Технологічні особливості спиртового виробництва

П = П200,

де П200 - середнє арифметичне відліку по шкалі цукрометра у разі використання поляриметричної трубки довжиною 200 мм.

Під час використання поляриметричної трубки довжиною 100 мм середнє арифметичне значення відліків по шкалі цукрометра перемножують на 2.

Під час використання для освітлення дуже темних розчинів бурякової меляси активованого вугілля середнє арифметичне відліків по шкалі цукрометра, в разі використання поляриметричної трубки довжиною 200 мм, перемножують на 2.

За кінцевий результат випробування приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допущена розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,4%.

Визначання масової частки суми цукрів, що зброджуються.

Суму цукрів, що зброджуються, розраховують за спеціальною формулою з урахуванням результатів визначень величин прямої поляризації (масової частки сахарози), інверсійної поляризації і масової частки редукувальних речовин у досліджуваній буряковій мелясі.

Визначання інверсійної поляризації.

Метод ґрунтується на гідролізі сахарози меляси під впливом розведених водних розчинів кислот, що супроводжується зміною направлення обертання площини поляризації.

Прилади та реактиви.

- Цукрометр з кварцовим компенсаційним клином та з компенсатором.

- Трубки поляриметричні довжиною (100,0±0,02), (200,0±0,02) мм з покривним склом з прозорого оптичного скла товщиною від 1 до 2 мм.

- Термометр рідинний скляний з ціною поділки шкали 0,1 і 1 °С і діапазоном вимірювання температури від 0 до 100 °С згідно з ГОСТ28498.

- Піпетка згідно з ГОСТ29227.

- Колба мірна 1-100-2 згідно з ГОСТ1770.

- Циліндр 1(3)-50-2, 1(3)-100-2, 1(3)-500-2 згідно з ГОСТ25336.

- Стакан В(Н)-1(2)-150, В(Н)-1(2)-1000 згідно з ГОСТ25336.

- Секундомір за ГОСТ10733.

- Баня водяна.

- Папір фільтрувальний лабораторний марки Ф згідно ГОСТ12026.

- Вода дистильована згідно ГОСТ6709.

- Кислота соляна згідно ГОСТ3118.

Підготовка до визначання.

Приготування розчину соляної кислоти.

100 см3 соляної кислоти густиною (с=1,19 г/см3), відміреною циліндром, розчиняють в 500 см3 дистильованої води і ретельно перемішують.

Проведення визначання.

Піпеткою відбирають 50 см3 фільтрату (відповідних 13,0 г меляси), одержаного під час Визначання масової частки сахарози переводять у мірну колбу місткістю 100 см3, доливають 30 см3 водного розвину соляної кислоти 1:5 і перемішують вміст обертаючим рухом колби. У розчин опускають термометр і ставлять колбу до водяної бані попередньо нагрітої до температури 75 °С. Колбу встановлюють на фарфорову чи металеву вставку з круглими отворами.

Температуру води у водяній бані підтримують у межах 70-72 °С, нагріваючи рідину в колбі протягом 2,5-3,0 хв. до температури 67-69 °С, підтримуючи цю температуру точно протягом 5 хв.

По закінченні цього часу колбу виймають із водяної бані і швидко (протягом не більше, ніж 2,5 хв.) охолоджують її під проточною водою до температури 20 °С.

Процес інверсії повинен бути проведений протягом 10 хв.

Після охолодження розчину термометр виймають і споліскують водою термометр, вміст колби доводять до мітки дистильованою водою, добре збовтують, фільтрують, покриваючи лійку покривним склом, щоб уникнути випаровування і поляризують у поляриметричній трубці.

Обробляння результатів.

Величину інверсійної поляризації И у відсотках обчислюють за формулою:

И = 2 • П1200

де 2 - коефіцієнт;

П1200 - середнє арифметичне відліків по шкалі цукрометра перемножують на чотири.

У випадку відхилення температури під час поляризації від 20°С вводять поправку на температуру.

Величину інверсійної поляризації И20 у відсотках обчислюють за формулою:

И20 = Иt - 0,0038(П + Иt) • (20 - t),

де Иt - величина інверсійної поляризації, %;

0,0038 - коефіцієнт;

П - величина прямої поляризації (масова частка сахарози), %;

t - температура, °С.

За кінцевий результат випробування приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допустима розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,2 %.

Визначання масової частки редукувальних речовин.

класичним методом Мюллера.

Прилади та реактиви.

- Ваги лабораторні загального призначення другого класу точності з найбільшою границею зважування 200 г згідно з ГОСТ 24104.

- Колба мірна 1(2) - 100 - 2, 1(2) - 1000 - 2 згідно з ГОСТ 1770.

- Піпетка згідно з ГОСТ 29227.

- Лійка В - 100 - 150 згідно з ГОСТ 25336.

- Бюретка згідно з ГОСТ 29251.

- Колба Кн - 2 - 250 - 34 ТХС згідно з ГОСТ 25336.

- Циліндр 1 - 5 - 2, 1 - 100 - 2, 1 - 500 - 2, згідно з ГОСТ 1770.

- Вода дистильована згідно з ГОСТ 6709.

- Натрій вуглекислий безводний згідно з ГОСТ 83.

- Свинець оцтовокислий згідно з ГОСТ 1027.

- Мідь сірчанокисла згідно з ГОСТ 4220.

- Калій-натрій виннокислий згідно з ГОСТ 5845.

- Натрій вуглекислий 10-водний згідно з ГОСТ 84.

- Йод згідно з ГОСТ 4159.

- Калій йодистий згідно з ГОСТ 4232.

- Крохмаль розчинний згідно з ГОСТ 27068.

- Натрію гідроксид згідно з ГОСТ 4328.

- Фенолфталеїн (індикатор).

Проведення визначання.

Зважують 10 г бурякової меляси з похибкою ± 0,01 г., розчиняють у дистильованій воді, переносять у мірну колбу місткістю 100 см3, освітлюють нейтральним розчином оцтовокислого свинцю в кількості 10 см3, доводять об'єм дистильованою водою до мітки, збовтують двох-трьоххвилинного стояння фільтрують. Піпеткою відбирають 50 см3фільтрату, переносять в мірну колбу місткістю 100 см3 додають декілька крапель розчину фенолфталеїну і розчин з масовою часткою вуглекислого натрію 10 % до лужної реакції, доводять об'єм до мітки дистильованою водою, збовтують і фільтрують. З фільтрату відбирають піпеткою 20 см3, відповідних 1 г меляси, вводять до конічної колби місткістю 250 см3 нейтралізують розбавленою (у співвідношенні 1:1) оцтовою кислотою (у присутності індикатора фенолфталеїну). Об'єм розчину доводять дистильованою водою до об'єму 100 см3, потім додають 10 см3 реактиву Мюллера, поміщують колбу з розчином у киплячу водяну баню на 10 хв. Рівень води у бані повинен бути на 2 см вищий від рівня розчину в конічній колбі. Колба повинна бути розміщена на підставці так, щоб не торкатися до дна бані. Баня повинна мати такі розміри, щоб кипіння не припинялося під час поміщення до неї колби. Після нагрівання колбу швидко охолоджують під струменем холодної води.

Після кип'ятіння розчин повинен мати блакитно-зеленувате забарвлення. У випадку жовтогарячого забарвлення дослід повторюють з меншою кількістю фільтрату.

