1

26

ТЕМА №5.

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ФП) В БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ

5.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Ферменты - вещества белковой природы, обладающие каталитическими свойствами. ФП - это препараты, содержащие молекулы ферментов. Ассортимент ферментных препаратов и объем их производства растут с каждым годом.

Преимущества использования ФП:

1. безопасность, нетоксичность;

2. высокая специфичность реакций;

3. работа в мягких условиях (t=15-60?С, рН=4-9, атм. D);

4. быстрая возобновляемость;

5. возможность регуляции работы ферментов.

Существует 6 классов ферментов (по типу осуществляемых ими реакций). Из них для бродильных производств наибольшее значение имеют гидролазы. Они используются чаще всего на начальных стадиях производственного процесса, когда необходимо расщепить структурные и запасные полимеры.

Источники ФП: растения, животные, микроорганизмы. В основном их получают из микроорганизмов. Получение из растений и животных возможно, но более сложно.

Схема получения ФП:

1. Выбор продуцента: это могут быть бактерии, актиномицеты, грибы. Продуцент должен быть генетически стабилен, иметь высокую ферментативную активность, высокую скорость роста, расти на дешевой и доступной субстанции. На этом этапе осуществляется очень строгий контроль, жесткие условия хранения продуцента, высокая стерильность.

2. Культивирование: 2 основных способа: глубинное и поверхностное. В зависимости от способа ФП-м присваиваются буквенные обозначения: Г - глубинные, П - поверхностные.

3. Получение ферментных препаратов из культур продуцентов.

ФП имеют разную степень концентрирования и очистки: х, 3х, 3х-Ф, 10х, 20х, 25х (дорогие).

Гх: неочищенная культурная жидкость, используется на месте выработки (например, получают на спиртовых заводах), если добавить консерванты, то ее можн транспортировать.

Г3х: имеют ферментативную активность (г/мл) в 3 раза выше, чем Гх. Получены путем распылительной сушки концентрированной культуральной жидкости. Концентрируют вакуум-выпариванием при 30?С с добавлением стабилизаторов (NaCl). Это тоже "грязные" ФП (10¹⁰ спор/г), используют как Гх.

Г3х-Ф: культуральную жидкость фильтруют, концентрируют, сушат. Это частично очищенные ФП, так как удалена биомасса, активность выше, чем у Г3х.

Г10х: обрабатывают коагулянтами культуральную жидкость, фильтруют, концентрируют (+стабилиз.агентов), осаждают ферменты органическими растворителями, ферментный осадок отделяют от жидкой фазы и высушивают. Строгие дозировки данных ФП!!!

Г20х: для получения используют ультрафильтрацию (полупрониц. мембраны), остальное - как в Г10х.

Пх: получают высушиванием культуры грибов, "грязные", аналогичны Г3х.

П10х, П25х: водная экстракция ферментов, отделение экстракта; осаждение

¦ ¦ органических соединений; отделение осадка в Н₂О, добавление

¦ ¦ стабилизатора и наполнителя, сушка.

Г10х, Г20х

П20х: получают ультрафильтрацией.

Все подобные ФП растворимы, поэтому используются только 1 раз.

Название ФП:

Название состоит из нескольких частей: название основного фермента+видовое название продуцента+способо полчения+степень очистки (например, Амилосубтилин = ?-амилаза из Bac. subtilis).

Глюковаморин = глюкоамилаза из Asp. awamori

Пектаваморин = пектиназа+протеаза из -//-

Целовиридин = целлюлаза из Trichod. viride

Целлоконингин = -//- из T. koningii

Целолигнорин = -//- из T. Lignorum; Целлобранин = -//- из T. logibrachiatum

Пектофолитидин = пектиназа+протеаза из Asp. Foetidus,

и так далее, более 35, каждый имеет активность фермента, измеряемую в ед/г, оптимальные рН и температуру действия.

5.2. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В СПИРТОВОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

Спиртовое производство основано на конверсии зернового или картофельного сырья, с последующим использованием ЧКД.

Здесь стоят 2 основные задачи:

1. полностью гидролизовать полисахариды сырья (крахмал, целлюлоза) в сбраживаемые моно- и дисахара;

2. обеспечить ЧКД питательными элементами, необходимыми для быстрого размножения и синтеза гидролизующих и бродильных ферментов.

