Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АО «Медицинский университет Астана»

Самостоятельная работа

Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Астана 2013

Содержание

Введение

1. Гибридомная технология

2. Основные области применения МКАТ в медицине

2.1 Применение моноклональных антител в лечении злокачественных новообразований

2.2 Применение МКАТ в методе лазерной проточной цитофлюориметрии

Список использованной литературы

Введение

Определенный прорыв в экспериментальной и клинической работе произошел в 70-х годах XX в., когда был разработан способ получения моноклональных антител на основе гибридомной технологии. Моноклональные антитела (МКАТ) являются продуктом одного из множества клонов антителообразующих клеток (АОК) и обладают строгой специфичностью по отношению к конкретной антигенной детерминанте (эпитопу) того или иного антигена. В этом отношении МКАТ можно отнести к категории химически чистых реагентов.

1. Гибридомная технология

антитело клонирование клетка ген лечебный

В конце 60-х-начале 70-х годов XX в. были разработаны лабораторные методы клонирования клеток in vitro. Для этого понадобилось создать питательные среды, материалы для лабораторной посуды и термостаты-инкубаторы, позволившие имитировать условия внутренней среды организма для сохранения жизнеспособности клеток млекопитающих. В течение 10-12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно (в благоприятных для них внешних условиях) делиться митозом. Г. Келлер и Ц. Мильштейн в 1974-1975 гг. применили метод получения гибридных соматических клеток, который использовали цитогенетики для изучения локализации генов, контролирующих тот или иной признак в той или иной хромосоме (гибридные клетки выбрасывают большую часть хромосом, но не все), к лимфоцитам, но с иными целями. Г. Келлер и Ц. Мильштейн получили гибридные клетки из лимфоидной опухоли (миелома) и нормального лимфоцита. Гибридные клетки имели часть хромосом (а следовательно, и свойств) нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и часть - от опухоли. Размножались только клетки, унаследовавшие от миеломы способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например антител; последние и требовались Г. Келлеру и Ц. Мильштейну. Неограниченно делящиеся клетки «позволяют» себя клонировать, т.е. физически «рассадить» по одной (каждую в отдельную посуду) и получить клоны клеток - потомков одной клетки. Такие клетки назвали гибридомами.

Лимфоциты для гибридизации получают из селезенки или лимфоузлов, предварительно иммунизированных целевым антигеном мышей (чаще всего - линии Balb/c). В качестве опухолевых клетокпартнеров используют специально выведенные для получения гибридом мутантные клетки мышиной миеломы (иногда ее же называют плазмоцитомой, что в данном случае одно и то же), полученные из перевивной линии миеломных клеток МОРС-21 от мышей Balb/c, поддерживаемой в культуре in vitro с 1921 г. Келлер и Мильштейн использовали мутантные миеломные клетки, выведенные цитогенетиками ранее также для получения гибридных клеток млекопитающих, но в иных целях: поскольку гибридные клетки выкидывают большую часть хромосом, по оставшимся цитогенетики устанавливали локализацию тех или иных признаккодирующих генов в конкретных хромосомах.

«Мутантность» миеломных клеток необходима для метаболической селекции клеток гибридом от неслившихся с лимфоцитами клеток миеломы. Эта «мутантность» состоит в отсутствии в миеломных клетках действующего гена, кодирующего фермент ГГФРТ. Данный фермент катализирует синтез гуанина (одного из 4 азотистых оснований, входящих в состав ДНК) из гипоксантина. Вскоре после первой публикации Келлера и Мильштейна в распоряжении «гибридомщиков» во всем мире оказались две удобные линии мутантных миелом - P3/X63-Ag8-653 и SP2/0-Ag14, которые быстро пролиферируют и сами не продуцируют никаких частей иммуноглобулинов.

Суспензию лимфоидных клеток от иммунных мышей смешивают в одной пробирке в минимальном объеме среды с суспензией миеломных клеток и на 1-2 мин добавляют сливающий агент. У Келлера и Мильштейна сначала этим агентом был, как и у цитогенетиков, вирус Сендай, но через несколько месяцев уже все «гибридомщики» в качестве сливающего агента использовали синтетические полимеры - полиэтиленгликоли с молекулярными массами от 1540 до 6000 D. По прошествии 1-2 мин суспензию клеток, содержащую смесь неслившихся лимфоидных клеток, неслившихся клеток миеломы и гибридных клеток 3 вариантов («лимфоцит-лимфоцит», «миелома-миелома», «лимфоцит-миелома»; из них искомыми клетками являются только гибриды «лимфоцит-миелома»), отмывают и разводят в рассчитанном объеме селективной среды НАТ. НАТ означает «Hypoxanthine-Aminopterin Thymidine». Указанные 3 компонента в известных концентрациях вводят в полную культуральную среду. В течение первых 7-10 дней культивирования названной смеси клеток в культуре происходит следующее:

