Методы исследования в клинической биохимии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы исследования в клинической биохимии



Оптические методы анализа

При проведении клинико-биохимических исследований наиболее широко используются 2 группы методов: оптические и иммунохимические.

Основными оптическими методами количественного анализа является абсорбционная фотометрия (колориметрия, спектрофотометрия, нефелометрия, атомно-абсорбционная фотометрия), эмиссионная фотометрия (пламенная фотометрия, флюориметрия, атомно-эмиссионный спектральный анализ), рефрактометрия, поляриметрия.

Большую часть исследований в клинической биохимии проводят с использованием методов, основанных на принципе абсорбционной фотометрии.

Абсорбционные оптические методы основаны на способности вещества избирательно поглощать поток световой энергии. Так как в клинической биохимии дело имеют преимущественно с веществом, находящимся в растворенном состоянии, то измеряется обычно светопоглощение раствора или интенсивность окраски, которая зависит от концентрации вещества.

Эмиссионная фотометрия основана на определении концентрации вещества по интенсивности светоизлучения (эмиссии) атомами исследуемого вещества.

Рефрактометрия базируется на измерении показателя преломления света при прохождении через оптически неоднородные среды, а поляриметрические методы - на свойстве прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света.

К оптическим измерительным приборам, используемым в клинической биохимии относятся:

1. Фотометры (фотоэлектроколориметры), позволяющие вести исследование в основном в видимой части спектра и определять количество вещества в окрашенных растворах.

2. Спектрофотометры, позволяющие выделять узкие участки спектра и вести определение по величине светопоглощения как в окрашенных, так и не окрашенных растворах.

3. Денситометры, используемые для сканирования, разделенных на носителях фракций анализируемых веществ.

4. Нефелометры, позволяющие определить концентрацию вещества в коллоидных растворах по величине светорассеяния.

5. Флюориметры, используемые для определения концентрации сложных органических веществ по интенсивности флуоресценции.

6. Пламенные фотометры, позволяющие определять содержание металлов в биологическом материале по интенсивности светоизлучения (эмиссии) атомов веществ испаряемых в пламени.

7. Атомные абсорбциометры, позволяющие определять в анализируемых средах содержание элементов по величине поглощения света атомами веществ, испаряемых в пламени газовой горелки.

8. Рефрактометры, дающие возможность определить концентрацию веществ в растворе по показателю преломления.

Абсорбционная фотометрия

К абсорбционной фотометрии относятся аналитические методы, основанные на определении интенсивности поглощения светового потока, проходящего через исследуемый раствор или поглощении света атомами веществ, испаряемых в пламени.

Абсорбционная спектрофотометрия имеет диапазон измерений в пределах 190-2000 нм. Измерения в области 190-400 нм охватывают ультрафиолетовую часть спектра и называются ультрафиолетовой спек- трофотометрией. Области от 400-700 нм охватывают видимую часть спектра. Измерения в этой области называют обычно колориметрией (или спектрофотометрией в видимой части спектра). Измерения в области 760-2000 нм относятся к области инфракрасной спектрофотометрии.

Используемые фотометрические приборы подразделяются на фотоэлектроколориметры (рис. 1, см. цветную иллюстрацию на стр. 18) и спектрофотометры (рис. 2 и 3, см. стр. 18). Основные их различия касаются выделения монохроматичных пучков света. С этой целью в фотоэлектроколориметрах используются специальные светофильтры, поэтому монохроматичность получаемого пучка невысокая. Спектрофотометры позволяют получить более монохроматичные пучки света. В них определенные участки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток, что позволяет установить любую длину волн в большом диапазоне.

При работе необходимо иметь в виду следующие особенности взаимодействия света с веществом. Свет является одной из форм электромагнитного излучения характеризующегося определенной частотой (v) и длиной волны (1). Проходя через прозрачную стеклянную призму свет разлагается по длинам волн, образуя спектр. В фотоэлектроколориметрах и спектрофотометрах монохроматичный луч с определенной интенсивностью (I₀) частично ослабляется и интенсивность выходящего луча (I) будет меньше. Это ослабление происходит вследствие абсорбции части световой энергии луча молекулами определяемого вещества.

Измерение интенсивности светового луча, прошедшего через раствор с исследуемым веществом, всегда производится в сравнении с контрольным раствором, при приготовлении и исследовании которого, используются те же растворитель и кюветы. Поэтому поглощение светового луча стенками кювет и растворителем могут не учитываться.

Зависимость между величиной светопоглощения монохроматического светового луча и концентрацией раствора выражается законом Ламберта-Бэра, математическое выражение которого имеет вид I=I₀10^ecl, где

I₀- первоначальная интенсивность светового потока; I - интенсивность света прошедшего через раствор; l - толщина слоя раствора;

с - концентрация исследуемого вещества в растворе; е - молярное погашение.

При постоянной длине волны поглощаемого света и при одной и той же температуре молярное погашение является постоянной величиной для каждого вещества.

Уравнение Ламберта-Бэра связывает величину светопоглощения и концентрацию раствора, однако пользоваться им в таком виде неудобно, так как величина, подлежащая определению (концентрация), находится в показателе степени. После преобразования и логарифмирования оно принимает вид: lgI0/I=ECl

Левую часть уравнения обозначают буквой А (иногда Д или Е) и называют оптической плотностью или экстинкцией. Таким образом экстинкцией или оптической плотностью называют логарифм отношения интенсивности света входящего в раствор к интенсивности выходящего из раствора света А=Е-С1

Отсюда следует, что если в качестве единицы измерения пользоваться экстинкцией, то при постоянной толщине слоя раствора она прямо пропорционально концентрации вещества в растворе. Экстинкция представляет уже фотометрическую величину, легко поддающуюся определению. Для того, чтобы перейти от экстинкции к концентрации, необходимо величину экстинкции сопоставить с какой либо единицей концентрации. Для этого пользуются двумя методами: методом эталонного раствора и методом калибровочного графика.

