Изучение основ и принципов процедуры биотестирования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Целью работы является изучение основ и принципов процедуры биотестирования.

Были рассмотрены и решены следующие задачи:

- выполнен анализ основных принципов методов биотестирования;

- изучена классификация природных вод по токсичности;

- рассмотрены методы биотестирования на различных группах организмов;

- описан опыт практического применения биотестирования на территории РФ.



1. Основные принципы методов биотестирования

Биотестирование (биологическое тестирование) - оценка качества объектов окружающей среды (воды и пр.) по ответным реакциям живых организмов, являющихся тест-объектами.

Это широко распространенный экспериментальный методический прием, который представляет собой токсикологический эксперимент. Суть эксперимента заключается в том, что тест-объекты помещают в исследуемую среду и выдерживают (экспонируют) определенное время, в течении которого регистрируют реакции тест-объектов на воздействие этой среды.

Приемы биотестирования широко применяются в различных областях природоохранной деятельности и используются по различным назначениям. Биотестирование является основным методом при разработке нормативов ПДК химических веществ (биотестирование токсичности индивидуальных химических веществ), и, в конечном итоге, при оценке из опасности для окружающей среды и здоровья населения. Таким образом, оценка уровня загрязнения по результатам химического анализа, т.е. интерпретация результатов с точки зрения опасности для окружающей среды, также в значительной степени опирается на данные биотестирования.[12]

Методы биотестирования, будучи биологическими по сути, близки по смыслу получаемых данных к методам химического анализа вод: как и химические методы, они отражают характеристику воздействия на водные биоценозы.

Требования, применяемые к методикам биотестирования:

- чувствительность тест-организмов к достаточно малым концентрациям загрязняющих веществ.

- отсутствие инверсии ответных реакций тест-организмов на разные значения концентрации загрязняющих веществ в пределах тех значений, которые отмечены в природных водах;

- возможность получать надежные результаты, метрологическая обеспеченность методик;

- доступность тест-организмов для сбора, простота культивирования и содержания в условиях лаборатории;

- простота выполнения процедуры и технических приемов биотеста;

- низкая себестоимость работ по биотестированию.

Развиваются два основных направления работ по биотестированию:

- подбор методик с использованием гидробионтов, охватывающих основные иерархические структуры водной экосистемы и звенья трофической цепи;

- поиск наиболее чувствительных тест-организмов, которые позволили бы уловить низкий уровень токсичности при обеспеченной гарантии надежности информации.[5]



2. Токсичность вод

О наличии токсичности судят по проявлениям негативных эффектов у тест-объектов, которые считаются показателями токсичности. Среди показателей токсичности выделяют: общебиологические, физиологические, биохимические, химические, биофизические, и т.д. Показателем токсичности является тест-реакция, изменения которой регистрируют в ходе токсикологического эксперимента. Следует заметить, что под токсикологическими (биотестовыми) показателями в экологической и водной токсикологии понимают показатели биотестирования на различных тест-объектах. В тоже время в санитарно-гигиеническом нормировании под токсикологическими показателями понимают концентрации токсичных химических веществ (например, в нормировании питьевой воды они характеризуют ее безвредность). [7] При биотестировании проб природной воды обычно ставят два вопроса: - токсична ли проба природной воды; - какова степень токсичности, если таковая имеется? В результате биотестирования проб на основе регистрации показателей токсичности делают оценку токсичности по критериям, установленным для каждого биообъекта. Результаты биотестирования опытной пробы с исследуемого участка сравнивают с контрольной, заведомо нетоксичной робой и по разнице в контроле и опыте судят о наличии токсичности.

Таблица 2.1. Классификация природных вод по токсичности

Группа	Токсичность	ЛК доза 96-120 часов, мг/л	Рыбохоз. ПДК, мг/л	Отношение ЛКзо/ПДК
1	Особо высокая	Менее 0,01	Менее 0.0001	100
2	Высокая	1,0-0,01	0,01-0,0001	100
3	Средняя	10-1,0	0,1-0,01	50
4	Умеренная	100-10,0	10,0-0,1	10
5	Малая	1000-100	200-100	5
6	Очень малая	Более W00	Более 200	Менее 5



При этом эффекты воздействия делят на острые и хронические. Их обозначают как острое и хроническое токсическое действие или как острую и хроническую токсичность (ОТД и ХТД). Эти термины и используют для выражения результатов биотестирования.

