Методы исследования первичного гемостаза

30

Министерство здравоохранения Украины

Лубенское медицинское училище

Дипломная работа

Из гематологии

На тему: Методы исследования первичного гемостаза

Выполнила: студентка группы Ф-31

Агапкина Ангелина

Лубны 2009



План

1. Методы исследования первичного гемостаза…........................................…...3

Использованная литература……………………………………….....................30



1. Методы исследования первичного гемостаза

Первичный (микроциркуляторный, или сосудисто-тромбоцитарный) гемостаз обусловливает все реакции гемостаза в капиллярах, венозных и артериальных сосудах до 100 мкм в диаметре. Заканчивается процесс формированием белого (тромбоцитарного) тромба, который после вязкого метаморфоза тромбоцитов и ретракции сгустка надежно стягивает края поврежденного микрососуда, препятствует его дилатации и не пропускает жидкую часть крови. На этом этапе гемостаза большое значение имеют реакции сосудистой стенки, обусловленные нейрогуморальной регуляцией контролирующих систем, а также появлением биологически активных субстанций-- серотонина, тромбоксана Аг, простациклина.

I. Методы исследования сосудистого компонента гемостаза

Сосудистая стенка содержит различные факторы свертывания и фибринолиза, синтезирует мощный дезагрегант и вазодилата-тор -- простациклин. Участие сосудистой стенки в реакциях физиологического и патологического гемостаза общепризнано, хотя изучено еще недостаточно. Это связано в первую очередь с отсутствием адекватных прижизненных методов ее исследования. Существующие методы малочисленны, а получаемые результаты нередко зависят от изменений в сосудах, а также от нарушений тромбоцитарного гемостаза.

1.Пробы на резистентность капилляров

Принцип. После механического воздействия на капилляры кожи (давление, растяжение) у здорового человека не наступает каких-либо изменений. При неполноценности стенок микрососудов они приобретают повышенную ломкость, которая измеряется по их сопротивлению в ответ на различной интенсивности механическое воздействие. Давление может быть положительным (проба щипка, манжеточная проба и др.) и отрицательным (метод присосок).

1.1.Проба щипка. Производится щипок кожи над ключицей. В норме изменения в области щипка отсутствуют. При пониженной резистентности капилляров на месте щипка появляются петехии или кровоподтек, особенно отчетливо видимые через 24 ч.

1.2. Манжеточная проба. На верхней части ладонной поверхности предплечья (отступив 1,5--2 см от локтевой ямки) очерчивают круг диаметром 5 см. На плечо накладывают манжетку от аппарата для измерения артериального давления и в течение 5 мин поддерживают в ней давление 90--100 мм рт. ст. После сияния манжетки через 5 и 10--15 мин подсчитывают количество петехии в очерченном круге. В норме число петехий не превышает 10. При 11--20 петехиях проба считается слабоположительной ( + ), при 20--30 петехиях -- положительной (+ + ), при 30 петехиях и более -- резко положительной (+ + +).

Следует обращать внимание не только на число петехий, но и на их размер. При снижении резистентности капилляров петехии могут быть размером более 1 мм в диаметре.

Положительные результаты проб на резистентность капилляров наблюдаются при поражении сосудов (первичные и вторичные ва-скулиты, инфекционно-токсические процессы, С-гиповитаминоз, эндокринные нарушения в менструальный период, при климаксе), выпадении ангиотрофической функции тромбоцитов, при всех видах тромбоцитопений, при тромбоцитопатиях (тромбастении Гланцман-на, болезни Виллебранда и др.), у больных с синдромом диссеми-нированного внутрисосудистого свертывания крови, при передозировке антикоагулянтов непрямого действия и дефиците факторов протромбинового комплекса.

Пробы на резистентность капилляров способствуют выявлению у больных наклонности к кровотечениям и кровоизлияниям.

2. Время кровотечения : Принцип. Определяется длительность кровотечения из капилляров и венул кожи, целостность которых нарушена строго дозиро-ванно, с помощью укола или разреза. Проба зависит от количества и функционального состояния тромбоцитов и капилляров.

2.1.Метод Дьюка (W. W. Duke, 1910). Мочку уха согревают между пальцами в течение 1 мин, протирают спиртом и вновь со гревают настольной лампой с рефлектором до полного высыхания спирта. Стерильным ланцетом прокалывают кожу у нижне-наруж- ного края мочки уха глубиной и шириной 3 мм. Сразу же после прокола включают секундомер. Выступающие капли крови промо кают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к ранке, через каж дые 15 с. Секундомер останавливают в момент прекращения крово течения. Для получения более точного времени кровотечения про бу производят при проколе мочек обоих ушей и рассчитывают среднюю величину. Норма -- 2--4 мин.

Остановка кровотечения в первую очередь зависит от формирования в зоне поврежденных капилляров тромбоцитарного агрегата, поэтому при тромбоцитопении, нарушении функциональных свойств тромбоцитов и болезни Виллебранда время кровотечения будет увеличиваться.

С помощью метода выявляют грубые нарушения сосудисто-тром-боцитарного гемостаза. При многих тромбоцитопатиях его показания остаются нормальными. Поэтому в настоящее время чаще пользуются более чувствительными методами (A. D. Ivy с соавт., 1941; С. F. Borchgrevink и В. A. Waaler, 1958, 1960, 1961).

2.2.Проба Борхгревинка -- Ваалера -- модификация пробы Айви. Как при пробе Айви, на плечо накладывают манжет ку сфигмоманометра при давлении 40 мм рт. ст. На предплечье де лают 3 поперечных надреза глубиной 1 мм и длиной 0,08--1 см. Расстояние между надрезами должно быть около 1 см. Немедлен но включают секундомер и по той же методике, что в тесте Айви, определяют время кровотечения. Рассчитывают его среднюю вели чину. Это первичное время кровотечения. Норма -- 10--12 мин.

Вторичное время кровотечения определяют через 20--24 с. Вновь на то же плечо накладывают манжетку сфигмоманометра при давлении 40 мм рт. ст., после чего тупым концом осторожно снимают корочки с ранок-царапин, оставшихся после определения первичного времени кровотечения. Определяют время остановки возобновившегося после удаления корочек кровотечения. Норма вторичного времени кровотечения -- 2 мин.

Первичное время кровотечения увеличивается при тромбоцито-пениях и тромбоцитопатиях, резко и постоянно-- при болезни Виллебранда. Вторичное время кровотечения -- при патологии тромбоцитов и особенно болезни Виллебранда, а также при ряде коагуло-патий -- гемофилиях А и В (дефицит VIII и IX факторов), дефиците V и X факторов. Это свидетельствует о том, что вторичная остановка кровотечения в большей степени, чем первичная, зависит от состеяния свертывающей системы крови и в меньшей степени -- от функции тромбоцитов.

Таким образом, с помощью пробы Борхгревинка--Ваалера можно выявить выраженную патологию первичного (сосудисто-тромбо-цитарного) и вторичного (коагуляционного) гемостаза.

2.3. Тест толерантности к аспирину по Квику (A. I. Quick, 1966). Определяют время кровотечения по Дьюку до и через 2 ч после приема внутрь 0,65--1 г ацетилсалициловой кислоты (аспирина).

Под влиянием ацетилсалициловой кислоты нарушается адгезив-ffo-агрегационная функция тромбоцитов, что ведет к удлинению шремени кровотечения, более выраженному у лиц со скрытой или явной неполноценностью одного из звеньев системы гемостаза.

В норме допустимо увеличение времени кровотечения не более чем в 1,5 раза по сравнению с исходной величиной.

У больных время кровотечения после приема ацетилсалициловой кислоты увеличивается в 2 раза и более. Резко положительным тест выпадает чаще при гемофилиях А и В, а также при других ко-агулопатиях, чем при тромбоцитопатиях и тромбоцитопениях. Объясняется это тем, что при резко выраженных тромбоцитарных дефектах функция пластинок уже до приема ацетилсалициловой кислоты резко нарушена. Прием же препарата сказывается на функциональном состоянии тромбоцитов тем больше, чем менее выражен дефект пластинок. При выраженных коагулопатиях (гемофилии) резко нарушенный коагуляционный гемостаз компенсируется в зоне микроциркуляции сохранением адгезивно-агрегацион-иой активности тромбоцитов. Ацетилсалициловая кислота нарушает ггу функцию, что ведет к значительному увеличению времени кровотечения.

Таким образом, время кровотечения в различных вариациях способствует выявлению у больных явлений геморрагофилии -- наклонности к кровотечениям.

3. Метод определения антиагрегационной активности стенки сосудов (В. П. Балуда с соавт., 1983)

Под влиянием застоя крови, вызванного наложением манжетки, в кровь из сосудистой стенки поступают простациклин и другие термостабильные факторы, обладающие антиагрегационной активностью. Определяют степень агрегации до и после наложения на плечо манжетки.

В шприц, содержащий 1 мл натрия цитрата, из кубитальной вены берут 9 мл крови, смешивают ее с антикоагулянтом и хранят в сосуде с тающим льдом (для предотвращения инактивации проста-циклина). На вторую руку накладывают манжетку сфигмоманомет, определяют систолическое давление, повышают давление в манжетке на 10 мм рт. ст. и через 3 мин берут 9 мл крови в шприц с раствором натрия цитрата.

Кровь немедленно центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы. Плазму отсасывают, немедленно помещают в тающий лед и до начала исследования (не более 1 ч) хранят в нем. Кровь повторно центрифугируют 20 мин при 3500 об/мин для получения бедной тромбоцитами плазмы, которую отсасывают и до начала исследования хранят в тающем льду.

Подсчитывают количество тромбоцитов в плазме, богатой тромбоцитами, полученной до создания венозного застоя.

Плазму, богатую тромбоцитами, разводят плазмой, бедной тромбоцитами, полученной до (1-я проба) и после (2-я проба) венозного застоя, до концентрации 204 в 1 мкл.

Полученную смесь встряхивают и инкубируют 10 мин при 20-- 22 °С. Определяют агрегацию тромбоцитов в обеих пробах по G. V. Born (1962) с индуктором агрегации АДФ в конечной концентрации Ю-6--Ю-7 М и при температуре в агрегометре 20--22 "С.

По разнице в степени агрегации до и после венозного застоя судят об антиагрегационной активности сосудистой стенки. Рассчитывают индекс:

Норма-- 1,4--1,8. Уменьшение индекса указывает на снижение антиагрегационной активности стенки сосудов; наблюдается при тромбофилии.

4.Метод определения антитромбина III сосудистой стенки (В. П. Балуда с соавт., 1988)

Под влиянием застоя крови, вызванного наложением манжетки, в кровь из сосудистой стенки поступает антитромбин III. Определяют содержание антитромбина III до и после наложения на плечо манжетки.

II. Методы исследования функционального состояния форменных элементов как компонента гемостаза

В первичном (микроциркуляторном, или сосудисто-тромбоци-тарном) гемостазе основную роль играют сосудистая стенка и тромбоциты. Следует, однако, иметь в виду, что тромбоциты содержат различные компоненты свертывания крови и фибринолиза, т. е. принимают участие в реализации как первичного, так и вторичного (макроциркуляторного) гемостаза. Поэтому рассмотрение их в разделе методов исследования первичного гемостаза в определенной степени условно. То же следует сказать и о других форменных элементах крови (эритроцитах и лейкоцитах). Участие эритроцитов в процессах гемостаза в последие годы усиленно изучается, и уже Получены определенные результаты. Наименее изученными в этом Отношении являются лейкоциты. Поэтому наибольшее количество Методов исследования относится к изучению тромбоцитарного как наиболее важного компонента гемостаза, меньшее количество -- к изучению лейкоцитарного компонентов.