Метод эталонного раствора состоит в том, что определяют оптическую плотность (экстинкцию) исследуемого и эталонного раствора, концентрация которого известна. Экстинкция, как отмечалось, прямо пропорциональна концентрации:



С_Иссл./С_Эталон А_иссл./АОТКуДа С_иссл. А_иссл

Где С иссл. - концентрация веществ в исследуемом растворе; С эталон - концентрация веществ в эталонном растворе; А иссл. - экстинкция исследуемого раствора; А эталон - экстинкция эталонного раствора.

Метод калибровочного графика заключается в том, что зависимость между экстинкцией и концентрацией выражают графически. Для построения калибровочного графика готовят серию эталонных растворов с различной концентрацией и определяют соответствующие им значения экстинкций. Затем на оси абсцисс откладывают значения концентраций, а на оси ординат - значения экстинкций. В результате получается график, где зависимость экстинкция - концентрация, выражается в соответствии с законом Ламберта-Бэра прямой линией. Построив такой график для какого- либо вещества и определив значение экстинкции исследуемого раствора, находят значение его концентрации.

При проведении фотометрических исследований необходимо иметь в виду, что величина оптической плотности раствора (экстинкции) не должна превышать 1 (90% поглощения падающего света). Эта крайняя величина, выше которой трудно получить достоверные данные. Наиболее точные значения достигаются при значениях экстинкции в диапазоне 0,2-0,6.

При проведении биохимических исследований лучше всего использовать кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Использование более длинных кювет нежелательно, так как чем длиннее и уже кювета, тем тяжелее соблюдать требования, предъявляемые к фокусировке и юстировке луча света. Оптимальными объемами жидкости для фотометрии является 0,5-1 мл. При объемах менее 0,5 мл снижается точность отмеривания реагентов, при больших - нерациональный расход реактивов.

Более точным будет процесс фотометрирования при использовании проточных кювет, когда отпадает необходимость каждый раз вынимать кювету из фотометра для заполнения ее новой порцией исследуемого раствора.

При проведении фотометрических исследований оценку результатов чаще всего проводят двумя способами: по конечной точке (измерение в конечной точке), и кинетическое измерение.

Кинетический метод исследования заключается в том, что определяют количество продукта через определенные интервалы времени не останавливая реакции. Из полученных значений с использованием определенных коэффициентов, соответствующих температуре инкубации, рассчитывают среднюю величину.

Кинетические методы имеют ряд преимуществ перед методом конечной точки: они более точные и требуют небольших затрат времени, не связаны с применением агрессивных жидкостей, позволяют получить более достоверные результаты.

Турбидиметрия. Для анализа взвесей, суспензий, эмульсий и других мутных сред используют турбидиметрический метод анализа, также основанный, на величине светопоглощения этими мутными средами. При турбидиметрическом методе анализа, интенсивность светового потока проходящего через раствор уменьшается вследствие поглощения и рассеивания света взвешенными частицами. Закономерности погашения светового потока будут подчиняться закону Ламберта-Бэра. Турбидиметрические определения можно проводить с помощью тех же приборов, что используются для окрашенных растворов.

Турбидиметрический метод широко используется для оценки проб коллоидной устойчивости белков (тимоловой, цинк-сульфатной и др.), а также для исследования системы свертывания крови, с использованием специальных приборов-коагулометров, агрегометров. На принципе турбидиметрии разработан турбидиметр, предназначенный для определения количества эритроцитов в периферической крови (MF 4020)

В настоящее время в клинико-лабораторной практике используют иммунотурбидиметрические исследования, основанные на регистрации образования иммунных комплексов антиген- антитело, сопровождающихся образованием соответствующего преципитата. Эти методы позволяют проводить оценку иммунного статуса организма и количественно определить специфические белки (иммуноглобулины, белки острой фазы и др.).

Нефелометрия. Для анализа коллоидных растворов используется нефелометрический метод анализа, или нефелометрия, основанный на измерении интенсивности света, рассеянного коллоидными частицами. Если такой раствор осветить сбоку, а при этом смотреть на него сверху, то часть света, рассеиваемая частицами, попадает в глаза наблюдателя.

Поэтому при нефелометрических определениях измеряют интенсивность рассеянного света в направлении перпендикулярном к направлению первичного пучка света.

Чем больше частиц находится в растворе, тем больше света будет рассеяно. Интенсивность светового потока рассеиваемого небольшими твердыми частицами описывается уравнением Рэлея. В это уравнение входят как величины, зависящие от конструктивных особенностей нефелометров, так и особенностей приготовления растворов. Если его упростить с учетом того, что определение ведется с использованием прибора одного типа и растворов одинаковой структуры, оно приобретает простой вид:

I= I0-K-C, где

I - интенсивность рассеянного света;

I₀ - интенсивность падающего света;

K - константа; С - концентрация.

Отсюда следует, что интенсивность рассеянного светового потока прямо пропорциональна концентрации. Поэтому, как и в других случаях фотометрических определений, здесь можно пользоваться методами эталонного раствора или калибровочного графика.

В настоящее время нефелометрия проводится с использованием лазерных нефелометров и также как иммунотурбидиметрия позволяет вести определение в плазме крови специфических белков, определяющих иммунный статус организма и его нарушение (С3 и С4 - компоненты комплемента, иммуноглобулины G,A,M, церулоплазмин, альфа-2 макроглобулин, С- реактивный белок, ревматоидный фактор и др.).

Атомно-абсорбционный спектральный анализ основан на поглощении монохроматического света атомами вещества, находящегося в раскаленном газе (в пламени газовой горелки). Атомы исследуемого элемента, находящегося в виде атомного пара, поглощая свет определенной длины волны, переходят в возбужденное состояние.

A+hv = A*, где

А - атом в невозбужденном состоянии;

A* - атом в возбужденном состоянии;

h - постоянная Планка; v - частота излучения.

Наиболее вероятным изменением энергетического состояния атома при возбуждении является его переход на уровень ближайший к основному энергетическому состоянию, т.е. резонансный переход.

Если на невозбужденные атомы направить излучение с частотой равной частоте резонансного перехода, кванты света будут поглощаться атомами исследуемого элемента и интенсивность излучения будет уменьшаться. Таким образом, интенсивность излучения будет обратно пропорциональной числу невозбужденных атомов.

Уменьшение интенсивности резонансного излучения в условиях атомно-абсорбционной спектроскопии подчиняется закону Ламберта-Бэра



lgIc/I=KTC, где

К - коэффициент поглощения света;

l - толщина светопоглощающего слоя (пламени);

С - концентрация.

Постоянство толщины светопоглощающего слоя достигается с помощью горелок специальной конструкции (рис. 4, см. стр. 19). Анализируемый раствор вводится с помощью распылителя в пламя газовой горелки.

Для количественных расчетов используют метод калибровочного графика, т. е. измеряют оптическую плотность нескольких стандартных растворов и строят график в координатах: оптическая плотность- концентрация. Затем в тех же условиях определяют оптическую плотность анализируемого раствора и по калибровочному графику находят его концентрацию.

Использование современных атомно-абсорбционных спектрофотометров позволяет определять до 50 различных элементов. Они позволяют определить многочисленные макро и микроэлементы в биологических жидкостях, сточных водах, вытяжках из кормов и др.

Эмиссионная фотометрия

Наряду с методами абсорбционного фотометрического анализа в клинической биохимии довольно широко используются и методы эмиссионной фотометрии (пламенная фотометрия, флюориметрия) которые основаны на учете интенсивности светоизлучения (эмиссии) исследуемым веществом.

Пламенная фотометрия. Основана на излучении света атомами веществ, испаряемых в пламени газовой горелки. Сущность метода заключается в том, что раствор анализируемого вещества в распыленном виде подается в пламя газовой горелки, где происходит его испарение. Атомы анализируемого вещества, поглощая энергию переходят на более высокие энергетические уровни. Возвращаясь на исходный стационарный уровень электроны испускают избыточную энергию в виде квантов световой энергии. Длина волны испускаемого света, зависящая от структуры электронной оболочки атома позволяет идентифицировать химический элемент, а интенсивность свечения его основной, так называемой характеристической линии спектра, выделяемой с помощью интерференционного светофильтра позволяет судить о количественном его содержании.

Метод широко используется при исследовании наиболее легковозбудимых щелочных металлов - натрия, калия, лития, так как в этих случаях может использоваться сравнительно низкая температура пламени. Химические методы определения этих элементов сложны и неточны, поэтому в клинико-биохимических лабораториях их определяют методом пламенной фотометрии.

При использовании высокотемпературного пламени и чувствительных регистрирующих устройств методом пламенной фотометрии можно определять до 50 элементов. Для определения используются пламенные фотометры различных марок, работа с которыми проводится в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Для количественного расчета используют метод калибровочных графиков, которые строят по серии стандартных смесей. После каждой серии исследований калибровочный график следует проверять. Кроме калибровочных графиков, пользуются также методом ограничивающих образцов, т. е. наряду с исследуемым раствором, проводят определение 2 контрольных с меньшей и большей концентрацией исследуемого элемента.

Пламенная фотометрия используется при анализе крови, мочи, молока, спинномозговой жидкости и др.

Флюориметрия. Излучение света происходит не только в результате нагревания, но при других явлениях (электрическом разряде в газах, некоторых химических процессах, при облучении ультрафиолетовым излучением). Все виды самосвечения, кроме свечения тел при нагревании, называют холодным свечением или люминисценцией.

В зависимости от длительности свечения различают флюоресценцию, когда люминесцентное излучение гаснет практически одновременно с прекращением возбуждения и фосфоресценцию, когда после прекращения возбуждения, излучение продолжается еще некоторое время. Люминесценция, возникающая под действием оптического излучения, называется фотолюминесценцией. Фотолюминесценция наблюдается у многих жидких и твердых тел, как неорганической, так и органической природы.

Качественное и количественное определение вещества, основанное на учете интенсивности его флюоресценции, называют флюориметрией, а приборы - флюориметрами (рис. 6, см. стр. 19). В отличие от фотоэлектроколориметров в них всегда используется источник ультрафиолетового света.