До охолодженого розчину додають 5 см3 розчину оцтової або винної кислоти молярної концентрації 5 моль/дм3 у кількості від 20 до 40 см3. Обидва розчини додають без збовтування для запобігання окислення окису міді киснем повітря. Після цього колбу накривають годинниковим склом або пробкою, вміст колби час від часу перемішують обертовими рухами. Через 2 хв. додають 5 см3 розчину з масовою часткою крохмалю 1 % і титрують розчином тіосульфату натрію молярної концентрації 0,0333 моль/дм3 до зникнення синього забарвлення розчину.

Аналогічно, але без нагрівання, титрують 20 см3 фільтрату, до якого добавлені вода і реактиви.

Одночасно проводять контрольне визначання, використовуючи ті самі реактиви і в тих самих кількостях, але без досліджуваного розчину. Контрольне визначання проводять для кожного тільки приготовленого реактиву Мюллера.

За різницею між кількістю добавленого йоду і кількістю витраченого тіосульфату натрію визначають кількість йоду, що вступив у реакцію. Із цієї кількості віднімають поправку на відновлення, викликане 1 г сахарози, і поправку на редукувальну здатність реактиву Мюллера.

Після внесення цих поправок 1 см3 витраченого розчину йоду молярної концентрації 0,0333 моль/дм3 відповідає 1 мг редукувальних речовин.

Масову частку редукувальних речовин у відсотках визначають за формулою:

,

де VИ - кількість розчину йоду, витраченого на Визначання, см3;

КИ - коефіцієнт поправки розчину йоду;

VТ - кількість розчину тіосульфату натрію, витраченого на Визначання, см3;

КТ - коефіцієнт поправки розчину тіосульфату натрію;

К - сума поправок на витрати розчину йоду на відновлення сахарози, із розрахунку 0,2 см3 на 1 г., на редукувальну здатність реактиву Мюллера;

Н - маса проби, г.

Обробляння результатів.

За кінцевий результат випробування приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допущена розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,1 %.

Визначання масової частки редукувальних речовин методом Оффнера (метод, який використовується в разі виникнення розбіжностей в оцінці якості)

Метод Оффнера ґрунтується на окисненні редукувальних речовин лужним розчином сполук міді (при цьому сахароза не окислюється) і визначенні йодометричним методом кількості утвореного закису міді.

Кількість редукувальних речовин визначають по кількості йоду, що вступив у реакцію.

Прилади та реактиви.

- Ваги лабораторні загального призначення другого класу точності згідно з ГОСТ 24104.

- Термометр рідинний скляний з ціною поділки шкали 1°С і діапазоном вимірювання температури від 0 до 100°С згідно з ГОСТ 28498.

- Стакан В (Н) - 1(2) - 50, В (Н) - 1(2) - 100, В (Н) - 1(2) - 1000 згідно з ГОСТ 25336.

- Циліндр 1(3) - 5 - 1(2), 1(3) - 10 - 2, 1(3) - 25 - 2, 1(3) - 100 - 2, 1(3) - 500 - 2, згідно з ГОСТ 1770.

- Колба мірна 1 - 100 - 2, 1 - 1000 - 2 згідно з ГОСТ 1770.

- Лійка В - 100 - 150 згідно з ГОСТ 25336.

- Колба Кн - 2 - 250 - 34 ТХС згідно з ГОСТ 25336.

- Бюретка згідно з ГОСТ 29251.

- Піпетка згідно з ГОСТ 29227.

- Папір фільтрувальний лабораторний марки Ф згідно з ГОСТ 12026.

- Вода дистильована згідно з ГОСТ 6709.

- Мідь сірчанокисла згідно з ГОСТ 4165.

- Калій-натрій виннокислий (сегнетова сіль) згідно з ГОСТ 5845.

- Калій йодистий згідно з ГОСТ 4232.

- Калій біхромат згідно з ГОСТ 4220.

- Натрій вуглекислий безводний згідно з ГОСТ 83.

- Натрію гідроксид згідно з ГОСТ 4328.

- Натрій фосфорнокислий двозаміщений згідно з ГОСТ 4172.

- Натрію тіосульфат згідно з ГОСТ 27068.

- Кислота соляна згідно з ГОСТ 3118.

- Кислота сірчана згідно з ГОСТ 4204.

- Йод згідно з ГОСТ 4159.

- Крохмаль розчинний згідно з ГОСТ 10163.

Підготовка до визначання.

Приготування початкового розчину.

Із освітленого розчину, що залишився після Визначання масової частки сахарози, відбирають піпеткою 10 см3 (відповідні 2,6 г бурякової меляси), переводять до мірної колби місткістю 100см3 за температури 20єС доводять вміст колби дистильованою водою до мітки і перемішують.

Проведення визначання.

Відбирають піпеткою 25 см3 початкового розчину (відповідні 0,65 г меляси), переводять до конічної колби місткістю 250 см3, додають 25 см3 реактиву Оффнера і на кінчику ножа додають трохи грубо подрібненої пемзи. Колбу ставлять на азбестову сітку і нагрівають на газовому пальнику 4-5 хв. до початку кипіння, потім зменшують полум'я так, щоб воно ледве торкалося сітки і підтримують помірне кипіння точно 7хв. Потім вміст колби охолоджують у холодній воді до 20єС, не збовтуючи, щоб уникнути окислення осаду.

Після кип'ятіння розчин повинен мати блакитно-зеленувате забарвлення.

Наявність жовтогарячого забарвлення розчину свідчить пор недостатню кількість реактиву Оффнера. У цьому випадку визначання повторюють з розчином, розведеним у 5, 10 або 20 разів. Для цього відбирають піпеткою 20, 10 чи 5 см3 початкового розчину, переводять до мірної колби місткістю 100 см3, за температури 20°С, доводять вміст колби дистильованою водою до мітки і перемішують. Відбирають піпеткою 25 см3 розведеного таким чином початкового розчину, що містить відповідно 0,13; 0,065 чи 0,0325 г бурякової меляси, переводять до конічної колби місткістю 100 см3 і добавляють 25 см3 реактиву Оффнера. 7,5 см3 розчину соляної кислоти молярної концентрації с(НCl)=1 моль/дм3, відміряного циліндром, обережно додають по стінках колби до охолодженого розчину, що має блакитно-зеленувате забарвлення, щоб розчинити осад, який знаходиться на стінках, і відразу чи після додавання кислити додають до випробувального розчину із бюретки 20 см3 розчину йоду молярної концентрації 0,0323 моль/дм3. Колбу закривають скляною або корковою пробкою і залишають на 2 хв., періодично перемішуючи вміст обертанням.

Рівно через 2 хв. відтитровують надлишок йоду у колбі розчином тіосульфату натрію молярної концентрації 0,0323 моль/дм3. У кінці титрування, коли розчин стане світло-жовтим, до нього додають 2,5 см3 розчину з масовою часткою крохмалю 0,5% і титрують до зникнення синього забарвлення.

Одночасно проводять контрольний дослід (з тією ж кількістю розчину меляси, реактивів і йоду, що і в основному досліді, без кип'ятіння) для встановлення поправки на окислення йодом речовин, які знаходяться в розчині. За різницею між кількістю тіосульфату натрію, витраченого на титрування у робочому і контрольному дослідах, встановлюють кількість сполучного йоду. Масову частку редукувальних речовин Ис у відсотках обчислюють (із розрахунку, що 1 см3 розчину йоду молярної концентрації 0,0323 моль/дм3 еквівалентний 1 мг редукувальних речовин) за формулою:

,

де V3 - кількість розчину тіосульфату натрію, витраченого на титрування у контрольному досліді, см3;

V4 - кількість розчину тіосульфату натрію, витраченого на титрування у робочому досліді, см3;

Н - фактична маса бурякової меляси з урахуванням (якщо це мало місце) додаткового розведення початкового розчину, г.

У тому випадку, якщо поправкові коефіцієнти розчинів йоду (КИ) і тіосульфату натрію (КТ) відмінні від одиниці, масову частку редукувальних речовин у мелясі визначають за формулою:

,

де: VИ - кількість розчину йоду, витраченого на Визначання, см3;

КИ - коефіцієнт поправки розчину йоду;

VТ - кількість розчину тіосульфату натрію, витраченого на титрування, см3;

КТ - коефіцієнт поправки розчину тіосульфату натрію;

К - поправка на витрату йоду у контрольному досліді;

Н - маса проби, г.

За кінцевий результат приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допущена розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,1 %.

Приклад.

На визначання редукувальних речовин до 25 см3 розчину, одержаного розведенням у 10 разів (10:100) розчину, підготовленого для Визначання масової частки сахарози (відповідного 0,65 г меляси), додали 20 см3 розчину йоду молярної концентрації 0,0323 моль/дм3. На титрування надлишку йоду затратили 13 см3 розчину тіосульфату натрію молярної концентрації 0,0323 моль/дм3. На ту ж кількість йоду у контрольному досліді витратили 16,8 см3 тіосульфату натрію. Отже, кількість йоду, що вступив у реакцію: 16,8 - 13,0 = 3,8 см3, тобто у 0,65 г меляси міститься 3,8 мг або у відсотках до маси меляси:

Обробляння результатів.

Масову частку суми цукрів, що зброджуються, Сзбр. у відсотках обчислюють за формулою:

Сзбр. = 0,68П + 0,96И + 0,80Ис,

де П - масова частка сахарози, %;

И - величина інверсійної поляризації, %;

Ис - масова частка редукувальних речовин, %.

За кінцевим результатом випробування приймають середнє арифметичне результатів двох паралельних визначень, допущена розбіжність між якими не повинна перевищувати 0,7 %.

Визначання доброякісності меляси.

Доброякісність меляси розраховують за рівнянням:

де Сзбр. - масова частка суми цукрів, що зброджуються, %;

Р - масова частка сухих речовин у мелясі, %.

Таблиця 5 - Хімічні показники зерна

№ п/п	Назва показників	Вимоги ГОСТу на зерно	Фактичні дані
			Зразок 1	Зразок 2	Зразок 3
1.	Вологість, %
2.	Вміст крохмалю, %

Контрольні питання.

1. Сировина, яка використовується для виробництва спирту етилового ректифікованого. Характеристика сировини згідно з ДСТУ.

2. Підготовка сировини до виробництва, як зерна так і меляси.

3. Визначання вологи у зерні.

4. Розшифруйте термін «умовна крохмалистість».

5. Сутність методу Визначання крохмалистості за Еверсом.

6. Визначання лужності або кислотності меляси. В яких одиницях виражають ці показники?

7. Визначання вмісту сухих речовин меляси. Сутність методу.

8. Сутність методу Визначання сахарози у мелясі.

9. Розшифруйте поняття «зброджувальні цукри». Як вони визначаються?

10. Сутність методу інверсійної поляризації.

11. Як визначають редукувальні речовини за методом Оффнера і Мюллера. Провести порівняльну характеристику цих методів.

12. Основні показники доброякісної меляси. Як розраховують доброякісність меляси?

Лабораторна робота № 3. Визначання вмісту засвоюваного азоту та азоту амінокислот у мелясі. Визначання калію, натрію і кальцію в мелясі

Мета роботи: Вивчити метод Визначання загального азоту методом Кьєльдаля і амінного азоту мідним методом. Вивчити комплексометричний метод Визначання кальцію,кобальтонітритний метод швидкого Визначання калію.

Теоретичні основи.

Азотні речовини меляси в процесі росту дріжджів змінюються, утворюють нові сполуки в значній мірі визначають вихід і якість готового продукту. Загальний вміст азоту визначають по методу Кьєльдаля. Принцип методу складається в окисленні органічних азотовмісних сполук концентрованою сірчаною кислотою при нагріванні. При цьому вуглець та водень окислюється киснем, який виділився при розкладенні сірчаної кислоти, азот відщеплюється в вигляді аміаку, який з сірчаною кислотою утворює сульфат амонію. При цьому пробігають такі реакції:

H2SO4 > H2O + SO2 + O;

C + O2 > CO2

H2 + O >H2O

RNH2 + HOH > ROH + NH3;

(де R - радикал органічної сполуки)

2NH3 + H2SO4 > (NH4)2SO4.

Після згорання додають NaOH, в результаті чого виділяється аміак, який відганяють розчином сірчаної кислоти, концентрації с(1/2Н2SO4)=0.1 моль/дм3

(NH4)2SO4 + 2NaOH > Na2SO4 + 2H2O + 2NH3.

2NH3 + H2SO4 > (NH4)2SO4.

Надлишок кислоти відтитровують розчином (NaOH)=0,1моль/дм3 та по кількості кислоти, яка вступила в реакцію з аміаком визначають кількість аміаку в перерахунку на азот.

Мідний метод полягає в здатності амінокислот утворювати розчинні комплексні сполуки з надлишком суспензії ортофосфату міді Си3(РО4)2•3Н2О в боратному буферному розчині. Надлишок ортофосфату міді відфільтровують, в фільтрат додають оцтову кислоту і йодиту калію та титрують тіосульфатом натрію, концентрацією с=0,01 моль/дм3.

2Си(RCHNH2СОО)2 + 4КI = 2CuI + I2 + 4RCHNH2COOK.

1 см3 0,01 моль/дм3 розчину тіосульфату натрію відповідає 0,28мг азоту амінокислот.

Методи визначання калію, натрію і кальцію розділяються на хімічні і фізико-хімічні.

Серед перших для Визначання кальцію і магнію застосовують комплексометрію. Для Визначання калію застосовують кобальтонітритний метод.

В основі кобальтонітритного методу лежить реакція взаємодії калію із кобальтонітритом натрію в нейтральному або слабко кислому середовищі з утворенням мілко кристалічного осаду жовтого кольору у вигляді комплексної солі:

Na3[Co(NO2)6]+2K=2Na+K2Na[Co(NO2)6]

Реакція специфічна і дуже чутлива, особливо у присутності натрію. Осад, що утворився, промивають, висушують і зважують.

Комплексометричний метод визначання кальцію заснований на здатності комплексона 111 (трилон Б або етилендиамінтетраацетат натрію Na2H2 [ЕДТА])утворювати в лужному середовищі з катіонами Са2+ і Mg2+ розчинні у воді, але міцні внутрішньо комплексні сполуки за схемою:

Міцність утвореного комплексу Na2Ca[ЕДТА] залежить від величини рН. Для здвигу реакції зліва направо водень, що утворився, необхідно нейтралізувати надлишком лугу. При титруванні трилоном Б дослідженого розчину, який містить Са2+ і Мg2+, кінець комплексоутворення встановлюють спеціальними органічними індикаторами, що відносяться до азобарвників.