1. Исследование показателей тромбоцитарного компонента гемостаза

1.1.Определение количества тромбоцитов в Крови или плазме. Тромбоциты можно подсчитывать в маз ках крови и в плазме. Последний метод имеет преимущества и на много точнее, чем методы определения числа пластинок в мазках. Для подсчета в камере используют обычную микроскопию или фа- аово-контрастную приставку.

1.1.1. Определение количества тромбоцитов с помощью фазово-контрастного микроскопирова-ния. Производится прямой подсчет предварительно окрашенных тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости 1 % раствора аммония оксалата. При подсчете пользуются микроскопом с фазово-контрастной приставкой.

Техника исследования та же, что и в предыдущем методе, но с применением в качестве разводящей жидкости раствора аммония оксалата. Кровь набирают в смеситель до метки 1, разводят аммония оксалатом до метки 101 (разведение 1:100). Таким же образом заполняют второй смеситель. Вместо смесителей можно использовать пробирки. В пробирку к 0,02 мл крови доливают 1,98 мл раствора аммония оксалата, затем тщательно перемешивают, заполняют камеры Горяева и подсчитывают тромбоциты. При микроскопии Используют зеленый светофильтр. После установки на микроскопе фазовых объектов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40Х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение, центрифугируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Расчет такой же, как при предыдущем методе, но число тромбоцитов, полученных в 25 квадратах, умножают на 1000 (разведение здесь 1:100, в предыдущем методе 1:200).

Норма--174 000 --426 000 клеток в 1 мкл крови, или 174 -*№/л -- 426 109/л (В. П. Балуда с соавт., 1980), 150 000--450 000 1 1 мкл, или 150 - 109/л -- 450 * 109/л (Е. И. Иванов, 1983).

Снижение числа тромбоцитов может быть причиной тромбоцитопатий с развитием геморрагического диатеза. Критическое число тромбоцитов -- 30- 108/л. При дальнейшем уменьшении числа тромбовцитов, как правило, возникают кровотечения.

1.2.Тромбоцитарная формула. В специально окрашенных мазках изучают размер, форму и структуру тромбоцитов, по которым судят о зрелости тромбоцитов.

Мазки крови делают без стабилизатора (ЭДТА или магния сульфата). Их фиксируют 15 мин в абсолютном метиловом спирте и красят 45 мин смесью красок по Нохту (10 частей раствора азу-ра, 5 частей раствора эозина и 10 частей водопроводной воды). Азур 11 и эозин используются в разведении 1:1000. Возможно также окрашивание мазков по Романовскому--Гимзе.

Тромбоциты здорового человека обычно округлые или овальные, среднего размера (2--4 мкм). В них хорошо видны центральная зернистая часть, состоящая из 5--20 азурофильных гранул (грануломер), и периферическая гомогенная часть (гиаломер) с сиреневым оттенком; в нем различают вакуоли и псевдоподии.

Структура тромбоцитов отражает степень их зрелости. Различают юные, зрелые и старые кровяные пластинки. При патологии встречаются тромбоциты раздражения и дегенеративные пластинки.

Юные формы тромбоцитов отличаются от зрелых форм нерезкими контурами, несколько большей величиной (более 4 мкм), выраженной базофилией гиаломера и нежной необильной азурофиль-ной зернистостью.

Зрелые формы, наиболее типичные,-- округлые или овальные, с ровными контурами, диаметром 2--4 мкм, в них четко разделяются грануломер с хорошо выраженной красно-фиолетовой зернистостью и голубовато-розовый (сиреневый) гиаломер.

Старые формы как бы сморщены, их диаметр менее 2 мкм, грануломер насыщенно-фиолетового цвета, занимает всю центральную часть; гиаломер узкий, располагается по периферии пластинки, светло-розового цвета.

Тромбоциты раздражения полиморфны. Встречаются гигантские колбасовидные, хвостатые и тому подобные пластинки диаметром 7--9 и даже 12 мкм.

Дегенеративные формы не содержат зернистости (гиалиновые, голубые пластинки) или имеют темно-фиолетовую зернистость в виде комков или мелких осколков (пылинок); встречаются и вакуоли-зированные пластинки.

Тромбоцитарная формула у практически здоровых людей по М. И. Кореневской (1967): юные --0--0,8, зрелые --90,3--96,1, старые -- 2,2--5,6, дегенеративные -- 0--0,2, раздражения -- 0,8-- --2,3, вакуолизированные -- 0 %.

Увеличение числа юных форм («помолодение», или сдвиг тром-боцитарной формулы влево) отмечается при повышенной регенерации костного мозга (гемолитическом кризе, посттрансфузионных осложнениях, лейкозе, после кровопотери, спленэктомии н др.). Большое число старых форм («постарение», или сдвиг тромбоцитарной формулы вправо) чаще всего обнаруживают у больных раком. Формы раздражения присущи тромбоцитопеническим состояниям. Количество старых и дегенеративных тромбоцитов увеличивается у больных с наследственными и симптоматическими тромба-стениями, циррозом печени, у отравившихся бензолом и др. При миелопролиферативных болезнях (хроническом миелолейкозе, тромбоцитемии, полицитемии и др.) в периферической крови наряду с формами раздражения встречаются тромбобласты -- фрагменты ядер мегакариоцитов, окруженные цитоплазмой с отшнуровыва-ющимися пластинками. Мегатромбоцнты характерны для синдрома врожденной тромбопатии Бернара--Сулье, врожденной панмие-лопатии с тромбопатией Мея--Хегглина, а макротромбоциты (диаметром менее 1,5 мкм) --для синдрома наследственного иммунного дефекта . с явлениями тромбоцитопении Вискотта--Олдрича (Е. П. Иванов, 1983).

1.3. Определение адгезивной способности (ретенции) тромбоцитов. Определяют способность тромбоцитов к адгезии по убыли их из крови при пропускании через стандартную колонку со стеклянными шариками, с кетгутом, со стекловолокном.

Наибольшее распространение получил метод определения адге-зивности тромбоцитов на стекловолокне по Т. А. Одесской с соавторами (1971).