Гидролиз крахмала

Для этого используют (кроме солода) ферментные препараты ?-амилазу и гликоамилазу.

-амилаза бывает термостабильной и с низким температурным оптимумом действия.

?-амилазу термостабильную лучше использовать на стадии разваривания. С ее помощью можно осуществить: непрерывный процесс разжижения, совместить его с развариванием, сократить время обоих процессов.

Термостабильная ?-амилаза имеет температурный оптимум 76-96?С. Ее получают из бактерий B. licheniformis в виде ферментных препаратов Терамамил, Амилолихетерм.

?-амилазу с низкой опт. температурой действия используют на стадии осахаривания. ФП - Амилосубтилин Г3х, Амилоризин.

Глюкоамилаза позволяет полностью гидролизовать крахмал. ФП: Глюковаморин Гх, Амилоглюковаморин Гх, получить можно прямо на спиртовом заводе).

Оптимальные условия действия данных ФП рН 4-5,5. Эта величина совпадает с рН бражки (4,2-5,2), поэтому применение ФП с глюкоамилазой сокращает процессы гидролиза и брожения.

N.B.!!! Необходимо совмещать ?-амилазу и глюкоамизазу.

Гидролиз целлюлозы, гемицеллюлозы

Резервом для получения моносахаридов, кроме крахмала, являются целлюлоза, гемицеллюлоза. За счет них можно увеличить выход спирта на 10-12%. А их гидролиз также повышает доступность гидролизу крахмала.

Поэтому целесообразно использовать цитолитические ферментные препараты на стадии осахаривания совместно с ?-амилазой и глюкоамилазой.

Используют ФП: Целлофторин Г3х (гидролиз пшеницы); Целлобранин; Целлюлаза; Ксилоглюканофоетидин П10х (гидролиз ржи и ячменя). Оптимальная дозировка 14-16 ед/г субстрата: при 60?С за 2-4 ч расщепляется 50% целлюлозы.

Гидролиз ?-глюкана

При сбраживании сырья с высоким содержанием ?-глюкана (рожь, ячмень) используют ферментные препараты ?-глюканазы, применяют их на стадиях осахаривания и разжижения замеса.

ФП: Целловиридин, Вискозим; оптимальная доза 3-6 ед/г субстрата.

Гидролиз белков

Для оптимального роста и размножения дрожжей, и, следовательно, для увеличения выхода спирта, необходимо оптимизировать содержимое питательной среды. Лимитирующим фактором для дрожжей является недостаток аминокислот. Добавлять чистые аминокислоты в сусло дорого. Поэтому проводят гидролиз белка сырья/замеса с использованием ферментов: пептидаз, протеаз.

Из протеолитических лучше использовать грибные ФП: Asp.oryzae (Проторизин, Амилоризин, Амилопроторизин; дозировка 5 ед/г белка).

5.3. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В ПИВОВАРЕНИИ

ФП в пивоварении используются на 3-х стадиях производства: получение пивного сусла, главное брожение, дображивание пива.

Получение пивного сусла

При получении сусла из полноценного солода ФП не используются, т.к. солод - это неочищенный ферментный препарат. Кроме того, в пивоварении не нужна максимальная степень расщепления полимеров сырья, так как продукты неполного расщепления необходимы для полноты вкуса и пенообразования.

Но ФП используются, если применяется солод с низкой активностью или используется много несоложеного сырья. Тогда в начале затирания совместно с солодом используют ?-амилолитический ФП 0,025% МЭК ПП-1, в который входят Амилосубтилин, Протосубтилин, Амилоризин (с ферментами амилазами, пептидазами, глюканазами).

При получении пива из некондиционного солода, из смешанного сырья обязательно используют цитолитические ФП. Они используются в комплексе с амилолитическими и протеолитическими. Это снижает время осахаривания, снижает вязкость сусла, повышает скорость его фильтрации, повышает выход экстракта и повышает конечную степень сбраживания.

При введении в сусло перед брожением ФП с протеолитической активностью (Протосубтилин, Протофоетидин, Проторизин) сусло обогащается аминокислотами. Что особенно важно при использовании несоложеного сырья (см. п.4.2.).