Калій міститься в мелясі в кількості від 1 до 5,5% в перерахунку на К2О. Встановлено, що для нормального виходу хлібопекарських дріжджів в буряковій мелясі має бути не менше 3,5% К2О.

Відомо також, що в нормальній мелясі міститься Са2+ в перерахунку на СаО від 0,1 до 1,5%. Проте на спиртові і дріжджові заводи іноді надходить меляса із вмістом СаО більше 10%, що різко погіршує умови біосинтезу і розділення біомаси.

Комплексометричне визначання катіону кальцію в мелясі проводять в присутності магнію не більше 25 мг в титрованому об'ємі.

Визначання вмісту загального азоту в мелясі.

Прилади та реактиви:

- Колба Кьєльдаля;

- Аналітичні ваги;

- Установка для відгонки азоту;

- Сірчана кислота, х.ч. концентрованана, що витримує пробу Саваля

- Сірчана кислота, 0,1 моль/дм3 розчин;

- Метиловий червоний;

- Гідрооксид натрію, 0,1 моль/дм3 розчин;

- Гідрооксид натрію, 33%-розчин.

Для визначання вмісту загального азоту по Кьєльдалю беруть наважку від 1,5 до 2,5г. меляси. Зважують на аналітичних вагах у пробірці, яку вносять у колбу Кьельдаля, і виливають. При цьому спостерігають, щоб частинки аналізуємої речовини не прилипали до шийки колби. Масу меляси, яку взяли для аналізу, визначають по різниці між масою пробірки з наважкою і масою пустої пробірки. У цю ж колбу з мелясою додають 20-30см3 концентрованої хімічно чистої сірчаної кислоти (відносною густиною 1,84) і дають кислоті добре просочити мелясу протягом 2-4 год., щоб уникнути пінення в процесі спалювання. Колбу Кьєльдаля закріплюють в штативі, наважку спалюють при нагріванні до знебарвлення.

Вміст колби Кьєльдаля після охолодження розбавляють дистильованою водою невеликими порціями і зливають через лійку в колбу для відгону (об'єм рідини складає біля 400-500 см3), додають 50-100см3 33% розчину NaOH. Колбу для відгону підігрівають і відганяють аміак із водяною парою. Перегонку ведуть до зменшення обєму колби у два рази. По закінченню перегонки вміст приймальної колби титрують 0,1н. розчином гидроксиду натрію с(NaOH)=0,1 моль/дм3. Перегонку роблять в апараті, який зображений на рис. 3. Круглодонну або плоскодонну колбу встановлюють на штатив, з'єднують її щільною гумовою пробкою з краплеуловлювачем, та з холодильником. До холодильника приєднують алонж, який занурюють у рідину. У приймач наливають 50см3 розчину сірчаної кислоти с(1/2H2SO4)=0,1моль/дм3 і додають 1-2 краплі метилового червоного.

Вміст загального азоту X обчислюють по формулі:

X=0,0014(аК1 - ЕК2)100/Н,

де а - кількість розчину сірчаної кислоти с(1/2H2SO4)=0,1моль/дм3 в приймальній колбі, см3;

К1 - поправочний коефіцієнт сірчаної кислоти;

Е - кількість розчину гідроксиду натрію с(NaOH)=0,1моль/дм3, який пішов на титрування,см3;

К2 - поправочний коефіцієнт до розчину гідроксиду натрію с(NaOH)=0,1моль/дм3;

0,0014 - кількість азоту , що відповідає 1 см3 розчину сірчаної кислоти с(1/2H2SO4)=0,1 моль/дм3;

Н - наважка меляси, г.

Для перерахунку на білок кількість азоту множать на 6,25. Результати аналізу виражають з точністю до 0,01% і розходження між двома паралельними Визначаннями не повинно перевищувати ±0,3%.

Рисунок 3 - Апарат для перегонки: 1 - конічна колба, 2 - розширювач, 3 - трійник, 4 - холодильник, 5 - каплеуловлювач, 6 - колба для відгонки, 7 - нагрівач

Визначання амінного азоту «мідним методом».

Прилади та реактиви:

- Колба мірна, Кн-100згідно з ГОСТ 25336;

- Піпетки, 1-2-2-5 згідно з ГОСТ 29227;

- Гідроксид натрію, розчин с(NaOH)=0,1моль/дм3;

- Тимолфталеїн;

- Суспензія фосфату міді (II);

- Оцтова кислота, 80%-ний розчин;

- Крохмаль;

- Йодит калію;

13 г меляси розчиняють дистильованою водою в мірній колбі на 100 см3. З отриманого розчину відбирають 5см3 у мірну колбу на 25 см3, додають розчин гідроксиду натрію с(NaOH)=0,1 моль/дм3 до блідо-синього забарвлення (індикатор тимолфталеїн) і 15 см3 суспензії фосфату міді, і доводять водою вміст колби до мітки. Після фільтрування відбирають 5 см3 отриманого фільтрату, додають 0,25 см3 80%-ної оцтової кислоти і 0,5 г йодиту калію.

Йод, що виділився, відтитровують із мікробюретки розчином тіосульфату натрію с(Na2S2O7)=0,01моль/дм3 (індикатор-розчин крохмалю).

Вміст аміного азоту X(у %) визначають за формулою:

X=0,28· аКV1V3100/HV2 б· 1000,

де 0,28 - кількість аміного азоту, еквівалентна 1см3 розчину гіпосульфіту натрію с(0,01 моль/дм3), мг;

а - обґєм розчину гіпосульфіту натрію с(0,01 моль/дм3), який пішов на титрування, см3;

К-поправочний коефіцієнт гіпосульфіту натрію;

Н - наважка меляси г;

V1 - об'єм розведеної меляси, см3;

V2 - кількість розведеної меляси, см3;

V3 - кількість освітленого розчину, см3;

б - кількість фільтрату освітленої меляси, см3;

100 - перерахування у відсотки;

1000 - переклад мг у г.

На аналіз беруть 13г меляси і проводять розведення (V1=100см3) , відбирають розчин на освітлення (V2=5см3), доводять кількість освітленого розчину до 25 мл (V3=25см3) і на Визначання беруть 5см3 фильтрату. Підставляючи ці постійні величини в рівняння і виконавши скорочення, одержимо:

Х=0,28аК·100·25·100/13·5·5·1000=0,2154аК.

Визначання калію кобальтонітритним методом у мелясі.

Прилади та реактиви

- Розчини азотної кислоти с(HNO3)=1,0 моль/дм3 і с(HNO3)=0,01 моль/дм3;

- Водний розчин кобальт нітриту натрію з обґємною часткою 20% згідно з чинними нормативними документами;

- Спирт етиловий ректифікований з масовою часткою 96-96,5% об;

- Колби конічні 2-100-20 згідно з ГОСТ 1710;

- Колба Бюнзена;

- Скляний пористий фільтр №4;

- Сушильна шафа;

- Аналітичні ваги.