Готовят косички из стекловолокна, для чего 3 пучка нитей из стекловолокна сплетают в косичку длиной 7 см. Масса косички -- 370 мг. До приготовления косички нити промывают ацетоном и высушивают. Перед употреблением косички смачивают изотоническим раствором натрия хлорида, протирают марлевой салфеткой и подвешивают в вертикальном положении.

Силиконированной иглой из вены берут кровь и немедленно ее смешивают в отношении 9:1 с раствором натрия цитрата. Из крови берут часть для подсчета тромбоцитов фазово-контрастным методом. Затем 0,2--0,3 мл крови по каплям наносят силиконированной пипеткой на верхний конец фильтра-косички так, чтобы первая Капля крови отделилась от нижнего конца косички и упала на си-ликонированное часовое стекло через 30--40 с. Время прохождения крови через косичку регистрируется с помощью секундомера. Подсчитывают количество тромбоцитов в крови, прошедшей через ко-СИЧку. Разница между количеством тромбоцитов крови до пропускания через фильтр-косичку и после прохождения крови через фильтр, выраженная в процентах, отражает степень ретенции (адгезии) тромбоцитов на фильтре.

где А -- количество тромбоцитов крови до фильтрации, В -- количество тромбоцитов крови после фильтрации.

В норме показатель колеблется в пределах от 20 до 50 % (В. П. Балуда с соавт., 1980), от 26,09 до 48,89 % (Е. П. Иванов, 1983).

Модификации метода. Вместо стекловолокна в качестве фильтра можно использовать колонку с кетгутом (мелко нарезанным кусочками длиной 1--1,5 мм кетгутом (массой 0,2 г заполняют опиленный конец пипетки объемом 2 мл на высоту 4 см). В методике G. Hellem (1960), Е. W. Salzman (1963) и его модификациях (А. Д. Смоляницкий с соавт., 1985) в качестве фильтра используют стеклянные шарики диаметром 0,5 мм, массой 1,5 г, которыми заполняют поливиниловую трубку с внутренним диаметром 3 мм и длиной 13,5 см. Описан также микрометод определения адгезивнос-ти тромбоцитов (С. И. Чеканина, 1980), который сопоставим с макрометодом (Е. П. Иванов, 1983). Все же микрометоды уступают по точности макрометодам.

Снижение адгезивных свойств тромбоцитов свидетельствует о геморрагофилии (склонности к кровотечениям), ряде врожденных (наследственных) и симптоматических тромбоцнтопатий, сочетается с различными нарушениями агрегационных функций пластинок (тромбастения Гланцманна, уремия, лейкозы и т. д.) или без них (болезнь Виллебранда, парциальные тромбоцитопатии). Повышение адгезивности тромбоцитов может быть признаком тромбофилии (склонности к тромбозам).

1.4. Исследование агрегационной активности тромбоцитов фотометрическим методом с графической регистрацией процесса по G. V. Born (1962, 1963). Принцип основан на регистрации изменения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы (около 200 000 клеток в 1 мкл крови, или 200- 109/л клеток), полученной из венозной крови в условиях силиконирования и стабилизирования 3,8 % раствором натрня цитрата до и после внесения в нее определенного количества АДФ или другого агреганта при постоянном помешивании плазмы.

Исследования проводят либо в специальных фотометрах -- аг-регатографах или агрегометрах, либо на переоборудованных (со встроенной мешалкой, термостатическим устройством) фотоэлект-рокалориметрах, спектрофотометрах с подключением регистрирующего аппарата (потенциометра) или без него.

Плазма со взвесью тромбоцитов при агрегации меняет свои оптические свойства (просветляется). Изменение оптической плотности плазмы регистрируют на движущейся ленте и получают графическую запись -- агрегатограмму. При отсутствии регистрирующего устройства через определенные промежутки времени (15 с, 30 с) снимают показания фотоэлектроколориметра (спектрофотометра) и вычерчивают кривую агрегации тромбоцитов.

В кювету фотоэлектроколориметра (10,07 мм) помещают 3,5 мл (в меньшую кювету--1,5--1 мл) тромбоцитной плазмы. В плазму погружают стержень мешалки, устанавливают ФЭК на «0» относительно дистиллированной воды. Включают мешалку (300 об/мин) и регистрирующее устройство. После начальной записи нулевой линии в кювету вводят один из агрегирующих агентов.

Современная диагностика тромбоцитопатнй основана на развернутом изучении агрегации тромбоцитов под влиянием следующих . агрегантов: АДФ (в малых и больших концентрациях), коллагена, адреналина, малых доз тромбина, коллагена, серотонина, ристоце-тина (ристомицина). При необходимости применяют также неочищенный концентрат фактора VIII из бычьей плазмы, простагланди-ны и другие агенты. В качестве мощного индуктора агрегации может быть использован также гемолизат эритроцитов (Л. 3. Барка-ган с соавт., 1986).

В оценку агрегации включается также косвенное определение реакции освобождения из тромбоцитов внутриклеточных агрегирующих агентов -- адреналина, АДФ, серотонина. Эта оценка основана на выявлении характерной второй волны на агрегатограммах, полученных с помощью адреналина или малых доз АДФ и, По нашим данным, тромбина. При нарушении «реакции освобождения» вторая волна агрегации отсутствует.

Разные образцы агрегирующих агентов существенно отличаются друг от друга. Поэтому для каждого образца любого агрегирующего агента необходимо определять оптимальные дозы препарата и обрабатывать нормальные параметры агрегатограммы. Исходные показатели лучше всего определять с помощью стандартизированных фирменных агрегирующих агентов, например, из французского набора «агротест». АДФ фирмы «Ренал» чаще всего дает максимальную агрегацию в конечной концентрации 0,01 мг/мл, а двух-волновую --в концентрации 0,002--0,005 мг/мл. Эффективная доза адреналина (сухого, ие ампульного!) для большинства препаратов равна 3--5 мкг/мл, тромбина -- 0,05--0,1 ед/мл, ристоцетина (ристомицина) -- 0,7--1 мг/мл (В. П. Балуда с соавт., 1980).

Для регистрации коллаген-агрегации тромбоцитов Л. А. Белова с соавторами (1985) предложили стандартный препарат коллагена -- колатрон. Это комплекс из 2 ампул, одна из которых содержит 1 мл ферменторастворенного коллагена в 0,1 н. уксусной кислоте с концентрацией ОД %, другая-- 1 мл смеси 0,1 н. раствора едкого натра и 0,1 н. раствора двухзамещенного фосфата натрия в равных количествах. При смешивании этих компонентов образуется рабочий раствор коллагена с концентрацией 0,05 % и рН 7--7,2. Ампулы хранят при температуре от 0 до 4 °С и смешивают перед прошением теста. В опыте используют колатрон с конечной концентрацией 50 мкг/мл.



О степени агрегации судят по величине снижения оптической плотности, свидетельствующей о степени отклонения плечика потенциометра от нулевой линии. По кривой (рис. 11) определяют следующие показатели:

1) время максимальной агрегации-- время от А до Д (в минутах)-- с момента добавления агрегирующего агента до вершины кривой агрегатограммы;

степень агрегации -- отношение сниженной оптической плотности на высоте агрегации ВД к исходной оптической плотности (в процентах);

скорость агрегации -- отношение сниженной оптической плотности на высоте агрегации ВД ко времени максимальной агрегации АД (в ед. экстинции/мин);

степень дезагрегации -- отношение повышенной оптической плотности на высоте дезагрегации BE к оптической плотности на высоте агрегации ВД (в процентах);

скорость дезагрегации -- отношение повышенной оптической плотности на высоте дезагрегации BE ко времени максимальной дезагрегации СЕ (в ед. экстинции/мин).

Нормативы, выведенные в нашей лаборатории (А. И. Ивашков-ский, 1986), следующие: степень агрегации -- 4--13,5%; скорость агрегации --0,02--0,06 ед. экстинции/мин; время максимальной агрегации--2,3--4,1 мин; степень дезагрегации --25--100 %; скорость дезагрегации -- 0,004--0,02 ед. экстинции/мин.

При изучении в нашей лаборатории (Н. В. Сопина, 1987) приведенных выше показателей агрегатограммы тромбоцитов с различными индукторами у практически здоровых людей выявлены определенные отличия в зависимости от используемого агреганта (табл. 3).

В наибольшей степени агрегация тромбоцитов была выражена при воздействии адреналином, в наименьшей -- при воздействии АДФ. Скорость образования агрегантов при стимуляции АДФ также была наименьшей, в остальных случаях примерно одинаково высокой. Наибольшая способность тромбоцитов к дезагрегации отмечалась прн действии на них тромбином. У всех доноров тромбоци-тарные агреганты подверглись дезагрегации (у 42 %--полной). При агрегации, стимулированной адреналином, в 14 % случаев дезагрегация полностью отсутствовала, однако при этом 2-я волна агрегации (реакция освобождения) наблюдалась у всех доноров, в то время как при индуцировании тромбином -- в 82 % случаев, АДФ -- в 38 % и серотонином -- в 22 %. При тромбин-агрегации часто выявлялась двухфазная реакция освобождения.

Таким образом, АДФ и серотонин можно рассматривать, как слабые индукторы, вызывающие у большинства практически здоровых людей только агрегацию, хотя последняя у серотонина более юачительно выражена по сравнению с АДФ и тромбином и уступает лишь адреналину. Основную реакцию тромбоцитов -- секрецию-- все же вызывают тромбин и адреналин.

При сравнении результатов агрегационной активности у мужчин и женщин существенного различия почти по всем показателям отмечено не было (табл. 4).

Существует ряд модифицированных микрометодов определения агрегационной активности тромбоцитов (Н. И. Тарасова, 1974; В. П. Балуда с соавт., 1976, 1980; А. С. Шитикова, 1984; Л. 3. Бар-Мвган с соавт., 1986, и др.), однако их чувствительность ниже, чем макрометодов.

Снижение агрегационной и повышение дезагрегационой активности тромбоцитов наблюдается при геморрагофилиях.

Полное отсутствие или резкое снижение агрегации пластинок ктерно для различных видов качественной неполноценности и дисфункции тромбоцитов наследственного или приобретенного гене-за.при этом в одних случаях наблюдается развернутое нарушение всех или почти всех агрегационных функций (тромбастения Гланц-манна, эссенциальиая атромбинемия И типа и др.), при Других -- парциальный парез реакции тромбоцитов на 1--2 реагирующих агента; при ряде тромбоцитопатий отсутствует реакция освобождения и агрегатограммы (на малые дозы АДФ и на адреналин) характеризуются отсутствием второй волиы, ранним наступлением глубокой дезагрегации. Изолированное, или преимущественное нарушение ристоцеин (ристомнцин)-агрегации наблюдается в основном при большинстве молекулярных вариантов болезни Вйллебран-да и макроцитарной тромбоцитодистрофии Бернара--Сулье. В первом случае это нарушение обусловлено отсутствием в плазме больных фактора Виллебранда, в связи с чем ристоцеин-агрегация восстанавливается после прибавления небольшого количества нормальяой бестромбоцитной плазмы. При болезни Бернара--Сулье дефектны сами тромбоциты, отличающиеся гигантскими размерами, и нарушение не устраняется нормальной плазмой (В. П. Балуда с соавт., 1980).

Высокая агрегационная и низкая дезагрегационная активность тромбоцитов свидетельствуют о тромбофилии.

1.5.О п р е д е л е н и е активности фактора 3 тромбо цитов (по V. Rabiner, О. Hrodek, 1968; 3. С. Баркагану, 1975). Ак тивность фактора 3 тромбоцитов определяется по разнице каолино вого (целитового) времени рекальцификации плазмы, богатой и бедной тромбоцитами.

В силиконированной пробирке венозная кровь смешивается с раствором натрия цитрата в соотношении 9:1. Богатую тромбоцитами плазму получают центрифугированием крови в течение 5--7 мин при 1000 об/мин и температуре не выше 10 °С. Подсчитывают количество тромбоцитов в плазме (фазово-контрастным методом). Из богатой тромбоцитами плазмы (половины объема) получают бедную тромбоцитами плазму путем ее центрифугирования в течение 30 мин при 4000 об/мин и температуре 8 °С. В пробирки с 0,1 мл богатой и бедной тромбоцитами плазмы добавляют суспензию коа-лина или целита (0,1 мл) и, постоянно помешивая, ставят на 2 мин на водяную баню при 37 °С. Ровно через 2 мин в смесь добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида и определяют время рекальцификации. Разница во времени рекальцификации богатой и бедной тромбоцитами плазмы характеризует активность фактора 3 тромбоцитов.

Норма --15--31 с (22,5±0,9).

Снижение содержания фактора 3 тромбоцитов наблюдается при тромбоцитолениях и ряде тромбоцитопатий.

1.6.Определение активности фактора 4 тромбо цитов (по Л. А. Матвиенко и М. А. Катовщиковой, 1964). Содер жание фактора 4 тромбоцитов по этой методике оценивается по ан тигепариновой активности тромбоцитов. Объектом исследования яв ляется взвесь тромбоцитов. В пробирку, находящуюся на водяной бане при 37 °С, вводят 0,1 мл субстратной плазмы (плазмы здоро вого без тромбоцитов), 0,1 мл изотонического раствора натрия хло рида и 0,1 мл раствора гепарина (должен увеличивать нормальное тромбиновое время в 3--4 раза, т. е. до 90--100 с). Через 30 с до бавляют 0,1 мл раствора тромбина (нормальное тромбиновое вре мя 30--40 с). Отмечают время свертывания. Затем повторяют реак цию, заменив 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида 0,1 мл тромбнновой взвеси. Укорочение тромбинового времени за счет ак тивности фактора 4 тромбоцитов определяют по формуле:



где V -- активность фактора 4 тромбоцитов; А -- тромбйновое время гепаринизированной плазмы; Ai --тромбйновое время после добавления тромбоцитов.

Норма -- 32--64 %. Активность фактора 4 тромбоцитов значительно возрастает при тромбофилии, ДВС-синдроме и других состояниях.

Описанный метод определения тромбоцитарного фактора 4 в плазме крови по антигепариновой активности тромбоцитов получил широкое распространение в связи с простотой его выполнения. Более чувствительным и точным, хотя и более сложным все же является иммунологический метод определения содержания этого тромбоцитарного фактора. М. В. Благосклонный и А. Д. Кузнецова (1987), сопоставляя оба метода, пришли к выводу, что антигепариновая активность тромбоцитов может быть использована для оценки содержания фактора 4 тромбоцитов в плазме крови, однако она в большей степени отражает повышенную спонтанную агрегацию тромбоцитов in vitro, тогда как иммунологическая методика -- повышенную спонтанную агрегацию тромбоцитов непосредственно в кровотоке.

1.7.Определение ретракции кровяного сгустка. Принцип основан на определении объема ретрагируемой сыворот ки. Венозную кровь (5 мл) немедленно после взятия помещают в градуированную центрифужную силиконированную пробирку с де лениями по 0,1 мл. Пробирку закрывают пробкой с продетой через ее центр стеклянной палочкой или проволокой со спиралью на кон це таким образом, чтобы спиралевидный конец был погружен в кровь. Пробирку устанавливают на водяной бане при 37 °С и сле дят за свертыванием. Через 1 ч после свертывания крови палочку (проволоку) осторожно удаляют вместе со сгустком. Объем остав шейся сыворотки и клеток определяют по градуированной пробир ке. С учетом гематокрита рассчитывают ретракцию кровяного сгу стка в процентах по формуле:



где Р -- ретракция сгустка, А-- количество ретрагированиой сыворотки, В -- общее количество сыворотки в 5 мл крови (по гемато-критному числу).

Норма -- 48--64 %. Недостаточная ретракция наблюдается при выраженной тромбоцитопении (менее 100 109/л клеток), некоторых видах качественной неполноценности кровяных пластинок, избытке эритроцитов (полиглобулии, эритремии), увеличении гематокритного числа. Ложно завышенная ретракция наблюдается при анемии, снижении гематокритного числа, гипофибриногенемии.

1.8.Другие методы исследования тромбоцитарного компонента гемостаза включают определение показателей тромбоэластограммы, коагулограммы и фибринолиза в бес-тромбоцитной (бедной тромбоцитами) и в тромбоцитной (богатой тромбоцитами) плазме. На основании сопоставления результатов, полученных в той и другой плазме, можно косвенно сделать заключение о характере и степени участия тромбоцитов в различных фазах процесса свертывания крови (тромбопластино-, тромбино- и фи-бринообразовання), в формировании антикоагулянтного, фибрино-литического и антифибринолитического ее потенциалов. Методы исследования и интерпретация полученных результатов будут рассмотрены при описании соответствующих методик, характеризующих вторичный гемостаз, антикоагулянтную активность крови и фибринолитический процесс, а также инструментальных методов изучения гемостаза.

2. Изучение показателей эритроцитарного компонента гемостаза

Исследование агрегационной активности эритроцитов. Агрегация эритроцитов наступает под действием плазматических и гемодинамических факторов. Значительное влияние оказывают и собственно эритроцитарные факторы, одним из которых является величина отрицательного заряда на поверхности,клеток, определяющая суспензионную стабильность крови, так как при его изменении увеличивается агрегационная активность эритроцитов. J. R. O'Brien (1962, 1966) при изучении строения мембраны эритроцита обнаружил агрегационный эффект у органического красителя голубого альциана (Alcian blue). Добавление голубого аль-циана к взвеси отмытых эритроцитов приводило к выраженной клеточной агрегации. Агрегацию эритроцитов вызывают также гамма-глобулин, фибриноген, декстран. A. Larcau и J. F. Stolz (1969, 1970) выделяют также серотонин и АДФ-агрегацию эритроцитов. При определении агрегационной активности эритроцитов чаще всего используют голубой альциан, фибриноген, гамма-глобулин и АДФ.

2.1. Определение агрегационнной активности эритроцитов, индуцированной голубым альциа-йом (по В. А. Люсову с соавт., 1976). В основу положен метод О. V. R. Born (1962, 1963), предложенный для графической записи агрегационной активности тромбоцитов.

Для приготовления клеточной суспензии эритроцитов 1 мл цельной крови смешивают с 3,8 % раствором натрия цитрата в соотношении 9:1 и затем трижды отмывают в 10 мл буфера Оурена -- Михаэлиса с рН 7,3±0,61 по прописи Оурена--Коллера. Вначале готовят раствор А: натрия веронала -- 7,36 г, натрия ацетата -- 4,86 г, дистиллированной воды -- 250 мл. Затем -- буфер: раствора Д --* 250 мл, 4,25 % раствора натрия хлорида -- 200 мл, 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты -- 217 мл, дистиллированной воды -- 683 мл. Буфер хранят в холодильнике при + 4 °С.

Отмывают эритроциты путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10--15 мин. После троекратного промывания и удаления супернатанта микропипеткой берут 0,01 мл отмытых оставшихся эритроцитов, которые затем ресуспендируют в 10 мл буфера Оурена. Для проведения исследования необходимо иметь концентрацию клеточной суспензии (100 000±20 000) эритроцитов в 1 мкл, или (100±20) ¦ 109/л. Содержание эритроцитов определяют путем их подсчета под микроскопом.

К 1 мл суспензии отмытых эритроцитов в буфере Оурена с указанной концентрацией клеток, налитой в кювету фотоэлектроколо-риметра с рабочей гранью 3 мм, добавляют 0,5 мл голубого альци-аиа, предварительно растворенного в дистиллированной воде. Последовательность выполняемых манипуляций такая же, как при исследовании агрегации тромбоцитов. Перемешивают штопорообраз-ной мешалкой со скоростью вращения 200 об/мин. При фотоколори-метрировании используют светофильтр № 6.

На основании многочисленных исследований В. А. Люсов с соавторами (1976) пришли к выводу, что выведенный имн показатель-- скорость агрегации -- является наиболее информативным для оценки агрегатограммы. Доказательством этого служит пример агрегатограмм эритроцитов у больного с кардногенным шоком, где, по сравнению с нормальной агрегатограммой, наблюдается резкое ускорение процесса агрегации.

2.2. Определение агрегационной активности эритроцитов, индуцированной фибриногеном. Кровь, полученную из локтевой вены, стабилизируют 3,8 % раствором натрия цитрата в соотношении 1:9, после чего ее подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин. Отсасывают плазму, бедную тромбоцитами. Из осадка эритроцитов готовят суспензию, как это описано в методике с голубым альцианом. 1 мл плазмы, бедной тромбоцитами, с 0,1 мл эритроцитарной суспензии наливают в кювету ФЭК с рабочей гранью 3 мм. В кювету опускают мешалку и включают ее со скоростью 200 об/мин. Величину оптической плотности регистрируют при зеленом светофильтре. После этого, не выключая мешалку, добавляют 0,1 мл раствора фибриногена с конечной концентрацией 0,01 г/л. Записывают агрегатограмму эритроцитов с отметкой времени. При отсутствии регистрирующего устройства включают секундомер и через каждые 30 с фиксируют изменения оптической плотности суспензии эритроцитов до максимального ее падения.

Исследования, проведенные в нашей лаборатории Н. В. Ивановой (1980, 1981), Л. Г. Карпович (1984), А. П. Ангелуцей (1985), показали, что, кроме определения скорости агрегации, для более полной характеристики процесса имеет значение также определение степени агрегации эритроцитов. Таким образом, агрегационная активность эритроцитов характеризуется двумя показателями: скоростью агрегации эритроцитов-- величиной снижения оптической плотности суспензии эритроцитов за время максимальной агрегации (ед. экстинции/мин) и степенью, илн глубиной, агрегации -- процентом снижения оптической плотности при максимальной агрегации эритроцитов. Показатели рассчитывают по формулам:

В норме скорость фибриноген-агрегации эритроцитов колеблется в пределах 0,012--0,028 (0,019±0,001) ед. экстинции/мин; степень агрегации --7--11,8 (9,06±0,35) %.

Для каждого агрегометра (промышленного и непромышленного производства), как и в случаях изучения агрегации тромбоцитов, выводят свою норму.

2.3.Определение агрегационной активности эритроцитов, индуцированной АДФ (Н. В. Иванова, 1980). Данные литературы (A. Larcau, J. F. Stolz, 1969, 1970), сви детельствующие о том, что агрегацию эритроцитов может вызывать также АДФ, послужили основанием для использования в нашей ла боратории АДФ как универсального индуктора в определении аг регационной активности тромбоцитов и эритроцитов. Изучение аг регации эритроцитов с различными концентрациями АДФ показа ло, что агрегация наиболее четко выражена при конечной концент рации 0,01 г/л.

Методика определения агрегационной активности эритроцитов с АДФ такая же, как с применением фибриногена, но в качестве индуктора к смеси бестромбоцитной плазмы к эритроцитарной суспензии добавляют 0,1 мл раствора АДФ в конечной концентрации 0,01 г/л.

Сопоставление в лаборатории методов изучения агрегационной вктивности эритроцитов с фибриногеном и с АДФ показало их идентичность и одинаковую чувствительность (Н. Ф. Иванова, 1981; Л. Г. Карпович, 1984; А. П. Ангелуца, 1985).

В норме скорость АДФ-агрегации эритроцитов колеблется в пределах 0,014--0,028 (0,020±0,001) ед. экстииции/мин; степень агрегации - 6,2--11,5 (8,80±0,25) %.

Повышение агрегационной активности эритроцитов свидетельствует о тромбофилии, снижение -- о геморрагофнлии.

2.4.О п р е д е л е н и е агрегационного коэффициен та эритроцитов (по И. И. Мищуку, 1981). Аграгациониая активность эритроцитов находится в определенной зависимости от показателей гематокрита и СОЭ. Для общего представления о характере изменения агрегационной активности эритроцитов И. И. Мищук (1981) предложил рассчитывать по приведенным показателям агрегационный коэффициент эритроцитов (АКЭ):

В норме агрегационный коэффициент эритроцитов колеблется в пределах 38,3--47,9 (43,15±0,61) усл. ед.

2.5. Определение степени повреждения мембран эритроцитов (А. И. Грицюк с соавт., 1985). Метод основан на изучении полного лизиса эритроцитов в изотоническом растворе мочевины.

Производят забор венозной крови, стабилизируют ее 3,8 % раствором натрия цитрата в соотношении 9:1, центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 15 мин, осторожно удаляют плазму и лейкоциты. Оставшийся осадок эритроцитов разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:9.

Время полного гемолиза эритроцитов определяют по изменению оптической плотности раствора мочевины после добавления взвеси эритроцитов. С этой целью используют фотоэлектроколориметр ФЭК-56М. Графическую регистрацию динамики процесса гемолиза осуществляют оксигемографом 036М, подключенным к ФЭК через мост сопротивлений РЗЗ, при красном светофильтре.

В опытную кювету с рабочей гранью 5 мм помещают 2 мл 0,3 М раствора мочевины. Включают штопорообразную мешалку с рабочим шагом 2 мм и частотой вращения 600 об/мин. Вращением правого барабана ФЭК устанавливают писчик оксигемографа в крайнем правом положении и включают лентопротяжный механизм оксигемографа со скоростью 1 см/мин. В опытную кювету быстро добавляют 0,05 мл суспензии эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида.

В начале исследования сразу после добавления эритроцитов резко увеличивается оптическая плотность смеси, ао мере гемолиза она постепенно снижается и по окончании гемолиза представляет собой на графике прямую линию. Время полного гемолиза определяют на кривой по длине отрезка АВ, где точка А отражает момент добавления эритроцитов в опытную кювету, а точка В является проекцией точки С (переход кривой в прямую) на нулевую линию.

Время полного гемолиза выражают в секундах, т. е. длину отрезка АВ умножают на 60 (скорость = 1 см/мин).

В связи с тем что, по данным В. Н. Колмакова (1980), П. А. Ангелуцы (1985), время полного гемолиза эритроцитов зависит от времени года, П. А. Ангелуца предложил следующую формулу для определения степени

повреждения эритроцитов (СПЭ):

где СПЭ -- степень повреждения эритроцитов, СВГЗ -- время полного гемолиза у здоровых лиц в том же месяце, что и в экспериментах; ОВГ -- время полного гемолиза в опыте.

Норма --до 12 %. Величины в пределах 12--37,4 %, по данным А. П. Ангелуцы (1985), указывают на умеренную степень повреждения эритроцитов, величины в пределах 37,5 % и выше -- иа выраженную степень повреждения.

Имеются доказательства прямой зависимости включения тромбопластического фактора эритроцитов (эритроцитина) в процессе гемокоагуляции от изменений динамических свойств эритроцитарных мембран. Это предположение, высказанное И. Я. Ашкинази (1977), нашло подтверждение в результатах исследования П. А. Ангелуцы (1985).

Повышение степени повреждения мембран эритроцитов косвенно свидетельствует об увеличении свертывающего (тромбопластнче-ского) потенциала эритроцитов, т. е. способствует тромбофилии.

2.6. Другие методы исследования эритроцитарного компонента гемостаза включают определение показателей тромбоэластограммы, коагулограммы и фибринолиза в обычной плазме и после внесения в нее гемолизированных или ин-тактных эритроцитов. На основании сопоставления результатов, полученных в контроле и опыте, можно косвенно сделать заключение о характере и степени участия эритроцитов в различных фазах процесса свертывания крови (тромбопластино-, тромбино- и фибрино-Образования), в формировании антикоагулянтного, фибринолитиче-ского и аитифибринолитического ее потенциалов. Методы исследования и интерпретация полученных результатов будут рассмотрены нри описании соответствующих методик, характеризующих различные фазы вторичного гемостаза, антикоагулянтную активность кропи и фибринолитический процесс, а также инструментальных методов изучения гемостаза.

3. Изучение показателей лейкоцитарного компонента гемостаза

Несмотря на то, что лейкоциты содержат разнообразные факторы, способствующие и препятствующие свертыванию крови, влияющие на ретракцию и фибринолиз сгустка, обладают адгезивными и ЛГрегационными свойствами, т. е. принимают участие в первичном гемостазе, они еще не привлекли достаточного внимания исследо-Ителей. Существует мнение, что лейкоцитарный компонент гемостаза у человека активно и существенно влияет на общий процесс ввертывания крови и фибринолиза лишь в случае гиперлейкоцнтоза (в основном при лейкемических лейкозах) или скоплении лейкоцитов в экссудатах, в местах воспаления. Однако, как указывают Б. И. Кузник и В. П. Скипетров (1974), лейкоциты играют большую роль также в поддержании жидкого состояния крови, в физиологии и патологии первичного и вторичного гемостаза, формировании антикоагулянтного и фибринолитического потенциала крови. При лейкозах, из-за их большого количества, появления патологических форм, они приобретают особое значение в процессе свертывания крови.

В связи с вышесказанным исследования лейкоцитарного компонента гемостаза еще не получили достаточной н должной не только практической, но и научной апробации, т. е. изучение лейкоцитов в этом аспекте продолжается. Для изучения этого компонента гемостаза применяются принципиально те же методические подходы, что и для изучения тромбоцитарного и эритроцитарного компонентов, т. е. постановка методик с использованием субстратов лейкоцитов и различных их форм. Учитывая практическую направленность книги, мы на них не останавливаемся.



Использованная литература

1. Грицюк О. Й., Амосова К. М., Грицюк I. О. Практична гемостазиология,-- К.: Здоров'я, 1994.-- 256 с: ил.