Острое токсическое действие - воздействие, вызывающее быструю ответную реакцию тест-объекта. Его чаще всего измеряют по тест-реакции «выживаемость» за относительно короткий период времени.

Хроническое токсическое действие - воздействие, вызывающее ответную реакцию тест-объекта, проявляющуюся в течение относительно долгого периода времени. Измеряют по тест-реакциям: выживаемость, плодовитость, изменение роста и т.п.[9]

Реакция тест-объектов на токсическое воздействие зависит от интенсивности или продолжительности воздействия. По результатам биотестирования находят количественную зависимость между величиной воздействия и реакцией тест-объектов.

Реакция организмов на воздействие токсических химических веществ представляет собой комплекс взаимосвязанных эволюционно сформировавшихся реакций, направленных на сохранение постоянства внутренней среды организма и в конечном итоге на выживание.

Выявлены определенные закономерности реакций организмов на токсические воздействия. В общем виде воздействие токсического вещества на организм описывается двумя основными параметрами: концентрацией и временем воздействия (экспозицией). Именно эти параметры определяют степень влияния токсичного вещества на организм.

Экспозиция - период, в течение которого организм находится под воздействием исследуемого фактора, в частности химического вещества. В зависимости от экспозиции различают острое или хроническое токсическое воздействие. [11]

Результат токсического воздействия обычно называют эффектом токсического воздействия. Для описания зависимости между эффектом воздействия токсического вещества на организм и его концентрацией предложены различные функции, например, формула Хабера:

Е=С*Т,

где

Е - эффект (результат) воздействия;

С - концентрация воздействующего вещества;

Т - время воздействия (экспозиция).

Е - представляет собой любой результат воздействия (гибель тест-объектов), а величины С и Т - могут быть выражены в соответствующих единицах измерения.

Как видно из формулы Хабера, между эффектом временем воздействия концентрацией имеется прямая функциональная связь: эффект будет тем большим, чем больше величина воздействия (концентрация вещества) и/или его продолжительность.

Формула Хабера позволяет сравнивать биологические эффекты различных химических веществ с помощью анализа их концентрации или экспозиции. Отличия по какому-либо из этих величин отражают отличия в чувствительности организмов к токсическому воздействию.

При малых концентрациях или экспозициях эффект воздействия проявляется в популяции у небольшого числа тест-объектов, которые оказываются наиболее чувствительными, т.е. наименее устойчивыми к воздействию. По мере увеличения концентрации или экспозиции число устойчивых организмов падает, и в конце концов у всех (или почти у всех) организмов удается зарегистрировать четко выраженные эффекты токсического воздействия. В ходе токсикологического эксперимента находят зависимость отклика тест-объектов от величины или времени воздействия. [1]

Параметры токсичности химического воздействия:

- Летальная концентрация (ЛК50) - концентрация токсиканта, вызывающая гибель 50% тест-организмов за определенное время (чем ниже ЛК50, тем выше токсичность химического вещества или воды)

- Максимальная недействующая концентрация - наивысшая измеренная концентрация химического вещества (тестируемой воды), не вызывающая наблюдаемого химического воздействия (чем ниже МНК, тем выше токсичность химического вещества или сточной воды). [10]

Не все организмы одинаково реагируют на одно и то же воздействие. Реакция зависит от чувствительности к воздействию.

Чувствительность организма к токсичному веществу - это совокупность реакций на его воздействие, характеризующих степень и скорость реагирования организма. Характеризуется такими показателями, как время начала проявления отклика (реакции) или концентрация токсического вещества, при которой проявляется реакция; она существенно отличается не только у разных видов, но и у разных особей одного вида.

Согласно ряду чувствительности, разработанному С.А. Патиным (1988), тест объекты можно расположить следующим образом:

Рыбы-зоопланктон-зообентос-фитопланктон-бактерии-простейшие-макрофиты. Существуют и другие ряды чувствительности.

Например, при биотестировании вод целлюлозно-бумажных предприятий: водоросли-бактерии-рыбы (по уменьшению чувствительности).

Факторы, влияющие на биотестирование:

- факторы, влияющие на тест-организмы (экспозиция; условия культивирования, в природе - условия жизни растений и животных; возрастные особенности, сезон года, обеспечение тест-организмов пищей, температура (пессимум и оптимум), освещенность);

- факторы, определяющие физико-химические свойства тестируемой природной воды, от которых зависит ее токсичность для тест-организмов (свежесть пробы, наличие в ней взвешенных частиц).



3. Методы биотестирования на различных группах организмов для оценки качества природных вод

Для токсикологической оценки загрязнения пресноводных экосистем на основе биотестирования водной среды рекомендовано использовать несколько видов тест-объектов: водоросли, дафнии, цериодафний, бактерии, простейшие, коловратки, рыбы. [6]

Водоросли - основа пищевых цепей во всех природных экосистемах. Наиболее чувствительные организмы к широкой гамме химических веществ от детергентов до НФПР. Отмирание клеток, нарушение скорости роста, изменение процессов фотосинтеза и других метаболических процессов. Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Anabaena, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium.[4]

Бактерии - изменение скорости разложения (биодеградации) органических соединений/ Nitrosomonas, Nitrosobacter; изменение метаболических процессов в организме - Escherichia coli (оценка влияния токсиканта на сбраживание глюкозы).

Простейшие. Дафнии. ДДТ, (ГХЦГ)гексахлорциклогексан, ТЯЖЕЛЫЕ металлы (медь-цинк-кадмий-хром), биогенные элементы. Daphnia magna.

Коловратки

Рыбы. Гуппи (Poecillia reticulata) - металлы, пестициды; данио (Brachidanio rerio).

Рыбы природных вод. Высокочувствительные: - лососевые (форель), шиповка, пескарь, плотва, голец, судак, верховка; среднечувствительные: окунь, красноперка, лещь, гольян, карп, уклея.

Рассмотрим основные методики определения острого токсического действия вод при кратковременном биотестировании на ракообразных, водорослях и инфузориях; метод определения хронического токсического действия вод на водорослях.

Способы обработки и оценки результатов биотестирования основаны на стандартных и широко используемых в отечественной и международной практике методах статистической обработки экспериментальных данных.

Таблица 3.1. Методы биотестирования, рекомендуемые для государственного экологического контроля

Метод биотестирования	Тест-организм	Критерий токсичности	Область применения
		острой	хронической
1	2	3	4	5
По жизнедеятельности дафний	Daphnia magna Sr	Смертность 50 % особей за 96 ч	Достоверное снижение плодовитости за 30 сут в сравнении с контролем	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые, питьевые воды
По жизнедеятельности цериодафний	Ceriodaphnia affinis	Смертность 50 % особей за 48 ч	Достоверное снижение плодовитости за 7 сут в сравнении с контролем	То же
По ферментативной активности бактерий	Лиофилизированные мутантные бактерии Escherichia coli	Изменение интенсивности окрашивания исследуемой среды	-	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые воды, водные вытяжки из почв, донных осадков
По ингибированию роста водорослей	Chlorella vulgaris, Scehedesmus guodricauda	Изменение численности водорослей за 96 ч экспозиции	Изменение численности водорослей за 14 сут	Поверхностные, природные пресные сточные и очищенные сточные воды
По жизнедеятельности рыб	Poecilia reticulate Peters или Brachydanio rerio Hamilton Buchaha	Смертность 50 % особей за 96 ч	Достоверное снижение плодовитости за 30 сут экспозиции	То же
По хемотоксической реакции инфузорий	Paramecium candatum	хемотоксическая реакция	-	Поверхностные, природные пресные, сточные и очищенные сточные, грунтовые воды, водные вытяжки из почв, донных осадков

Прежде чем проводить эксперименты по биотестированию, нужно вырастить культуру тест-организмов.

Последовательно далее рассмотрим особенности выращивания культур тест-организмов и проверки их пригодности для использования в биотестировании.

3.1 Биотестирование на ракообразных

Методика предназначена для определения острой токсичности природной и сточной воды, сбрасываемой в водоемы.

Принципы культивирования рачков Daphnia magna Straus и Ceriodaphnia affinis Lilljeborg

Период созревания Daphnia magna до вымета молоди при оптимальной температуре и хорошем питании занимает 5-10 суток. Продолжительность жизни 110-150 суток, при температурах свыше 25 °С она может сокращаться до 25 суток.

Рис.3.1. Строение Daphnia magna



При оптимальных условиях содержания партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 суток. У молодых дафний число яиц в кладке 10-15, затем оно возрастает до 30-40 и более, снижаясь до 3-8 и до 0 за 2-3 суток до смерти.

Культуру дафний выращивают в термостатируемом при 18-22 °С люминостате (освещенность 400-600 люкс, продолжительность светового дня 12-14 часов). Опыты по биотестированию вод желательно проводить в том же люминостате.

Для получения исходного материала для биотестирования 30-40 самок с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за 1 сутки до биотестирования пересаживают в емкости объемом 0,5-2 л. После появления молоди их отделяют от взрослых особей с помощью капроновых сит с разным диаметром пор.

Принципы культивирования цериодафний аналогичны описанным для дафний. Следует помнить, что цериодафнии более требовательны к содержанию кислорода в воде (не менее 5 мг/л), оптимальная температура культивирования 23-27°С. Период созревания рачков от рождения до момента вымета молоди короче, чем у дафний - от 4 до 5 суток.

При биотестировании важно учитывать следующие моменты:

- Молодь рачков в 4-5 раз более чувствительна к действию токсикантов, чем взрослые особи.

- Кормление рачков во время острого опыта уменьшает токсичность примерно в 4 раза.

- В мягкой воде токсичность веществ повышается. Ионы магния обычно уменьшают токсичность солей, ионы кальция - снижают токсичность.

- Присутствие комплексообразующих веществ (гуминовые кислоты, аминокислоты и т.п.) увеличивает накопление токсикантов, но снижает их токсичность.

- Дефицит кислорода в воде ускоряет накопление токсических веществ в водной среде.

- Солнечный свет увеличивает токсичность в основном за счет возрастания количества свободных радикалов.

Определение устойчивости Daphnia Magna Straus к бихромату калия

Прежде всего необходимо оценить пригодность лабораторной культуры дафний для последующего биотестирования вод. Эталонным токсикантом служит бихромат калия.

Стакан емкостью 100-250 мл (21 штука).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке). Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3 л. Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.), на 1000 мл (1 шт.).

210 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Приготовить 100 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 (1000 мг/л).

Для этого 0,1 г просушенного К2Сr2О7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Расставить 21 стакан с надписями по следующей схеме:

К1 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

К2 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

КЗ 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

Посадка рачков

Во все стаканы с растворами посадить по 10 рачков в возрасте строго 4-24 часа. Посадку производить с помощью микропипеток со съемными пластиковыми наконечниками. Концы наконечников предварительно необходимо обрезать под величину дафнии одно-двухдневки.

Эксперимент

Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят. Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%. Результаты заносят в протокол опыта.

Определение токсичности сточной (природной) воды на Daphnia magna.

Материалы.

Стаканы емкостью 150-250 мл (8-16 штук).

Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 3 л.

Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), 1 л (1 шт.).

Мерный цилиндр или мерный стакан на 150-200 мл.

От 40 до 80 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта.

Расставить 16 стаканов с надписями по следующей схеме:

К1 Ст.вода б/р N 1 Ст.вода 1:10 N 5 Ст.вода 1:100 N 9

К2 Ст.вода б/р N 2 Ст.вода 1:10 N 6 Ст.вода 1:100 N 10

КЗ Ст.вода б/р N 3 Ст.вода 1:10 N 7 Ст.вода 1:100 N 11

К4 Ст.вода б/р N 4 Ст.вода 1:10 N 8 Ст.вода 1:100 N 12

Разлить по стаканам контрольную (разбавляющая вода) и испытуемую воду (ст.вода) по 150 мл на стакан:

К1-К4 - 600 мл разбавляющей воды (РВ),

Ст.вода б/р (без разбавления) - 600 мл (4 х 150 мл).

Ст.вода 1:10 - 100 мл Ст.воды б/р + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:10.

Ст.вода 1:100 - 100 мл Ст.воды 1:10 + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:100

Стаканы с растворами расставить в люминостате.

В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам.

Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.

Посадка рачков.

Во все стаканы посадить по 5 рачков в возрасте строго 4-24 часа.

Эксперимент.

Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48, 72, 96 часов (окончание определения острой токсичности). Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%.

Результаты заносят в протокол опыта.

Биотестирование прекращают, если в любой период времени в опыте гибнет 50% и более особей.

Если А >= 50%, то тестируемая вода (опыт) остротоксична.

Если А < 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.

Для более точного определения острой токсичности строят график, где по оси абсцисс (ось X) откладывают время в часах, а по оси ординат (ось Y) смертность в процентах к контролю (А). Из графика находят ЛТ50 - время, в течении которого погибает 50% дафний.

3.2 Биотестирование с использованием водорослей

Методика предназначена для определения токсичности природных и сточных вод.

Общие принципы культивирования микроводорослей

Эффективное культивирование одноклеточных зеленых водорослей в лаборатории определяется в основном наличием минеральных элементов в питательной среде, достаточно интенсивным освещением (2000-3000 люкс) и определенной температурой (18-20 °С).