Главное брожение

До главного брожения и во время него в бродящее сусло вносят ферменты амилоглюконазы. Цель: повысить степень расщепления декстринов до сахарозы.

Дображивание пива

У этой стадии главная цель - стабилизация пива.

ФП используют для борьбы с коллоидным помутнением. Коллоидное помутнение - комплекс из нейтральных полисахаридов, белков, полифенолов, ионов металлов. Для удаления комплексов используют папаин; бромелаин, фицин, пепсин, Протосубтилин, Амилоризин, Пектофоетидин. и др. То есть используют ФП с активностями: протеолитической, амилолитической, глюканазной, целлюлазной.

ФП с высокой степенью очистки вносят на стадии дображивания. Иногда их вносят в охмеленное сусло Т=30-40?С, но это уже слабоочищенные ФП. Внесение их в сусло позволяет избежать обсемененности, повысить стабильность, исключить попадание посторонней микрофлоры в пиво.

Для борьбы с микробным помутнением нужен лизис клеток бактерий и дрожжей. Поэтому используют литические пептидазы (Лизосубтилин Г10х, папаин, Протосубтилин).

Для удаления О₂ из пива используют ФП, содержащие полифенолоксиды, пероксидазы.

5.4. ИММОБИЛИЗАЦИЯ (И) ФЕРМЕНТОВ И КЛЕТОК

Иммобилизация ферментов

Иммобилизация - это процесс связывания и ограничения с носителем, снижения подвижности ферментов.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов используют: природные, синтетические, органические, неорганические (целлюлоза, хитин, полимеры, активированный уголь, стекло, Тi, олово) соединения.

Значение иммобилизации:

1. Увеличивает стабильность ферментов к внешней среде;

2. Позволяет многократно использовать фермент;

3. Экономически выгодно;

4. Повышает активность фермента.

Принципы иммобилизации:

1. Химическая: связывание за счет ковалентного связывания фермента с носителем.

2. Физическая: за счет адсорбции или ограничения пространства, за счет водородных, гидрофобных, адсорбционных сил.

Достоинства химической иммобилизации по сравнению с физической:

1. Высокая стабильность;

2. Прочное связывание;

3. Не зависит от ионной силы, рН.

Недостатки химической иммобилизации по сравнению с физической:

1. Снижает активность ферментов.

Способы иммобилизации ферментов: (рис. 2)

Иммобилизация клеток

Преимущества И клеток перед И ферментов

При использовании целых клеток не требуется стадии выделения и очистки фермента.

Клетка, в отличие от фермента, способна осуществлять многостадийные процессы, имея все необходимые коферменты.

Условия иммобилизации клеток:

Чаще всего связывают с гелями. Живые клетки связывают только в период покоя или замедления роста.

в противном случае, при иммобилизации на поверхности, делящиеся клетки будут «выбрасывать» в глубину раствора свое потомство, это повлияет на качество продукта, вызовет его порчу.

В противном случае, при иммобилизации внутри геля, при делении и росте клеток гель растрескается. Перед иммобилизацией проводят специальную обработку клеток, приводящую к повышению проницаемости клеточной стенки (органическими соединениями; изменением рН).

Поскольку в клетке содержится много балластных ненужных веществ, то иногда вместо клетки иммобилизируют ее органеллы: лизосомы, пероксисомы и др.

Соиммобилизация

Соиммобилизация - совместная иммобилизация биокатализаторов одинаковых (2-х и более ферментов, клеток, органелл) и разных (чаще всего клетка+Ф).

Варианты соиммобилизации:

1. Кл и Ф имеют одинаковую каталитическую активность: это ускоряет реакцию, повышает стабильность иммобилизации.

2. Кл и Ф катализируют разные реакции: тогда происходит поэтапное превращение субстрата в продукт.

Применение иммобилизации

Иммобилизованные ферменты:

· ?- и ?-амилазы: для подготовки сырья к брожению;

· цитолитические ферменты: для разрушения клеток; увеличения экстракции веществ;

· протеазы: для удаления мути в пиве, при производстве соков; для синтеза пищевых добавок.

Иммобилизованные клетки: В процессах брожения для экономии чистых культур микроорганизмов (рис.3).

Соиммобилизация: