и освобождение оксида азота. Хотя нейроны спинно-мозговых ганглиев и не имет синаптического входа, однако, согласно последним данным, их сома обладает способностьью секретировать глутамат и имеет кнему ауторецепторы. Но такое аутодеполяризующее влияние навряд ли будет значительным и поэтому эффект гипоксии в этих клетках реализуется, по-видимому, также при участии каких-либо других механизмов.
В экспериментах по изучению влияния оксида азота на кальциевые токи ипользовался водный раствор газообразного оксида азота. Такой оксид азота называют аутентичным в отличие от того, который получают из веществ-доноров. Нами показано, что аутентичный оксид азота в концентрации, близкой к физиологической, быстро и обратимо блокирует вход кальция через низко- и высокопороговые кальциевые каналы и механизм его действия является, в основном, классическим, т.е. цГМФ-зависимым. Это подтверждают опыты с блокатором гуанилатциклазы - метиленовым синим. Он эффективно предотвращал блокирование кальциевых каналов оксидом азота. Однако, полученные данные не позволяют исключить и прямой механизм действия NO непосредственно на сульфгидрильные группы белка канала. Использование в экспериментах дитиоэритритола, способного поддерживать эти группы в восстановленном состоянии и препятствовать их нитрозилированию, показало, что данный механизм действия, возможно, иакже имеет место, хотя и реализуется в меньшей степени в нейронах спиннол-мозговых ганглиев.
Токсический эффект оксида азота при гипоксии связывают с образованием продукта его метаболизма - пероксинитрита (ONOO-), который разрушает биологические структуры, нитрозилируя и окисляя их. Действительно, пероксинитрит вызывал в наших опытах необратимое в большинстве нейронов блокирование кальциевых токов.
Исследования прямых доноров NO показали заметное отличие в их блокирующем действии на кальциевые токи от аутентичного оксида азота. Измерения концентрации оксида азота в базовом растворе при растворении его доноров - нитропруссида натрия и 3-морфолинсиднонимина (SIN-1) показали значительное расхождение между концентрацией соответствующей субстанции и эффективной концентрацией оксида азота. Достоверное снижение амплитуды токов наблюдалось при использовании доноров в концентрации не менее 10 мкМ. Для того, чтобы иметь в рабочей камере концентрацию NO 1 мкМ, необходимо было бы добавить во внешний раствор не менее 10 мкМ одного из доноров, что привело бы к неспецифическим эффектам. Нитропруссид натрия (10 мкМ) незначительно и необратимо ингибировал оба типа кальциевых каналов, в то время как SIN-1 (10 мкМ) обратимо уменьшал амплитуду только высокопорогового тока.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что, в нейронах спинно-мозговых ганглиев мышей оксид азота может оказывать влияние на различные клеточные мембранные механизмы не только как фактор процессов, индуцированных гипоксией. Вероятно также, что одним из медиаторов опосредованного оксидом азота повреждения нейронов является пероксинитрит.
Ключевые слова: оксид азота, гипоксия, низкопороговые кальциевые каналы, высокопороговые кальциевые каналы.
Summary
Solovyova N.A. The influence of hypoxia and nitric oxide on medium sized mice neuron calcium currents. - Manuscript.
Thesis for PhD degree by specialty 14.03.03- normal physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev - 1999.
The thesis is devoted to investigation of role of the nitric oxide and it derivate - peroxynitrite in neuron hypoxic damage. The data obtained indicate that low-voltage activated (LVA) high- (HVA) and calcium currents (ICa) in 80 % of dorsal root ganglion neurons are resistant to hypoxia (pO2 = 10-20 Hg); hypoxia reduced both ICa LVA and HVA only in 20% neurons. In contradiction to hypoxia, rotenon (10 M) caused irreversible decrease of ICa in all investigated neurons. Authentic NO (10 M) reduced both LVA and HVA calcium currents. This inhibitory action was shown to be mediated substantially by an increase in cGMP level. At the same time, peroxynitrite irreversibly blocked both types of calcium currents.
Key words: nitric oxide, hypoxia, low voltage-activated calcium channels, high voltage-activated calcium channels.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Вміст свинцю в крові, аорті, печінці, серці та нирках щурів після введення ацетату свинцю. Зміни показників обміну оксиду азоту в організмі дослідних тварин. Вплив свинцю на скоротливу функцію судинної стінки на препаратах ізольованого сегменту аорти.
автореферат [49,0 K], добавлен 10.04.2009Поняття гіпоксії, визначення індивідуальних особливостей реактивності організму людини. Види гіпоксій, механізм їх виникнення. Підвищення реактивності організму - фактор стійкості до гіпоксії. З'ясування вікових механізмів зниження стійкості до гіпоксії.
курсовая работа [1,4 M], добавлен 05.03.2014Нові методи лікування із застосуванням лізиноприлу і глутаргіну на основі вивчення клініко-патогенетичних особливостей мозкового і периферійного кровоплину у хворих на артеріальну гіпертензію, аналіз впливу лікування на клінічний перебіг захворювання.
автореферат [32,9 K], добавлен 21.03.2009Розробка новітніх методик корекції гіпоксії у хворих з синдромом гострого пошкодження легенів при критичних станах з позицій інтегративної медицини. Ефективність малопоточної мембранної оксигенації крові, протекторний вплив її на легеневу тканину.
автореферат [52,1 K], добавлен 24.03.2009Біотехнологічні процеси заготівлі, консервування клітин, тканин ембріофетоплацентарного походження в умовах низьких температур. Вплив холоду на біологічні об'єкти. Функціональна повноцінність біологічного матеріалу. Вибір терапії від форми і стадії ЦХРД.
автореферат [44,3 K], добавлен 09.03.2009Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових гемопоетичних клітин на патогенез експериментального цукрового діабету на підставі вивчення особливостей вуглеводного, жирового обміну і морфологічних змін підшлункової залози.
автореферат [41,1 K], добавлен 09.03.2009Класифікація перинатальних уражень ЦНС. Причини хронічної внутрішньоутробної гіпоксії плода. Роль травматичного фактору у пошкодженнях спинного мозку. Дисметаболічні і токсико-метаболічні, інфекційні ураження ЦНС. Фази розвитку патологічного процесу.
презентация [795,2 K], добавлен 15.11.2014Головний мозок як командний пункт всього організму. Нейрони як клітин з довгими і короткими відростками. Механізм передачі нервових імпульсів. Синапси як місце, через яке здійснюється зв’язок і передача імпульсів між нейронами і клітиною робочого органа.
презентация [13,1 M], добавлен 06.04.2015Вікові особливості змін вентиляції при гіпоксичному стресі, особливості газообміну та оксигенації крові в легенях. Кисневотранспортні функції та кислотно-лужний стан крові при гіпоксичному стресі людей похилого віку, ефективність гіпоксичних тренувань.
автореферат [74,9 K], добавлен 17.02.2009Монополярний і біполярний спосіб відведення ЕЕГ. Зовнішнє електричне поле пірамідних нейронів кори головного мозку. Електроенцефалограми як кількісна характеристика електричної активності мозку. Сутність дипольного еквівалентного електричного генератора.
реферат [2,0 M], добавлен 04.02.2011