3-4 г меляси зважують і переносять водою в колбу місткістю 100 см3. Вміст колби доводять до мітки, перемішують та фільтрують. До 10 см3 фільтрату додають 1,1 см3 розчину азотної кислоти с(HNO3)=1,0 моль/дм3 і

5 см3 20%-ного розчину кобальт нітриту калію. Перемішують суміш, залишають її на 2 години для відстоювання. Потім осад переводять на фільтр №4, маса якого відома, розчином с(HNO3)=1,0 моль/дм3 і промивають 10 раз по 2 см3 спиртом етиловим ректифікованим. Видаляють рідину вакуум-насосом, а фільтр з осадом витирають зовні і сушать у сушильній шафі протягом 1 години при 105-110єС. Фільтр з осадом після охолодження в ексикаторі зважують. Вміст калію в мелясі с (в %) в перерахунку на К2О знаходять за формулою:

де b - маса отриманого осаду кобальт нітриту калію (без фільтрату), г;

0,1722 - коефіцієнт, що враховує частку калію(17,22%) в осаді;

1,2046 - коефіцієнт перерахунку К в К2О, який визначають із співвідношення молекулярних мас цих речовин (94,192:78,192 = 1,2046);

Н - наважка меляси, г.

Комплексометричний метод визначання кальцію.

Прилади та реактиви.

- Розчин Трилона Б с(0,05 моль/дм3), (9,31 г трилону Б розчиняють в 1 дм3 дистильованої води);

- Гідроксид натрію, розчин с(NaOH)=0,1моль/дм3;

Індикатор хром темно-синій,(0,5г індикатора розчиняють в 10 см3 аміачного буферного розчину і доводять до мітки 100 см3 96%-ним спиртом етиловим ректифікованим) або мурексид,(0,2 г мурексиду і 19,8 г NaCl);

Конічна колба 2-250-2 згідно ГОСТ 1770.

1,0-1,5 г меляси переводять в колбу на 250-300 см3, наливають 100 см3 дистильованої води, розчиняють мелясу, додають 5 см3 розчину гідроксиду натрію с(NaOH)=0,1 моль/дм3, 10-15 крапель індикатора хрому темно-синього (або мурексиду на кінчику ножа). Потім суміш повільно титрують розчином трилона Б с(0,05 моль/дм3) весь час перемішуючи до переходу забарвлення від винно-червоного до синього або від бузкового до рожевого.

Вміст Са2+ в перерахунку на СаО в мелясі розраховують за формулою:

Де а- кількість розчину трилона Б с(0,05 моль/дм3), що витрачена на утворення комплексу з кальцієм, см3;

К - поправочний коефіцієнт до розчину трилона Б с(0,05 моль/дм3);

1,3992- коефіцієнт перерахунку значень Са в СаО, (МСаО:МСа= 56,08: 40,08 =1,3992);

Кількість кальцію, що відповідає 1 см3 розчину трилону Б с = (0,05 моль/дм3), мг;

1000 - фактор перерахунку мг в г;

Н - наважка меляси, г.

Визначання кольору меляси.

Прилади та реактиви:

- Компаратор;

- Розчин йоду с(0,1 моль/дм3);

- Колба мірна місткістю 100 см3.

20 г меляси розчиняють в 100 см3 дистильованої води. Відбирають 10 см3 розчину, переносять в мірну колбу на 100 см3 і доливають до мітки дистильованою водою. Вміст колби добре перемішують та фільтрують. Далі беруть дві однакових склянки в першу наливають 50 см3 фільтрату, а в другу 47 см3 дистильованої води. В склянку з дистильованою водою із бюретки наливають 0,1н розчин йоду с= 0,1 моль/дм3 до вирівнювання забарвлення в обох склянках.

Кількість мілілітрів 0,1н розчину йоду концентрацією с=0,1 моль/дм3 помножують на 2.

Колір меляси виражають у см3 с= 0,1 моль/дм3 I2/100см3/ розчину меляси.

Оцінка якості меляси.

Меляса, яка поступає для переробки на спиртовий завод характеризується показниками: вміст сухих речовин - 74%, сума зброджуваних цукрів - 44%, інвертний цукор - 0,5%, рН - 6,8, загальний азот - 1,4%, амінний азот - 0,3%, зола - 7%, кальцій - 1,0%, колір - 2,0 см3 розчину йода с =0,1моль/дм3 на 100 см3 2%-ого розчину меляси.

Контрольні питання.

1. Якими методами визначають вміст азоту в мелясі?

2. Сутність метода “Мідного метода”.

3. Яким методом визначають загальну суму солей кальцію і магнію?

4. Визначання кольору меляси.

5. Дайте якісну характеристику мелясі, яку ви аналізуєте.

6. Сутність кобальтонітритного методу Визначання кальцію в мелясі.

7. Сутність комплексометричного методу Визначання кальцію в мелясі.

8. Вміст калію і кальцію в мелясі, що забезпечує нормальний вихід хлібопекарських дріжджів.

Лабораторна робота № 4. Тема: Оцінка якості ферментних препаратів, що застосовуються у спиртовому виробництві

Мета роботи: Визначання амілолітичної активності (АС), Визначання глюкоамілазної (ГлС), Визначання оцукрюючої активної (ОС)відповідних ферментних препаратів.

Теоретична частина.

Ферменти - це протеїни, які складаються з довгих ланцюгів амінокислот, що утримуються пептидними зв'язками. Ферменти присутні у всіх живих клітинах, де виконують важливу функцію керування метаболічними процесами, за яких поживні речовини перетворюються на енергію і сполуки для побудови нових клітин. Крім того, ферменти беруть участь у розщепленні складних сполук на прості.

Ферменти як каталізатори значно прискорюють всі біохімічні процеси, які без них проходили б дуже повільно, а, може, і зовсім не проходили б.

На відміну від неорганічних каталізаторів (кислоти, луги, метали) ферменти можуть розщеплювати тільки одну відповідну сполуку і розривати відповідні зв'язки.

Майже всі виробництва ферментів ґрунтуються на використанні мікроорганізмів. Один такий мікроорганізм може містити понад 1000 різних ферментів.

У спиртовій промисловості ферментні препарати почали широко застосовувати в останні 20 років.

Основною сировиною для виробництва спирту є крохмалевмісні зернові культури і картопля. Крохмаль складається із довгого ланцюга молекул глюкози, який повинен бути розділений на більш дрібні компоненти, перетворені в результаті метаболізму дріжджів на спирт. Ці біохімічні процеси проводяться за допомогою ферментів за дві стадії: розріджування і оцукрювання.

Раніше носіями ферментів для оцукрювання крохмалю був солод. Нині майже на всіх спиртозаводах його витіснили промислові ферментні препарати, які гарантують одержання високого виходу продукції. Термостійкі мікробні амілази гідролізують крохмаль навіть при температурі 100°С, в той час як ферменти солоду за таких умов інактивуються.

Раніше картоплю і зерно розраховували при температурі 150-160°С і тиску 0,5-0,8 МПа. Якщо тиск різко знижували, стінки клітин розривалися і зерна крохмалю звільнялися, стаючи доступними для ферментів солоду.

Зараз крохмалевмісну сировину на спиртових заводах розварюють при температурі 60-100°С і успішно оцукрюють ферментними препаратами амілоглюкозидази, які звільнюють зерна крохмалю від оболонки і розщеплюють молекули декстринів і крохмалю до глюкози.