Физический смысл флюоресценции заключается в том, что молекула исследуемого вещества поглощает квант света возбуждения и при этом переходит в новое энергетическое состояние. Через очень небольшой промежуток времени она излучает избыточную энергию в виде кванта света флюоресценции. Количественные методы, базирующиеся на эффекте флюоресценции основаны на том, что при освещении светом одинаковой интенсивности, интенсивность флюоресценции пропорциональна содержанию исследуемого вещества. Так как такая зависимость существует обычно в узком диапазоне концентраций, то при проведении флюориметрических определений необходимо установить наиболее приемлемую область исследования.

Флюриметрические методы могут быть основаны на собственной флюоресценции исследуемых веществ или продуктов их расщепления. Разработан также «зондовый» вариант метода, базирующийся на регистрации флюоресцении специальных зондов, избирательно поглощаемых исследуемыми веществами (например, так проводится определение атерогенных липопротеинов в плазме крови).

Методы флюориметрии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Флюориметрические анализаторы «Флюорат» (Россия) и др. можно с успехом использовать для определения витаминов, ферментов, гормонов, субстратов, микроэлементов, мониторинга многих лекарственных веществ.

Рефрактометрия. Под рефракцией понимают изменение направления луча света при переходе из одной среды в другую. Рефрактометрия означает измерение преломления света, она оценивается по величине показателя преломления. Величина показателя преломления зависит от состава вещества, от того, в какой концентрации и какие молекулы встретит световой луч на своем пути. Именно на этой зависимости основан рефрактометрический анализ, использующийся для идентификации индивидуальных веществ и контроля их чистоты, определения строения неорганических и органических соединений, количественного анализа растворов. Достоинством метода является то, что измерение показателя преломления является весьма простой операцией, которая может быть осуществлена с высокой точностью и затратой очень малого количества вещества и времени. Обычно рефрактометры обеспечивают точность до 10^-3%. При применении некоторых специальных методов рефрактометрии точность может быть увеличена на несколько порядков.

В лабораторных химических и биохимических исследованиях рефрактометрический анализ чаще всего используется для анализа растворов (белка, сахара и др.). Для определения концентрации растворов по показателям преломления пользуются методом калибровочного графика. Для этого определяют показатели преломления для ряда стандартных растворов, содержание компонентов в которых известно. На основании полученных данных вычерчивают калибровочный график в координатах: состав- показатель преломления. Измерив показатель преломления раствора с помощью рефрактометра (в клинической лабораторной практике используются, как правило, рефрактометры типа Аббе), по графику определяют его состав.

Для многих водных растворов кислот, оснований, солей, как и для растворов сахарозы, различных спиртов, белка показатели преломления при различных концентрациях и температурах измерены и сведены в таблицы, которыми пользуются при проведении исследований.

биохимический эмиссионный фотометрия клинический

Электрофорез и хроматография

В процессе проведения биохимического анализа при клинико-лабораторных исследованиях часто возникает необходимость предварительного выделения анализируемых веществ, отделения их от других компонентов, находящихся в исследуемом биологическом материале. Для этих целей чаще всего используются такие физико-химические методы, как электрофорез и хроматография.

Электрофорез. Под электрофорезом понимают процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Многие биологически важные молекулы (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) имеют в своем составе ионизирующие группы. Поэтому в биологических жидкостях (крови, лимфе и др.) они существуют в виде катионов и анионов. Помимо этого молекулы имеющие примерно одинаковый заряд могут отличаться молекулярными массами и отношением заряда к массе. На этих различиях и основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.

Скорость перемещения зависит от величины заряда, а также в ряде случаев, от размера и формы молекул. Так как в большинстве случаев молекулы отличаются по своим физическим и химическим свойствам то очень немногие из них имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.

В зависимости от способа проведения электрофореза его делят на свободный или фронтальный, когда электрофоретическое разделение осуществляется в водной фазе и зональный, т.е. электрофорез на поддерживающей среде, когда разделение осуществляется на каком-либо инертном носителе (бумага, асбестовые пластины, целлюлоза, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели и др.).

Суть зонального электрофореза заключается в том, что раствор смеси веществ подлежащих разделению вводят на определенный участок носителя, пропитанного электролитом. Биологический материал, подлежащий электрофоретическому разделению, растворяют или суспензируют в буфере, чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель. В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, в остальной части цепи - электронами. После снятия электрического поля ионы исследуемой смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью.

В клинико-лабораторных исследованиях чаще используется зональный электрофорез на агаре или полиакриламидном геле. При наложении электрического поля частицы подлежащей разделению смеси придут в состояние направленного движения (будут двигаться к противоположно заряженному полюсу) и распределятся на носителе в виде отчетливых зон, которые легко обнаружить соответствующим аналитическим методом.

Важными характеристиками процесса зонального электрофореза являются градиент потенциала (В/см) и сила тока, приходящаяся на 1 см поперечного сечения полосы (плотность тока - мА/см).

Под градиентом потенциала понимают падение напряжения на 1 см носителя расположенного между электродами. В зависимости от градиента потенциала различают низковольтный электрофорез (5-15 В/см) и высоковольтный (более 50 В/см). Низковольтный электрофорез используется для разделения высокомолекулярных соединений типа белков, липопротеинов, гликопротеинов и др. Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, типа аминокислот, их производных и др. Так как различие в заряде и молекулярной массе у таких веществ невелико, то нужен большой градиент потенциала, чтобы произошло эффективное разделение частиц. Так как при этом происходит значительное разогревание носителя, требуются специальные устройства для его охлаждения.