Лучшей средой для выращивания зеленых водорослей для токсикологических является питательная среда Успенского N 1, которая содержит более низкую общую концентрацию солей.

Все манипуляции со средой Успенского N 1 при работе с водорослью Scenedesmus проводятся при строгом соблюдении условий стерильности.

Недопустимым является совместное культивирование данной водоросли с хлореллой в одном люминостате (хлорелла быстро засоряет и подавляет культуру сценедесмус).

Продолжительность опытов по выявлению токсичности вод может быть 4, 7, 14 и более дней в зависимости от поставленных задач. Максимальное накопление токсиканта в клетках водорослей отмечается, обычно, к исходу 3-4 суток, поэтому чаще всего определение острой токсичности ограничивают 4 сутками.

Рис. 3.2. Водоросли Scenedesmus quadricauda.

Если в результате биотестирования на острую токсичность выявлена достоверная стимуляция роста водорослей, то для окончательного суждения о токсичности пробы необходимо ставить хронический эксперимент (до 14 суток).

Достоверная стимуляция роста водорослей свидетельствует о наличии эвтрофирующего загрязнения, а достоверное угнетение роста водорослей - о наличии токсического загрязнения.

Подготовка культуры.

В опыте использовать 5-10 суточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста.

Перед посевом культуру сгущают одним из трех способов: - отстаиванием 2-3 дня, центрифугированием, фильтрованием через мембранный фильтр N 4 или фильтровальную бумагу с синей лентой. Полученная суспензия (концентрат) клеток используется для последующего посева.

Посев.

Производится в большую опытную колбу емкостью 1,5 л, в случае биотестирования в колбах (по 100 мл) или в колбу емкостью 150 мл при биотестировании в пенициллиновых пузырьках (по 10 мл). Обычно требуется примерно 30 мкл суспензии на 30 мл воды.

Рис. 3.3. Посев культуры.

В опытных колбах после посева должно быть около 200-300 тысяч клеток водорослей в 1 мл (не более 500 тысяч/мл) - едва заметное зеленоватое окрашивание на белом фоне.

Разлив.

Из большой колбы произвести разлив культуры по колбам (3 повторности по 100 мл) или пенициллиновым пузырькам (3 повторности по 10 мл).

Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры к бихромату калия.

Подсчет производят с помощью микроскопа (например, типа "Биолам") при 80-100 кратном увеличении.

Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или Фукс-Розенталя. Камеру и относящееся к ней покровное стекло обезжиривают, покровным стеклом накрывают камеру и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы пипеткой наносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 квадратов по диагонали или все поле камеры в случае малой численности водорослей (при одном заполнении камеры просчитывают не менее 50 клеток).

Из каждой колбы просматривают не менее трех проб.

Оценка токсического действия химического соединения или тестируемой воды делается на основании достоверности различий между показателями численности клеток водорослей в контроле и в опыте.

При этом вычисляют:

а) средние арифметические величины численности клеток - Xi и X (из двух и шести подсчетов, соответственно).

б) численность клеток в процентах от контроля. Сумма (X - Xi)

в) среднее квадратичное отклонение (б):

,

где

n - количество повторностей; в данном случае n = 3;

в) ошибку среднего арифметического (X): ;

г) Td - критерий достоверности различий двух сравниваемых величин:

,

где

xk и xо - сравниваемые средние величины (в контроле и опыте),

Sk - So - квадраты ошибок средних в контроле и опыте.

Td рассчитывают на каждые сутки и сравнивают с табличной величиной Tst - стандартным значением критерия Стьюдента.

Принимают уровень значимости Р = 0,05 и степень свободы (n1 + n2 - 2), т.е. (3 + 3 - 2) = 4.

Tst при степени свободы 4 равно 2,78.

Если Td больше или равно Tst, то различие между контролем и опытом достоверно - тестируемая вода загрязнена (токсическое или эвтрофирующее загрязнение)

Если Td меньше Tst, то различие между контролем и опытом не достоверно - тестируемая вода не загрязнена.

Для расчетов Td можно использовать калькуляторы типа МК-51 и МК-71, а также компьютерные электронные таблицы (например, программу "Сигма" ЦСИАК), что значительно ускоряет работу.

Для графического представления результатов биотестирования по оси абсцисс откладывают время в сутках, а по оси ординат либо число клеток водорослей в 1 мл, либо число клеток водорослей в процентах от контроля.

Определение устойчивости Scenedesmus quadricauda к действию бихромата калия.

Добавить последовательно в 30 мл дистиллированной воды (контроль) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КН2РО4, 30 мкл К2СО3.

Хронический опыт (в пузырьках).

На 7-е сутки биотестирования проводят смену контрольной и тестируемой воды в стерильных условиях. При этом в новую партию пузырьков наливают по 7,5 мл контрольной и тестируемой воды. Затем в пузырьки добавляют по 0,01 мл (10 мкл) каждого из 5 маточных растворов солей и по 2,5 мл старой культуры из пузырьков, в которых проводилось биотестирование в остром опыте. Подсчет численности клеток проводят на 7-е, 10-е и 14-е сутки.

На практике бывает удобно использовать таблицу оценки результатов биотестирования по 5-бальной шкале.

Необходимо помнить, что увеличение биомассы водорослей может быть связано с наличием эвтрофирующих загрязнений в испытуемой воде, в этом случае о наличии токсического эффекта можно судить после испытания на нескольких тест-объектах.

3.3 Биотестирование на инфузориях

В основу метода положен один из вариантов определения острой токсичности воды по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum.

Используется:

- для определения токсичности сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения, что позволяет проводить технологическую корректировку режима подготовки и очистки сточных вод;

- для определения токсичности локальных потоков сточных вод, что позволяет выяснять их взаимодействие, определять вклад каждого потока в токсичность сточных вод отдельного предприятия, суммарную токсичность сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения;

- для определения токсичности водных растворов отдельных веществ и их смеси.

Принцип методики.

Методика определения острой летальной токсичности сточной воды по выживаемости инфузорий основана на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в тестируемой воде. Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвиживание 50% и более особей в течение 1 часа в тестируемой воде по сравнению с их исходным количеством.

Тестовый организм.

В качестве тест-объекта используют лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретенообразной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой).

Paramecium caudatum - массовый вид в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. В сточной воде является часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб. Простейшие, в том числе ресничные инфузории, составляют основную часть микрофауны активного ила. Они участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способствуя тем самым повышению эффективности очистки.

Выделение и культивирование.

Выделение из активного ила. Наиболее подвижную и крупную особь отлавливают из пробы активного ила очистных сооружений и переносят в микроаквариум со стерильной водопроводной водой.

Путем последовательного переноса этой особи из лунки в лунку добиваются отделения ее от других простейших и цист. Затем помещают отмытую инфузорию в пробирку со средой культивирования.

Через 7-8 суток из полученной таким образом монокультуры одну наиболее крупную и подвижную особь вновь переносят в свежую среду.

Спустя 8-10 суток культуру можно использовать для определения токсичности. биологический тестирование природный токсичность

Культивирование инфузорий на молоке. Культуру парамеций выращивают на дехлорированной водопроводной воде, которую добавляют разбавленное в 20 раз такой же водой пастеризованное молоко. Пересевают культуру инфузорий один раз в месяц (при необходимости один раз в три недели).

Материалы и оборудование.

Подсчет Paramecium caudatum производят с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9, МБС-10 или иного, обеспечивающего 8-24 кратное увеличение. Для разбавления и внесения одинакового количества исследуемой пробы используют стандартные стеклянные пипетки.

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора, при невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4°С).

Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов.

В качестве контрольной используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессора в течение 7 суток.

Для определения токсичности отдельных веществ или их смеси из них готовят растворы путем добавления определенных количеств маточного раствора, исследуемого(ых) вещества(в) в водопроводную дехлорированную воду. Маточные растворы готовят на дистиллированной воде.

При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре культуры.

При наличии в пробе крупнодисперсных взвесей необходима фильтрация.

При проведении биотестирования значения рН тестируемых растворов должно находиться в интервале от 6,5 до 7,6.

Биотестирование проводят в помещении, не содержащем вредных паров и газов, при рассеянном свете и температуре воздуха 18-28°С.

Проведение биотестирования.

Для биотестирования неразбавленной сточной воды или ее разбавлений, а также растворов отдельных токсических веществ (смеси веществ) используют микроаквариум с лунками, который помещают на предметный столик стереомикроскопа.



Рис. 3.4. Культура инфузорий.

Одну из лунок заполняют культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки.

В свободные лунки капиллярной пипеткой рассаживают по 10-12 особей в каждую лунку, так чтобы на одну пробу тестируемой воды приходилось не менее 30 инфузорий в трех лунках (трехкратная повторность).

При посадке тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно превышать 0,02 мл.

Три лунки используют в качестве контрольных.

После посадки инфузорий наливают в контрольные лунки по 0,3 мл дехлорированной водопроводной воды, в опытные - по 0,3 мл пробы тестируемой воды. Отмечают время начала биотестирования и подсчитывают под микроскопом количество особей в каждой лунке.

Микроаквариум с заполненными лунками помещают в чашку Петри, на дно которой кладут фильтровальную бумагу, смоченную водой, чтобы не испарялось содержимое лунок, и выдерживают в течение 1 часа при температуре 22-24°С. По истечении этого времени производят подсчет выживших особей под микроскопом. Выжившими считаются инфузории, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим. Результаты подсчета записывают в рабочий журнал.

Результаты биотестирования считаются правильными и учитываются, если гибель инфузорий в контрольных лунках не превышала 10%.

После подсчета особей в каждой из трех лунок находят среднее арифметическое количество инфузорий, выживших в тестируемой воде.

Тестируемую воду оценивают как оказывающую острое летальное действие, если в течение 1 ч в ней гибнет 50% и более инфузорий.

При определении острой летальной токсичности разбавлений пробы сточной воды или водного раствора отдельного вещества (смеси) устанавливают среднюю летальную кратность разбавлений (среднюю летальную концентрацию), вызывающую гибель 50% тест-объектов в течение 1 часа - ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч).

Для построения графика с целью расчета ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч) тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавления (концентрацию) - в логарифмических величинах.

На оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций кратности разбавлений сточной воды (концентраций вещества), на оси ординат величины тест-параметра в пробитах. Полученные точки соединяют прямой.

Из точки на оси ординат, соответствующей 50% гибели тест-объекта, проводят линию, параллельную оси абсцисс до пересечения с линией графика.

Из точки их пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят логарифмы ЛКР50 - 1 ч.

Величину найденного логарифма переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/л вещества).

Результаты биотестирования представляют в виде протокола.

После проведения биотестирования микроаквариумы промывают водой (температура не выше 40°С), протирают ваткой, смоченной в спирте, промывают дистиллированной водой.

Оценка токсичности воды с использованием биотеста на водорослях.

По формуле рассчитаем коэффициент прироста численности водорослей за 96 ч (4 сут).



M= [m/(nV)]103,

где

M - численность клеток водорослей, тыс.кл./мл;

m - число подсчитанных клеток;

n - число просчитанных маленьких квадратов камеры;

V - объем части камеры, соответствующей площади маленького квадрата, мл.[3]

3.4 Оценка токсичности воды с использованием экспресс-биотеста на коловратках

Для определения возможного острого токсического действия исследуемой воды проводим экспрессное биотестирование на массовой культуре коловраток.

Для оценки токсического действия исследуемой воды используем средние данные о СОС (показатель скорости осветления среды).

биотестирование вода токсичность калий

СОС =[(C0 - Ct)/(C0Nt)]V,

где

СОС - показатель скорости осветления среды, мкл/(экз.. мин);

C0 и Ct - число клеток водорослей в одном большом квадрате камеры Горяева в начале и конце биотестирования соответственно;

N - число коловраток в микроаквариуме;

t - время биотестирования, мин;

V - объем воды в микроакварему, мкл.[2]



4. Опыт практического использования биотестирования (биомониторинга) в ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга»

Системы биомониторинга качества воды есть на всех водопроводных станциях города и ближайших пригородов. Их главная задача - следить за уровнем токсичности источника питьевого водоснабжения Санкт-Петербурга - невской воды.

В ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга» для проведения биомониторинга используются раки (невские и австралийские) и улитки. Это - животные-биоиндикаторы. Системы биомониторинга, применяемые в Водоканале, разработаны учеными Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности Российской академии наук.

Состояние воды в Неве контролируют речные раки.

Раки применяются для биомониторинга на Водоканале с декабря 2005 года. Этот вид биомониторинга используется на всех водозаборных сооружениях города.

На Юго-Западных очистных сооружениях контролируют качество очистки сточных вод также при помощи раков: в зимнее время года - это речные раки, а летом - австралийские (более теплолюбивые).

А следить за составом дымовых газов, выходящих с завода по сжиганию осадка на Юго-Западных очистных сооружениях, помогают улитки.

Все животные-биоиндикаторы не подменяют собой методы приборного и лабораторного контроля, а дополняют их. [13]

4.1 Биотестирование природных вод на Невском раке

Вода из Невы, прежде чем попасть на очистные сооружения и стать водопроводной, контролируется, помимо лабораторий, при помощи Невских раков.