Визначання амілолітичної активності (АС).

Сутність методу полягає у гідролізі крохмалю ферментами амілолітичного комплексу до декстринів різної молекулярної маси.

Амілолітична активність характеризує здатність амілолітичних ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів різної молекулярної маси і виражається числом одиниць вказаних ферментів в 1 г препарату.

За одиницю амілолітичної активності (АС) приймають здатність ферменту за визначених значень температури, рН і терміну дії каталізувати до декстринів різної молекулярної маси 1 г крохмалю, що складає 30 % крохмалю, введеного в реакцію.

Прилади та реактиви:

- Ваги лабораторні загального призначення не нижче 2-го класу за ГОСТ 244104.

- Колориметр фотоелектричний лабораторний (фотоелектроколориметр) за ГОСТ 12083.

- Прилад для вимірювання рН середовища.

- Термостат або ультратермостат, що забезпечує температуру нагрівання (30,0±0,2)°С.

- Баня водяна.

- Термометри за ГОСТ 215 з границями вимірювання 0-55°С і ціною поділки шкали не більше 0,1°С.

- Стаканчики для зважування за ГОСТ 25336.

- Стакани місткістю від 100 до 2000 см3 за ГОСТ 25336.

- Колби типу Кн місткістю від 100 до 2000 см3 за ГОСТ 25336.

- Колби мірні наливні 1 або 2-го виконання місткістю 100, 200, 250 і 1000 см3 за ГОСТ 1770.

- Лійки типу В за ГОСТ 25336.

- Піпетки 1, 2 і 3-го виконання від 0,5 до 20 см3 і 100 см3 за ГОСТ 20292.

- Бюретка типу І; 1, 2 або 3-го виконання ГОСТ 20292.

- Папір фільтрувальний лабораторний за ГОСТ 12026.

- Крохмаль розчинний за ГОСТ 10163.

- Ацетатний буферний розчин з рН 4,7, приготовлений за ГОСТ 4919.2.

- Натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний за ГОСТ 4172, розчин молярної концентрації 1/15 моль/дм3.

- Калій фосфорнокислий однозаміщений за ГОСТ 4198, розчин молярної концентрації 1/15 моль/дм3.

- Кислота соляна за ГОСТ 3118, розчин молярної концентрації речовини еквівалентна 0,1 моль/дм3 за ГОСТ 4919.2.

- Йод за ГОСТ 4159.

- Калій йодистий за ГОСТ 4232.

- Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Підготовка до визначання.

Приготування розчину крохмалю з масовою часткою 1 % (субстрата) (1,0±0,01) г крохмалю, який взято із вираховуванням вологи, поміщають в мірну колбу місткістю 100 см3, додають 25 см3 води і перемішують. Потім доливають в колбу іще 25 см3 води, ставлять колбу у киплячу водяну баню не менше ніж на 10-15 хв., безперервно перемішуючи її вміст до повного розчинення крохмалю. Після цього вміст колби охолоджують, додають 10 см3 ацетатного буферного розчину із рН 4,7 (для препаратів грибного походження), фосфатного буферного розчину з рН 6,0 (для препаратів бактеріального походження) або фосфатного буферного розчину з рН 5,6 (для препаратів із дріжджових мікроорганізмів). Об'єм рідини доводять до мітки дистильованою водою і вміст колби перемішують. Розчин повинен бути прозорим.

Розчин крохмалю готують в день проведення аналізу.

Приготування фосфатного буферного розчину з рН 5,6 і рН 6,0.

Змішують розчини фосфорнокислого натрія і фосфорнокислого калія концентрацією 1/15 моль/дм3 у співвідношенні 0,5:9,5 (для рН 5,6) і 1:9 (для рН 6,0).

Величину рН перевіряють на приладі. У випадку відхилення рН буферу від вимагаємого значення, відповідні розчини доводять до норми.

Приготування основного розчину йоду.

0,50 г йоду і 5,00 г йодистого калію розчиняють в бюксі з притертою кришкою в невеликій кількості води.

Вміст бюксу перемішують на магнітній мішалці при закритій кришці бюксу.

Розчин після повного розчинення йоду переносять в мірну колбу з притертою пробкою місткістю 200 см3 і об'єм доводять дистильованою водою до мітки.

Основний розчин йоду зберігають протягом 1 місяця у склянці із темного скла з притертою пробкою.

Приготування робочого розчину йоду.

2 см3 основного розчину йоду розводять розчином соляної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3 при аналізі препаратів бактеріального походження із передбаченою активністю більше 50 од./см3 в мірній колбі місткістю 100 см3.

Перед застосуванням робочого розчину перевіряють його оптичну густину в діапазоні довжин хвиль 434-450 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шарі 10 мм.

Оптична густина робочого розчину йоду повинна дорівнювати 0,220 (±0,01).

У випадку відхилення від цього значення додають до розчину кілька крапель соляної кислоти або основного розчину йоду.

Приготування основного розчину очищених ферментних препаратів.

0,1000-1,000 г дослідного препарату (в залежності від передбачуваної активності) розчиняють в невеликій кількості води, при необхідності старанно розтираючи скляною паличкою, кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100 см3, доводять дистильованою водою до мітки і перемішують. Препарати з нерозчинними наповнювачами фільтрують. Розчин зберігають протягом доби при температурі від 2 до 6°С.

Приготування робочого розчину очищених ферментних препаратів.

Робочий розчин готують у відповідності до таблиці 6 із основного розчину (для наважки 0,1000 г), розбавляючи його дистильованою водою таким чином, щоб в 5 см3 робочого розчину містилась маса ферменту, яка забезпечувала б в прийнятих умовах гідроліз крохмалю від 20 до 60 %.

Таблиця 6

Амілолітична активність (АС), од./Г (передбачувана)	Маса препарату в 5 см3 робочого розчину (m1), мг	Об'єм основного розчину, необхідний для вторинного розбавлення, см3	Загальний об'єм розбавленого розчину, см3
Від 20 до 80 включно	5,0	50,0	50,0
Від 80 до 150 включно	2,0	20,0	50,0
Від 150 до 300 включно	1,0	10,0	50,0
Від 300 до 700 включно	0,5	5,0	50,0
Від 700 до 1200 включно	0,25	10,0	200,0
Від 1200 до 2500 включно	0,125	5,0	200,0
Від 2500 до 5000 включно	0,05	2,0	200,0
Вище 5000	0,025	1,0	200,0

Робочий розчин ферментного препарату готують безпосередньо перед визначанням.

Приготування основного розчину із повітряно-сухої культури гриба.

5,00 г досліджуваної повітряно-сухої культури гриба, попередньо розтертої в ступці, переносять в конічну колбу місткістю 250 см3, додають 90 см3 дистильованої води і 10 см3 ацетатного буферного розчину з рН 4,7. Суміш витримують протягом 1 год в термостаті при температурі (30,0±0,2)єС, періодично перемішуючи і потім фільтрують. Фільтрат використовують в якості основного розчину.

Фільтрат зберігають протягом доби при температурі від 2 до 6єС.

Приготування робочого розчину із повітряно-сухої культури гриба.

Робочий розчин готують із основного розчину, розбавляючи його дистильованою водою, у відповідності до таблиці 7.

Таблиця 7

Амілолітична активність (АС), культури гриба од./Г., (передбачувана)	Маса культури гриба в 5 см3 робочого розчину (m1), мг	Об'єм основного розчину, необхідний для вторинного розбавлення, см3	Загальний об'єм розбавленого розчину, см3
Від 5 до 15 включно	37,5	15	100
Від 15 до 50 включно	10,0	4	100
Від 50 до 100 включно	2,5	1	100
Від 100 до 150 включно	1,25	1	200
Від 150 до 300 включно	0,625	0,5	200

Приготування основного розчину із культурної рідини бактеріального походження.

В мірну колбу місткістю 100 см3 наливають 90 см3 дистильованої води і вносять 1 см3 досліджуваної культури рідини. Об'єм доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування робочого розчину із культуральної рідини.

Робочий розчин готують із основного розчину, розбавляючи його дистильованою водою в мірній колбі місткістю 100 см3 у відповідності до таблиці 8.

Таблиця 8

Амілолітична активність (АС), культуральної рідини, од./см3 (передбачувана)	Маса культуральної рідини в 5 см3 робочого розчину, см3	Об'єм основного розчину, необхідний для вторинного розбавлення, см3
Від 10 до 25 включно	0,01	20,0
Від 25 до 50 включно	0,005	10,0
Від 50 до 75 включно	0,003-0,0035	6,0-7,0
Від 75 до 100 включно	0,0025	5,0
Від 100 до 125 включно	0,0020	4,0
Від 125 до 150 включно	0,0015	3,0
Вище 150	0,00125	2,5

Проведення визначання.

Беруть дві пробірки, наливають в кожну по 10 см3 розчину крохмалю (субстрату) і ставлять в термостат або водяну баню з температурою (30±0,2)°С на 5-10 хв. Потім, не виймаючи пробірок із термостату, наливають в першу 5 см3 дистильованої води (контрольна пробірка), у другу - 5 см3 робочого розчину аналізованого продукту (дослідна). Суміші швидко перемішують і витримують в термостаті протягом 10 хв.

Потім із кожної пробірки почергово відбирають по 0,5 см3 розчину і переносять в колби з попередньо налитими 50 см3 робочого розчину йоду. Вміст перемішують.

Отримані розчини набувають наступне забарвлення:

Контрольний розчин - синій колір, дослідний - фіолетовий різної інтенсивності в залежності від кількості непрогідролізованого крохмалю.

Через 5-10 хв. після змішування визначають оптичну густину розчинів фотоелектричним колориметром в діапазоні довжини хвиль 630-670 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм.

Контрольним розчином під час роботи на ФЕК є дистильована вода.

Обробляння результатів.

Масу прогідролізованого крохмалю (m) в г визначають за формулою:

.

де Д1 - оптична густина контрольного розчину;

Д2 - оптична густина дослідного розчину;

0,1 - маса крохмалю, яка взята для аналізу, г.

Якщо маса прогідролізованого крохмалю менше 0,02 г або більше 0,06г, то аналіз повторюють, підбираючи інше розведення.

Амілолітичну активність (АС) в од./г для препаратів бактеріального походження і в од./см3 для культуральної рідини розраховують за формулою:

Амілолітична активність (АС1) в од./г для препаратів грибного походження розраховують за формулою:

де m1 - маса ферментного препарату, який міститься в 5 см3 робочого розчину, мг;

5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 - коефіцієнт розрахункового рівняння, які отримані при математичній обробці експериментальних даних залежності маси прогідролізованого крохмалю від маси ферменту, взятого для аналізу в перерахунку на 1 годину дії ферменту.

За остаточний результат аналізу приймають середньоарифметичне значення результатів Визначання активностей, що отримані при аналізі двох паралельних наважок препарату, відносно допустиме розходження між якими не повинно перевищувати 5 %. Результат закруглять до першого десяткового знаку.

Межа можливих значень відносної похибки вимірювань при довірчій імовірності р = 0,95 складає 5 %.

Визначання глюкоамілазної активності.

Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі розчинного крохмалю ферментом глюкоамілази.

Глюкоамілазна активність (ГлС) характеризує здатність ферментного препарату каталізувати розщеплення розчинного крохмалю до глюкози і виражається числом одиниць активності в 1 г препарату.

За одиницю глюкоамілазної активності прийнято здатність ферменту каталізувати гідроліз розчинного крохмалю за визначених умов температури і рН, звільняючи за 1 хв. 1 мк/моль глюкози.

Прилади та реактиви.

- Апаратура і матеріали - за п.1 із наступними доповненнями.

- Колориметр фотоелектричний лабораторний (фотоелектроколориметр) за ГОСТ 12083 або спектрофотометр.

- Калій фосфорнокислий однозаміщений за ГОСТ 4198, розчин молярної концентрації 1 моль/дм3.

- Калій залізистосинеродистий за ГОСТ 4207.

- Глюкоза за ГОСТ 6038.

- Натрій оцтовокислий за ГОСТ 199.

- Кислота оцтова за ГОСТ 61.

- Крохмаль розчинний за ГОСТ 10163.

- Кислота бензойна за ГОСТ 10521.

- Калій гідроксид за ГОСТ 24363, розчин молярної концентрації 1 моль/дм3.

- Калій хлористий.

- Спирт етиловий ректифікований за ДСТУ 4221-2003.

- Глюкозооксидаза з ферментативною активністю 100000 од./г.

- Пероксидаза.

- Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Підготовка до визначання.

Приготування розчину крохмалю з масовою часткою 1 % (субстрату) - за п.1

Приготування фосфатного буферного розчину з рН 7,5 концентрацією 1 моль/дм3.

Змішують рівні об'єми розчинів фосфорнокислого однозаміщеного калію і гідроксиду калію концентрацією 1 моль/дм3.

Величину рН перевіряють на приладі.



Рисунок 4

Приготування розчину залізистосинеродистого калію з масовою часткою 1 % (розчина А).

0,05 г залізистосинеродистого калію кількісно переносять в мірну колбу місткістю 50 см3 і об'єм доводять дистильованою водою до мітки.

Розчин готують безпосередньо перед Визначанням.

Приготування розчину глюкооксидази (розчина Б).

5,00 (6,00) мг глюкооксидази розчиняють фосфатним буферним розчином з рН 7,5 в мірній колбі місткістю 50 см3 і потім додають 2,0 мг пероксидази. Об'єм доводять до мітки фосфатним буферним розчином.

Якщо активність глюкооксидази відрізняється від необхідної (100000 од./г), то наважку беруть з таким розрахунком, щоб в 50 см3 розчину містилось 500-600 од. активності.

Приготування робочого розчину С.

Робочий розчин С готують змішуванням рівних об'ємів розчинів А і Б.

Одержаний розчин зберігають в темній склянці в холодильнику протягом 2-3 діб.

Приготування насиченого розчину бензойної кислоти.

2,7 г бензойної кислоти кількісно переносять в мірну колбу місткістю 1000 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування стандартних розчинів глюкози.

Для приготування стандартних розчинів глюкози користуються перекристалізованою із спирту зневодненою глюкозою, яку зберігають в ексикаторі над хлористим кальцієм.