В зависимости от целей исследования электрофорез делят на аналитический и препаративный. В клинико-биохимических исследованиях используют обычно аналитический электрофорез, который позволяет работать с очень небольшими количествами исследуемого вещества и вести их количественное определение. В тех случаях, когда требуется получить большое количество изучаемого вещества, необходимого для дальнейших исследований используют препаративный вариант электрофореза.

В настоящее время для анализа биологических смесей все шире используется капиллярный электрофорез, при котором электрофоретическое разделение проводится в тонких капиллярах диаметром 25-200 мкм и длинной 10-100 см, заполненных буферным раствором. Под действием электрического поля (электрофорез проводится при напряжении 10000-30000 В) в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к отрицательному полюсу, вместе с которым перемешаются и компоненты подлежащие разделению. В зависимости от заряда и массы скорость их движения будет различной, что приводит к фракционированию смеси. В концевой точке капилляра разделенные компоненты количественно определяют, используя различные оптические детекторы Близким к электрофорезу является метод изоэлектрического фокусирования, когда разделение белков и некоторых других анализируемых веществ идет в зависимости от величины их изоэлектрических точек.

Изоэлектрической точкой называют такое состояние белковой молекулы, при котором ее суммарный заряд равен нулю. В методе изоэлектрического фокусирования вначале между электродами устанавливают градиент рН с помощью веществ особой химической природы, получивших название амфолитов-носителей. Заряженные молекулы белков в ходе опыта будут двигаться в направлении противоположно заряженного электрода в соответствии с их действительным зарядом. Так как молекулы белков амфотерны, то при перемещении в градиенте рН их суммарный заряд будет меняться до тех пор, пока он не станет равным 0. Это произойдет в том месте, где величина рН будет равна изоэлектрической точке. Поэтому молекулы с одинаковой изоэлектрической точкой сконцентрируются в одной узкой зоне.

Хроматография. Это метод разделения и анализа многокомпонентных систем, основанный на использовании явлений сорбции и десорбции в динамических условиях. В процессе хроматографии происходит многократное повторение актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новым участком сорбента и частью сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

Методы хроматографического анализа различаются: по агрегатному состоянию системы, в которой проводится разделение на газовую и жидкостную: по механизму разделения - на адсорбционную, распределительную, ионообменную, гель-хроматографию, аффинную и др. В ряде случаев разделение оказывается результатом нескольких одновременно протекающих процессов с различными механизмами. Это приводит к образованию хроматограммы смешанного типа, но один из процессов всегда является доминирующим (рис. 9 и 10, см. стр. 20-21).

В газовой хроматографии подвижной фазой является газ. В зависимости от состояния неподвижной фазы газовая хроматография подразделяется на газо-адсорбционную, когда неподвижной фазой является твердый адсорбент и газо-жидкостную, когда неподвижной фазой является жидкость, или точнее пленка жидкости на поверхности частиц твердого адсорбента.

Жидкостная хроматография основана на адсорбции твердым веществом, играющим роль неподвижной фазы, определяемых компонентов, находящихся в растворенном состоянии.

В основе адсорбционной хроматографии лежит различная сорбируемость разделяемых веществ на твердом сорбенте в соответствии с их сродством к адсорбенту. При этом сорбируемость растворителя должна быть незначительной по сравнению с таковой анализируемой смеси. Процесс адсорбции зависит от свойства адсорбента, адсорбируемых соединений, растворителя. В зависимости от этих свойств вещества, подлежащие хроматографическому разделению, образуют адсорбционный ряд выражающий относительное адсорбционное сродство его членов к адсорбенту. Образующееся в колонке адсорбента зональное распределение веществ соответствует их положению в адсорбционном ряду. В качестве адсорбентов в адсорбционно-жидкостной хроматографии применяются органические и неорганические вещества: сахароза, крахмал, оксид алюминия, силикагель, активированный уголь и др.

Ионообменная хроматография основана на способности некоторых твердых веществ (ионитов) обмениваться ионами с подлежащими разделению веществами. Применяемые в ионообменной хроматографии иониты могут быть как органическими, так и неорганическими. Способность к ионному обмену определяется строением ионита, представляющего собой каркас, на котором закреплены активные группы (-СООН, -SO3H, - NH₃Cl, -NH₂Cl и др.). В зависимости от обмена катионов или анионов иониты делят на катиониты, аниониты и амфолиты. На принципах ионообменной хроматографии основано разделение аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Распределительная хроматография основана на распределении компонентов разделяемой смеси между несмешивающимися фазами. Образующая неподвижную фазу жидкость находится на поверхности или в порах твердого носителя, на который наносится смесь веществ, подлежащих разделению. Затем создают ток подвижного растворителя. Чем лучше вещество растворимо в жидкости, играющей роль подвижной фазы, тем дальше оно продвинется по направлению тока растворителя. Вещества, плохо растворимые в подвижной фазе, расположатся ближе к точке нанесения. В зависимости от техники выполнения распределительная хроматография выполняется как колоночная, бумажная или тонкослойная. Методика распределительной хроматографии в колонках аналогична адсорбционной или ионообменной: вначале в колонку с носителем и закрепленным на нем неподвижной фазой вводят небольшой объем раствора смеси компонентов и затем промывают колонку подвижным растворителем.

При бумажной хроматографии разделение проводят на полосах бумаги, где роль неподвижной фазы играет вода, удерживаемая гидрофильными целлюлозными волокнами бумаги, а подвижной фазой является какой-либо органический растворитель. В каждый момент имеет место определенное перераспределение разделяемых компонентов между слоем органического растворителя и водой. В результате одни вещества движутся быстрее вслед за фронтом органического растворителя, другие в той или иной степени отстают, а некоторые вообще остаются на стартовой линии.