1) неслившиеся лимфоциты и гибриды «лимфоцит-лимфоцит» погибают в силу своей природной недолговечности;

2) неслившиеся клетки миеломы и гибриды «миелома-миелома» погибают от невозможности осуществлять биосинтез своей ДНК в присутствии аминоптерина - метаболического яда, избирательно блокирующего ферменты биосинтеза пиримидиновых оснований de novo из N₅N₁₀-метилен-тетрагидрофолата; биосинтез пуриновых оснований из гипоксантина в этих клетках также невозможен в связи с отсутствием ГГФРТ (гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы);

3) единственные клетки, имеющие возможность выжить в среде НАТ, это искомые гибридные клетки «лимфоцит-миелома»: биосинтез пуриновых оснований у них обеспечен ГГФРТ, ген которой получен из нормального лимфоцита, и средовым гипоксантином, а биосинтез пиримидиновых оснований осуществляется из средового тимидина с участием тимидинкиназы. От клеток миеломы данные гибридные клетки наследуют свойство неограниченной пролиферации. От нормальных иммунных В-лимфоцитов - биосинтез иммуноглобулинов.

Пролиферация «non-stop» позволяет клонировать гибридные клетки, т.е. рассеять по 1 в лунку и подождать, когда из этой одной клетки при благоприятных условиях культивирования вырастет клон, т.е. много одинаковых клеток (с точностью до спонтанных мутаций). Какие из получившихся «лимфоцит-миеломных» гибридных клеток продуцируют заданные антитела, выясняют, отбирая из лунок пробы супернатанта на соответствующий иммуноанализ. В дальнейшем избранные гибридомы неоднократно реклонируют и выводят в массовые культуры - реакторы in vitro или асцитные опухоли у сингенных мышей. Из культуральных супернатантов или асцитных жидкостей выделяют гибридомные моноклональные антитела в очищенном виде.

Если клон клеток гибридомы синтезирует антитела, то эти антитела называют моноклональными. Как показал опыт, все клетки клонированной гибридомы синтезируют одинаковые антитела - и по специфичности активного центра, и по изотипу тяжелой цепи, т.е. моноклональные антитела - не только продукт моноклона, но и препарат одинаковых иммуноглобулинов. В конце 1970-х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты, не скрещенные с опухолевой линией клеток. Это стало возможным только после открытия фактора роста Т-лимфоцитов, позже названного ИЛ-2. Именно клонирование Т-лимфоцитов позволило открыть субпопуляции CD4⁺ Т-лимфоцитов и сделать множество других открытий, в том числе идентифицировать ВИЧ (достаточные для исследования количества генов и белков вируса смогли наработать только на Т-лимфоцитах, культивируемых in vitro в присутствии факторов роста). В-лимфоциты без превращения их в гибридомы можно заставить делиться (что позволяет их клонировать), если инфицировать их вирусом Эпштейна-Барр (он трансформирует нормальные В-лимфоциты в опухоль из В-лимфоцитов).

Таким образом, моноклональные антитела, продуцируемые одним клоном, являются:

* высокоспецифичными, направленными к заданной антигенной детерминанте;

* идентичными по изотипу, аллотипу и идиотипу, а также по аффинитету и физико-химическим характеристикам.

Стабильные культуры гибридом способны продуцировать в неограниченном количестве моноклональные антитела.

2. Основные области применения МКАТ в медицине

В основе применения МКАТ в различных областях лежит возможность получения больших количеств высокоаффинных антител, специфичных по отношению:

1) к иммуногенным антигенам, определяющим гистосовместимость и дифференцировку;

2) дифференцировочным, опухолевым и другим антигенам клеточной поверхности, которые лишены полиморфизма и неиммуногенны в аллогенных системах, но распознаются при ксеногенной иммунизации;

3) вирусным и бактериальным антигенам;

4) единичным антигенным детерминантам разнообразных белков, нуклеиновых кислот и сахаров.

Применение МКАТ позволяет определять и разделять субпопуляции клеток, различать отдельные стадии развития клеток, более точно типировать ткани, более точно идентифицировать микроорганизмы, а также более надежно определять иммунологическими методами биологически важные макромолекулы.

В медицине на основе МКАТ разработано большое количество систем диагностирования различных заболеваний (инфекционных, онкологических и др.). Активно разрабатываются и лекарственные препараты на основе МКАТ, например противоопухолевые препараты, антицитокиновые антитела (препарат ремикейт и др.) Однако было показано, что применение мышиных МКАТ для иммунотерапии опухолевых заболеваний приводит к появлению различных побочных эффектов и отличается слабой эффективностью действия.

Модификация мышиных МКАТ (гуманизированные антитела и различные конъюгаты МКАТ - с радионуклидами, лекарствами, токсинами и пр.) открывает новые возможности в диагностике и лечении опухолевых и других заболеваний.

2.1 Применение моноклональных антител в лечении злокачественных новообразований

В настоящее время известно три класса цитотоксических моноклональных антител. Первый класс включает неконъюгированные антитела, которые сами способны вызывать гибель опухолевых клеток. Два других класса представлены антителами конъюгированными с токсинами и изотопами (конъюгированные антитела).

Типичное антитело является иммуноглобулином и состоит из четырех цепей (двух легких и двух тяжелых) и имеет постоянный и гипервариабельный домены. Постоянным доменом антитело фиксируется к Fc-рецептору цитотоксического лимфоцита, а гипервариабельным доменом к соответствующему антигену.

Механизм противоопухолевого действия моноклональных антител достаточно сложный и включает следующие элементы (Jungans R.P. et al., 1996):

комплемент-зависимая цитотоксичность

антитело-зависимая клеточная цитотоксичность

Ав2 вакцины

фагоцитоз (только активированные макрофаги)

блокада рецепторов (антирецепторы)

апоптоз

внутриклеточные эффекты.

Наиболее значимыми являются первые три механизма. При реализации комплемент-зависимой цитотоксичности после связывания антителом антигена на поверхности опухолевой клетки активизируется многоэтапная система комплемента. На последнем её этапе образуется белок С9, способный формировать отверстия в базальной мембране клетки, что в конечном счете приводит её к гибели.

Вторым важным механизмом является антитело-зависимая цитотоксичность. При этом моноклональное антитело своим гипервариабельным доменом связывается с соответствующим антигеном на поверхности опухолевой клетки, а постоянным доменом с Fc-рецептором цитотоксического лимфоцита, так называемых "киллеров". Последние способны синтезировать и выделять белки - перфорины (подобен протеину С9 системы комплемента) и сериновые протеазы, повреждающие клеточную мембрану.

Третьим важным механизмом противоопухолевого действия моноклональных антител является, так называемый, механизм Ав2 вакцины. Он реализуется при использовании моноклональных антител, содержащих чужеродный (чаще всего мышиный) белок. В ответ на его введение образуются антиидиотипические антитела, способные связываться с поверхностным опухолевым антигеном и запускать один из указанных механизмов цитотоксичности.

2.2 Применение МКАТ в методе лазерной проточной цитофлюориметрии

С начала 80-х годов с развитием техники иммунологического анализа люминесцентно-серологический метод вступил на принципиально новый этап развития. К этому времени были разработаны гибридомные способы получения моноклональных антител к различным антигенам мембран клеток, характеризующим разнообразные субпопуляции, был автоматизирован способ учета результатов путем замены флюоресцентного микроскопа автоматическим лазерным проточным цитофлюориметром, позволяющим идентифицировать клетки с учетом интенсивности флюоресцентного свечения и размера при прохождении их в потоке жидкости.

На поверхности иммунокомпетентных клеток находят самые разнообразные дифференцировочные антигены, которые можно выявлять при помощи соответствующих моноклональных антител (Манько, 1987, 1988; Bach, Bach, 1981а). В настоящее время моноклональные антитела для определения субпопуляций иммунокомпетентных клеток человека производят и продают разные зарубежные фирмы, в частности "Orto Diagnostic Systems Inc." (США) - антитела ОКТ, ОКВ, ОКМ и др.(OK - Orto Klon) и "Becton Dickinson Monoclonal Center Inc". (США) - антитела Leu.

Антигены CD 3 (CD - кластер дифференцировки), выявляемые с помощью моноклональных антител ОКТ 3, ОКТ 1, Leu 4, присутствуют на зрелых Т-лимфоцитах, находящихся в перифериических лимфоидных органах или тимической медулле.