100,00 мг глюкози розчиняють в 100 см3 насиченого розчину бензойної кислоти. Із цього розчину відбирають почергово 5, 10 і 15 см3 в мірній колбі місткістю 100 см3 і доводять об'єм до мітки бензойної кислоти. Отримані розчини відповідають вмісту 50, 100 і 150 мкг глюкози в 1 см3.

Ці розчини використовують для побудови градуювального графіка.

Приготування основного і робочого розчинів очищених ферментних препаратів готують за п.1.

Робочий розчин готують із основного розчину, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності препарату.

Приготування основного і робочого розчинів із повітряно-сухої культури гриба

1,00-5,00 г дослідної повітряно-сухої культури гриба (в залежності від активності) попередньо розтертої в ступці, переносять в конічну колбу місткістю 250 см3, додають 100 см3 дистильованої води, суміш витримують при кімнатній температурі протягом 1 год, періодично перемішуючи, а потім фільтрують.

Основний розчин зберігають потягом доби при температурі від 2 до 6°С.

Робочий розчин готують із основного, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності.

Приготування робочого розчину із культуральної рідини.

Відфільтровану культуральну рідину розбавляють дистильованою водою в 1000 і більше разів в залежності від передбаченої активності.

Побудова градуювального графіка.

В пробірки приливають по 1 см3 стандартних розчинів глюкози, додають по 3 см3 робочого розчину С. В контрольну пробу (контроль на реактив С) замість глюкози доливають 1 см3 дистильованої води. Залишають пробірки на 45 хв. при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Потім виміряють інтенсивність забарвлення розчину глюкози в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм проти контрольної проби з реактиву С.

За отриманими значеннями будують градуювальний графік, що має лінійну залежність.

Робоча зона градуювального графіка лежить в області 50-150 мкг.

Оптична густина розчину повинна бути близькою до значень 0,1±0,01; 0,2±0,01; 0,3±0,01.

Якщо оптична густина відрізняється від цих значень, то наважку глюкооксидази збільшують.

Проведення визначання.

Беруть дві паралельні наважки досліджуваного продукту і з кожної роблять не менше двох розведень. Кожне розведення досліджуваного розчину аналізують не менше двох разів.

В пробірку наливають 10 см3 розчину крохмалю (субстрату) і ставлять в термостат або водяну баню з температурою (30,0±0,2)°С на 5-10 хв. Потім доливають до вмісту пробірки 5 см3 розчину досліджуваного продукту і інкубують суміш на протязі 10 хв. при тій же температурі.

Потім 1 см3 суміші переносять в другу пробірку, що знаходиться в киплячій бані, витримують протягом 2 хв. (для інактивації ферменту) і охолоджують холодною водою. Потім до суміші додають 3 см3 розчину С, перемішують і залишають на 45 хв. при кімнатній температурі.

Одночасно готують контрольну пробу. Для цього 5 см3 розчину досліджуваного продукту витримують в киплячій водяній бані протягом

10 хв. (для інактивації ферменту). Потім розчин охолоджують і додають 10 см3 розчину крохмалю.

Всі наступні операції з контрольними пробами проводять також, як і з дослідними.

Крім вказаної контрольної проби на інактивований фермент ставлять контрольну пробу на робочий розчин С. Для цього до 3 см3 розчину приливають 1 см3 дистильованої води.

Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм. в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм.

Якщо контрольні проби на інактивований фермент мають забарвлення, то необхідно досліджуваний розчин проколориметрувати, взявши в якості розчину порівняння робочий розчин.

Значення оптичної густини повинно знаходитись в межах відповідних масі глюкози від 50 до 150 мкг.

Обробляння результатів

Глюкоамілазну активність (ГлС) в од./г обраховують за формулою:

де m - маса глюкози, що утворилась в 1 см3 гідролізату за рахунок дії ферменту, знайденого за калібровочним графіком, мкг;

m1 - маса ферменту, що міститься в 1 см3 гідролізата, взятого на визначання, г;

10 - термін гідролізу, хв.;

180 - молекулярна маса глюкози, г/мкмоль.

Визначання глюкоамілазної активності (ГлС) глюкооксидазним методом (арбітражний метод).

Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі мальтози ферментом глюкоамілазою.

Глюкоамілазна активність характеризує здатність ферментного препарату каталізувати гідроліз мальтози з утворенням глюкози і виражається числом одиниць в 1 г (або 1 см3) препарату.

За одиницю активності глюкоамілази приймається здатність фермента каталізувати за визначених значень температури і рН гідроліз 1 мкмоль мальтози до глюкози за 1 хв.

Прилади та реактиви.

- Ваги лабораторні загального призначення згідно з ГОСТ 24104.

- Цукромір універсальний СУ-3, СУ-4, автоматичний СП або автоматичні поляриметри А1-ЕПо або А1-ЕПЛ.

- Прилад для вимірювання рН середовища в діапазоні 0-14 з похибкою вимірювання ±0,1 рН.

- Термостат або ультратермостат, який забезпечує температуру нагріву (50±2)°С.

- Термометри за ГОСТ 28498 діапазоном вимірювання 0-100°С і ціною поділки шкали не більше 0,1°С.

- Колби типу Кн місткістю від 100 до 1000 см3 за ГОСТ 25336.

- Колби мірні наливні 1-го або 2-го класу виконання місткістю 100, 200, 250 і 1000 см3 за ГОСТ 1770.

- Воронки типу В за ГОСТ 25336.

- Піпетки типу 2, 1-го і 2-го класу виконання місткістю від 1 до 25 см3 за ГОСТ 29227 або ГОСТ 29169.

- Пробірки П1-21-200, П1-16-150, П2-19-180, або П2-16-150 за ГОСТ 25336.

- Мальтоза перекристалізована для бактеріальних цілей за НД.

- Розчин буферний ацетатний з рН 4,7, приготовлений за ГОСТ 4919.2.

- Кислота соляна за ГОСТ 3118, розчин молярної концентрації 5 моль/дм3.

- Цинк сірчанокислий 7 - водневий за ГОСТ 4174.

- Калій залізистосинеродистий 3 - водний за ГОСТ 4207.

- Вода дистильована за ГОСТ 6709.

Приготування до визначання.

Приготування розчину мальтози з масовою часткою 2 % (субстрат).

20,00 г перекристалізованої мальтози, взятої з урахуванням вологи, розчиняють в мірній колбі місткістю 1000 см3 в невеликій кількості води, додають 100 см3 ацетатного буферного розчину, доводять до мітки дистильованою водою і фільтрують. Розчин мальтози готують не менше ніж за добу до його використання, щоб в ньому пройшла мутаротація.

Зберігають розчин при температурі 4-6°С протягом 30 днів. Якщо під час зберігання розчин мальтози помутніє, використовувати його не можна.

Приготування розчину залізистосинеродистого калію масової частки 15 %.

17,65 г калію залізистосинеродистого кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100 см3, перемішують до повного розчинення солі (у випадку необхідності розчин підігрівають) і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину сірчанокислого цинку масовою часткою 30%.

42,85 г сірчанокислого цинку кількісно переносять в мірну колбу місткістю 100 см3, перемішують до повного розчинення солі (у випадку необхідності розчин підігрівають) і доводять до мітки дистильованою водою.

Приготування розчину соляної кислоти концентрації 5 моль/дм3.

430 см3 соляної кислоти поміщають в мірну колбу місткістю 1000 см3, розчиняють і доводять об'єм до мітки дистильованою водою.