При тонкослойном варианте разделение идет в тонком слое носителя. Чаще всего для этих целей используются пластинки из силикагеля (например, Silufol) широко используемые для фракционирования липидов, аминокислот и других биосубстратов.

Гель-хроматография основана на различии в размерах и молекулярных массах белков и других макромолекул, являющихся важнейшей характеристикой молекулы. В качестве материала-носителя в гель- хроматографии используется сшитый декстран (сефадекс), сшитый полиакриламид (биогель Р) и агароза. Они получили широкое распространение как в аналитической, так и в препаративной лабораторной работе, а также в производстве, в химической и биологической промышленности.

Колонка с сефадексом действует по принципу «молекулярного сита». Молекулы большие, чем самые крупные поры разбухшего сефадекса не могут проникать в гранулы и сравнительно быстро проходят в жидкой фазе вне частиц геля, поэтому элюируются первыми. В настоящее время имеется большое число сефадексов, позволяющих разделить белки и полипептиды в диапазоне молекулярных масс от 700 до 800000 Да.

Были разработаны также хроматографические материалы для разделения белков, путем связывания некоторых ионообменных групп с сефадексами. Полученные производные-ДЭАЭ-сефадекс, КМ-сефадекс и другие широко используются при хроматографии.

Аффинная хроматография или (биоспецифическая по сродству хроматография), основана на принципе специфического взаимодействия с особыми веществами (лигандами), закрепленными на носителе. Биологические макромолекулы обладают способностью обратимо связывать многие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами, антитела взаимодействуют с антигенами, мРНК с комплементарной ДНК и т. д. Все эти взаимодействия строго специфичны. Образование специфических комплексов биологических макромолекул, способных в определенных условиях к диссоциации лежит в основе метода разделения получившего название аффинной хроматографии. Если закрепить один из компонентов этого комплекса на матрице, иммобилизовать его, то получится специфический сорбент для второго компонента (аффинат). Нерастворимые аффинаты готовят обычно путем ковалентного присоединения лиганда к нерастворимому носителю. Если смесь белков пропустить через колонку, заполненную таким аффинатом, то все молекулы, которые не обладают сродством к лиганду, закрепленному на носителе пройдут не задерживаясь, а белок имеющий сродство к аффинному лиганду будет адсорбироваться на колонке. Вымыть адсорбированный белок с колонки можно буферными смесями с измененной величиной рН, ионной силой, а также введением в состав элюента веществ, ослабляющих связи между белками и лигандами.

Одними из первых биоспецифических сорбентов, были антигены ковалентно связанные с нерастворимым носителем. Они были использованы для получения моноспецифических антител. Затем аналогичным путем были получены иммобилизованные ферменты. Стало возможным создание ферментных реакторов для получения различных веществ с использованием иммобилизованных ферментов.

Потенциометрия (ионометрия)

Из других физико-химических методов в клинико-биохимических исследованиях широко используется потенциометрический метод исследования. Он основан на измерении ЭДС цепей составленных из индикаторного электрода, потенциал которого зависит от активности (концентрации) исследуемого иона и электрода сравнения. Так как потенциал индикаторного электрода зависит от концентрации исследуемого иона в растворе, измерение ЭДС позволяет определить количество соответствующих ионов. Различают прямые и косвенные потенциометрические методы. Прямые методы используют для непосредственного определения концентрации иона по значению потенциала индикаторного электрода.

Косвенные потенциометрические методы используются для определения точки эквивалентности в титриметрическом анализе (потенциометрическое титрование). Наиболее широкое распространение в клинико-биохимической практике получило потенциометрическое определение рН биологических жидкостей.

Для определения концентрации водородных ионов используют обычно стеклянный электрод малочувствительный к разным влияниям. Его можно применять для определения рН растворов содержащих соли тяжелых металлов, окислители и восстановители и в широком диапазоне значений рН.

В биохимической лабораторной практике используются рН-метры самых различных марок, работа на которых проводится согласно инструкции прилагаемой к каждому прибору. Разработаны различные модификации рН-метров предназначенных для специальных целей: определения рН крови, молока и молочных продуктов, тканей, содержимого желудка и др. Разновидностью рН-метров являются приборы для измерения показателей кислотно-щелочного состояния (АЗИВ, прибор Аструпа и др.)

В настоящее время при биохимических исследованиях применяются и другие ионоселективные электроды, потенциал которых зависит от одного определенного иона из многих находящихся в растворе. Используются ионоселективные электроды разных типов с помощью которых можно определить не только водородные, но и практически любые катионы и многие из анионов. В биологических исследованиях эти электроды применяются для определения натрия, кальция, магния и других металлов, из анионов чаще всего хлорид и нитрит-ионов. Ионоселективные электроды получили распространение и при определении активности ряда ферментов. Это возможно в том случае, когда в результате ферментативной реакции образуется или расходуется электрохимически активный компонент.

В клинико-биохимических исследованиях используются автоматические и полуавтоматические ионоселективные анализаторы различных типов: анализаторы семейства Экотест, иономер ЭЦ-59 «Кварти-мед», (Россия), иономеры И-130, И-160, АнИон (Беларусь). Они позволяют вести определение калия, натрия, хлорид-ионов в крови и других биологических жидкостях.

Иммунохимические методы в клинической биохимии

В клинической лабораторной практике широко используются иммунохимические методы для определения традиционных биохимических объектов-белков, ферментов, гормонов, медиаторов, фармакологических препаратов и др. Достоинством их является высокая чувствительность и специфичность. Внедрение иммунохимических методов - один из способов дальнейшего совершенствования диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, так как многие серологические и аллергические методы, используемые в настоящее время для диагностики ряда важнейших заболеваний (туберкулез, бруцеллез, колибактериоз, сальмонеллез и др.), не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Основой успеха в иммунохимических исследованиях является получение иммунных сывороток высокого титра и нужной специфичности. Методы получения иммунных сывороток до настоящего времени остаются в основном эмпирическими. Различия в иммунологической реактивности у разных животных могут зависеть от возраста, пола, живой массы, состояния нервной и эндокринной систем, полноценности рациона, условий содержания и ухода, а также ряда других факторов, иногда очень трудно поддающихся учету и стандартизации. Поэтому иммунные сыворотки, полученные даже от животных одного вида и при одинаковой схеме иммунизации, могут резко отличаться как по титру, так и по набору антител.

При получении иммунных сывороток необходимо учитывать следующие основные условия.

1. Приготовление антигена. Он должен быть максимально очищен от примесей, что предотвращает появление антител с иной специфичностью. В тоже время очень важно учитывать лабильность антигенов, невысокую устойчивость к действию различных факторов и возможность их денатурации в процессе очистки.

2. Наиболее подходящая схема иммунизации для каждого конкретного случая выбирается эмпирически. Для стимуляции антителообразования используют различные адъюванты. Лучше брать небольшие дозы антигена, так как в этом случае сокращается расход ценных препаратов и уменьшается вероятность образования побочных антител.

3. Оценка полученной сыворотки обязательна, так как предсказать заранее ее качество невозможно. Проверке обычно подлежит титр антисыворотки, ее специфичность и авидность антител. Иммунная сыворотка должна быть по возможности более высокого титра и специфична, т. е. давать реакцию только с теми антигенами, которые подвергаются исследованию. Высокая авидность указывает на выраженное родство антигена и антитела.

Абсорбция и фракционирование иммунных сывороток. При фракционировании используют электрофоретические, хроматографические методы, выделение с помощью неорганических и органических (спирт, ацетон) осадителей, изоэлектрофокусирование и любой другой препаративный метод, позволяющий произвести очистку иммунной сыворотки и выделение антител нужной специфичности.

При проведении клинико-биохимических исследований наиболее широко используются реакция иммунодиффузии в геле (РИД), иммуноэлектрофорез, радиоиммунологический анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА) и некоторые другие.

Реакция иммунодиффузии в геле (РИД) используется для анализа многокомпонентных белковых систем, сравнительного анализа антигенной структуры белков и других антигенов. В основе этого метода лежит способность антигенов и антител диффундировать с различной скоростью, в результате чего эквивалентные соотношения определенных антигенов и антител достигаются в различных частях геля, где образуются соответствующие им линии преципитации.

По этому методу анализ проводится в плоской пластине агара, что позволяет разместить несколько различных антигенов вокруг резервуара с иммунной сывороткой и тем самым провести их сравнительный анализ. Основные положения, которые необходимо учесть при постановке двойной диффузии в геле, следующие:

1. Образование преципитата происходит в довольно узкой зоне эквивалентности, соответствующей такой концентрации антигена и антител, при которой оба компонента полностью включаются в преципитат.

2. Один антиген дает только одну зону преципитации.

3. Если в растворе присутствуют не один, а несколько антигенов, они ведут себя независимо друг от друга. Образуется столько линий преципитации, сколько имеется пар антиген-антитело.

4. Количество образующихся зон преципитации соответствует минимуму присутствующих в системе комплексов антиген-антитело.

5. Антигены и антитела, имеющие примерно равный коэффициент диффузии, образуют прямую полосу преципитации.

6. Если оба компонента используются примерно в эквивалентных количествах, то полоса преципитации располагается на равном удалении от резервуара с антигеном и антителом.

7. Если концентрация антигенов выше концентрации антител, то полоса преципитации располагается ближе к резервуару, содержащему антитела и наоборот. При значительном избытке одного из компонентов линия преципитации может быть «загнана» или в резервуар с антигеном, или в резервуар с антисывороткой и вообще не наблюдаться.

8. Если линию преципитации образует антиген с низкой молекулярной массой, то полоса преципитации при прочих равных условиях располагается ближе к резервуару с иммунной сывороткой.

Возможны три основных варианта результата двойной диффузии в геле: слияние линий преципитации (реакция идентичности), перекрещивание линий преципитации (реакция неидентичности), совмещение первого и второго случаев (реакция частичной идентичности - «шпора» или «двойная шпора»).

Радиоиммунологический анализ (РИА). Впервые этот метод был разработан для количественного определения инсулина с использованием гормона, меченого радиоактивным изотопом иода. В основе метода лежала конкуренция между нативным инсулином плазмы и меченым ¹³¹I - инсулином за ограниченное число специфических мест связывания на антителах к инсулину.

Для того, чтобы использовать метод радиоиммунологического анализа, необходимы: очищенный определяемый антиген, меченый антиген, связывающий агент, которым является моноспецифическая антисыворотка, метод разделения свободного и связанного лиганда.

Связывание радиоактивного меченого антигена с ограниченным количеством антител можно уменьшить добавлением немеченого антигена (определяемого вещества). По уменьшению связанного радиактив- ного антигена судят о количестве определяемого вещества.

Связанный в иммунных комплексах меченый антиген отделяют с помощью различных методов. В этих целях используют электрофорез и хроматографию, адсорбцию с помощью талька, активированного угля и других адсорбентов, фракционирование различными органическими и неорганическими реагентами, осаждение иммунных комплексов с помощью антиглобулиновой сыворотки (двойная система антител) и др. После удаления несвязанного антигена количество связанной метки определяют радиометрически.

Помимо классического РИА его можно приводить в твердофазном варианте. Принцип метода заключается в том, что твердую поверхность (чаще пластиковый планшет) нагружают антителами, а затем добавляют исследуемый раствор, содержащий определяемый антиген. К образующемуся на носителе комплексу антиген-антитело, после отмывания несвязавшегося антигена, добавляют избыток радиоактивно меченых антител. Количество связавшейся радиоактивной метки будет зависеть от количества антигена фиксированного на твердом носителе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ можно проводить адсорбируя на пластиковой панели антиген, который связывает исследуемые антитела (например Ig G, содержащиеся в сыворотке крови овец). После отмывания остальных белков определяют количество связавшихся антител добавляя меченые ¹²⁵I антитела кролика к Ig G овцы, а затем удаляя избыток меченого реагента. Количество радиактивной метки связанной в лунках пластиковой панели пропорционально количеству определенных антител.

С помощью радиоиммунологического анализа уже сейчас возможно определение более 300 биологически активных соединений, но наиболее широко он используется в эндокринологии.

Радиоиммунологический метод можно использовать и для определения низкомолекулярных соединений. В этом случае коньюгируют определяемые вещества с белками или другими высокомолекулярными соединениями для придания им антигенности. Именно таким путем разработаны радиоиммунологические методы определения простагландинов.

В настоящее время радиоиммунологический анализ проводят с помощью стандартных диагностических наборов, в которые входят все необходимое (реагенты, посуда, инструкция по применению), выпускаемые заводским способом. При наличии таких наборов радиоиммунологическое определение биологических объектов сводится к последовательному выполнению определенных операций и замеру радиоактивности.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В начале семидесятых годов (1971-1972 г.г.) был разработан метод иммуноферментного анализа, в основе которого также как и метода РИА лежал закон действия масс, но вместо радиоактивной метки была использована ферментативная. Метод иммуноферментного анализа имел ряд преимуществ перед методом радиоиммунологического анализа.

1. В нем не использовались радиоактивные изотопы. Отсутствие радиационной опасности значительно упрощало условия проведения (специальные помещения, оборудование и т. д.).

2. Гораздо большая устойчивость меченых соединений (в РИА она определяется периодом полураспада изотопов).

3. Возможность быстрого определения результатов ферментативной реакции с помощью обычных общедоступных приборов (фотометров). Возможность даже визуальной оценки реакции.

4. ИФА легко поддается автоматизации.

Так же как и в РИА специфичность и чувствительность ИФА в сильной степени зависят от качества иммунной сыворотки. Необходимо использовать только высокоавидные и высокоспецифические антитела.

Широкое распространение метод ИФА получил при определении антител против бактериальных и вирусных антигенов таких как 0-антиген сальмонелл, 0-антиген и экзотоксин холерного вибриона, 0- антигенов бруцелл, М-белка стрептококков, антигенов микоплазм, рикетсий. Метод успешно применяется для обнаружения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, вируса болезни Ньюкасла, диагностики бруцеллеза, трихинеллеза, чумы свиней и др.

Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гаптенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.

Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные(твердофазные, ELISA) и гомогенные(БМ.ТТ ) отличающиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях(как правило пластик). Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения комплекса (меченое ферментом соединение - связывающий агент) от свободного меченого соединения. Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) используемого в качестве метки антигена.

В настоящее время разработано много вариантов ИФА-анализа. Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, основными из которых являются молекулярная масса и валентность антигена, необходимый предел чувствительности, состав среды в которой необходимо определить антиген, свойства фермента, возможность получения антигенов и антител в чистом виде и многое другое.

Методы твердофазного (гетерогенного) ИФА, применение которых сопряжено с необходимостью разделения связавшихся антигенов разработаны для целого ряда разнообразных антигенов и антител. Среди этих методов можно выделить 2 типа: это методы последовательного (или неконкурентного) анализа и конкурентного анализа.

Метод неконкурентного анализа связан с осуществлением двухстадийного процесса. На первой стадии антитела адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с ним взаимодействуют с антигеном. Несвязавшиеся компоненты отмывают и затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с ферментом. Вторая стадия процесса также завершается отмывкой несвязавшихся компонентов реакционной смеси после чего в систему вводят соответствующий субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции.

При конкурентном гетерогенном анализе присутствующие в реакционной среде одновременно связанные и несвязанные с ферментативной меткой антигены (гаптены) вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными на твердом носителе антителами. После инкубации избыток не связавшихся компонентов отмывают и в систему добавляют соответствующий субстрат.

Вариант конкурентного анализа может использоваться как для определения антигенов, так и определения антител.

Принцип метода при определении антигенов заключается в том, что к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и синтезированный конъюгат антигена с ферментом. Определяемый и меченый антигены конкурируют за центры связывания антител. После определенного времени инкубации происходит перераспределение ферментного конъюгата между раствором и носителем. Измеряемая в растворе или на твердой фазе после промывки, концентрация метки пропорциональна (количественно связана) с начальной концентрацией определяемого антигена и после предварительной калибровки системы служит характеристикой его содержания в анализируемом образце.