Антигены CD 4, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 4 и Leu 2а, обнаруживаются на Т-лимфоцитах, обладающих хелперной (для продукции иммуноглобулинов) и индукторной (генерирующие цитотоксичные Т-клетки, отвечающие на растворимые антигены пролиферацией и продукцией лимфокинов) функцией.

Антигены СD 8, выявляемые моноклональными антителам ОКТ 8 и Leu 3a, находятся на Т-лимфоцитах, обладающих супрессорной (для продукции иммуноглобулинов) и цитотоксической активностью, а также предшественниках цитотоксических клеток.

Антигены CD 2, выявляемые моноклональными антителами ОКТ 11, присутствуют на всех периферических Т-лимфоцитах. По-видимому, эти антигены являются рецепторами к эритроцитам барана (В-рецепторами). Моноклональные антитела ОКТ 6 выявляют антигены (CD 1) на незрелых, кортикальных тимоцитах. ОКТ 9 и ОКТ 10 выявляют антигены на претимических клетках, Т-лимфоцитах, находящихся на ранних стадиях дифференцироаки, и на активированных Т-лимфоцитах.

Моноклональные антитела ОКВ 1 и Leu 12 обнаруживают антигены на зрелых В-лимфоцитах. ОКВ 2 выявляют антигены, характеризующие молодые формы В-лимфоцитов и находящиеся на гранулоцитах, ОКВ 7 выявляют типирующие В-лимфоциты; моноклональные антитела OK la 1 выявляют клетки, экспрессирующие Iа (иммуноассоциированные) антигены, ОКМ 1 и Leu 7 выявляют антигены, характерные для моноцитов, гранулоцитов, естественных киллеров, ОКМ 5 обнаруживают антигены на молодых моноядерных клетках.

В настоящее время для изучения клеток используют и сочетания моноклональных антител, позволяющие более узко характеризовать субпопуляции клеток, несущих одновременно два или несколько антигенов (Nicholson et al., 1986). Определение на клетках поверхностных антигенов методом иммунофлюориметрии с использованием лазерной цитометрии и моноклоиальных антител может проводиться как в цельной крови, так и в клеточных суспензиях, выделенных из крови (так же как люминесцентно-серологическим методом). В настоящее время в клинической иммунологии достаточно широко используется метод с применением небольших количеств капиллярной крови из пальца. Одна из модификаций этого метода состоит в следующем. 0,05 мл крови с антикоагулянтом инкубируют с раствором моноклональных антител, конъюгированных с флюорохромами при 00С в течение 15-30 мин. Затем эритроциты лизируют, выдерживая с гемолитической жидкостью (0,83%-ный раствор хлористого аммония с добавкой ЭДТА) при 200С в течение 40-60 с. Результаты учитывают при помощи жидкостного проточного цитофлюориметра, идентифицируя клетки по размеру (популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) и по интенсивности свечения (определение субпопуляций по присоединению конъюгатов моноклональных антител с флюорохромом).

Метод лазерной проточной цитофлюориметрии достаточно широко распространен в клинической иммунологии за рубежом, поскольку там налажен серийный выпуск и продажа комплектов моноклональных антител и приборов с отработанной технологией анализа, подробно описанной в инструкции. Однако как моноклональные антитела, так и прибор весьма дорогостоящи; кроме того, прибор требует постоянного технического контроля специалистами. Поэтому данный способ экономически оправдывает себя только при обеспечении высокопроизводительной работы (непрерывного потока анализов). Это несколько сужает возможности повсеместного применения данного способа. Конечно, вместо жидкостного цитофлюориметра можно применять флюоресцентный микроскоп, но в этом случае приходится менять технологию, подбирая условия таким образом, чтобы свечение окрашенных конъюгатами клеток было хорошо видно; резко увеличивается время анализа, поскольку исключается автоматизация.

Список использованной литературы

1. Kцhler G., Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497.

2. Murphy K. Janeway's Immunobiology. Garland Science, 2011.

3. Абелев Г.И. (2002). История клонально-селекционной теории. Природа 11 (2002),75--80.

4. http://www.eurolab.ua/microbiology-virology-immunology/3662/3681/31653/ - медицинский портал.

5. В.М. Моисеенко, НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург, Применение моноклональных антител для лечения злокачественных солидных опухолей.

6. Иммунология в клинической практике, под редакцией К.А. Лебедева, 1996.

Размещено на Allbest.ru