Технологам необходимо знать, не поступает ли на очистные сооружения вода, загрязненная такими токсическими веществами и в таких концентрациях, которые не могут быть удалены из воды с помощью имеющихся технологий и оборудования.

Существующие физико-химические методы анализа по экономическим причинам могут обеспечивать контроль только ограниченного числа загрязняющих воду веществ и требуют времени, а технологам важно получить сигнал о поступлении на водозабор подобной воды как можно раньше.

Оперативно, в реальном времени, получить информацию об опасности можно только при использовании методов биомониторинга живыми водными организмами, в частности, раки, которые очень чувствительны к загрязнениям среды их обитания.

Процесс биомониторинга.

К панцирю рака, сидящего в аквариуме, приклеивается волоконно-оптический датчик, который позволяет незаметно для животного в течение длительного времени регистрировать его сердцебиение. На экран компьютера диспетчера смены непрерывно выводятся уже обработанные результаты показателей сердечного ритма и стресс-индекса раков в виде системы «светофор»: красный, желтый или зеленый световые сигналы.

Нормальный сердечный ритм ничем не обеспокоенного рака (соответствующий зеленому сигналу), колеблется, в зависимости от температуры воды от 30 до 60 ударов в минуту, а стресс-индекс обычно близок к нулю. В случае опасности частота сердечных сокращений резко повышается не менее чем на 50%, а стресс-индекс возрастает до нескольких тысяч.



Рис. 4.1. Узкопалый речной рак Astacus leptodactylus.

При попадании в воду токсичных веществ раки реагируют в течение 1,5-2 минут (это время с учетом обработки данных). Их кардиоритм учащается, приборы дают сигнал тревоги (красный сигнал на мониторе диспетчера смены), по которому автоматически отбираются пробы воды для последующего подробного лабораторного анализа воды химическими и биологическими методами, и оповещаются все службы водопроводной станции.

Особые требования

Раки реагируют и на раздражители, не связанные с загрязнением воды - например на шум включаемого оборудования. Чтобы отсечь ложные срабатывания системы, ученые создали специальную аналитическую станцию, которая измеряет ряд характеристик воды - щелочность, температуру, мутность, а также снабжена датчиками шума и вибрации. Если аппаратура зарегистрирует вибрацию, то сигнал опасности в диспетчерскую не поступит, потому что датчики фиксируют момент, когда учащение сердцебиения рака совпадает с шумовым эффектом, и отсекают его, как не связанного с токсикологической опасностью.

Раки достаточно хорошо изученные животные с точки зрения физиологии и токсикологии. Однако для того, чтобы попасть в состав группы мониторинга, раки проходят тщательное биохимическое и физиологическое обследование здоровья. Работают только самцы в возрасте 3-5 лет, три дня через шесть. Срок их службы составляет примерно год. Дело в том, что по своей физиологии раки должны зимовать, впадая в этот холодный период в состояние «спячки», а лишение их того, что придумано природой, естественно, ослабляет животное. А к дежурству допускаются только здоровые особи в хорошем функциональном состоянии.

В конце 2010 года система биомониторинга с использованием раков была усовершенствована. Если раньше на рабочую смену приходилось по два рака, то теперь их - шесть. Однако модернизация системы биомониторинга заключается не только в количественных изменениях. С момента запуска биомониторинга у ученых из Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности РАН появились новые разработки. И в 2010 году эти разработки Водоканал внедрил на водопроводных станциях. Модернизация системы биомониторинга включает новые алгоритмы обработки сигналов. Все это вместе - более совершенная система обработки данных, увеличение числа дежурящих раков - повышает надежность биомониторинга, дает новые возможности для оперативного управления системой водоподготовки.

Дополнительный контроль

Для получения более точной реакции на изменения качества воды наряду с раками используют рыбок. Видеокамера постоянно фиксирует их движение. Если рыбкам станет плохо, они перестанут двигаться и всплывут вверх брюшком или опустятся на дно. А если в это время забеспокоятся и раки, то специалисты начнут действовать. Такое дублирование только на пользу человеку.

В ближайшем будущем ученые планируют доукомплектовать существующие станции биомониторинга системой «маслс-монитор» (от английского mussel - двустворчатый морской моллюск мидия). Речные двустворчатые моллюски - тоже очень хорошие индикаторы качества воды, в которой они живут. В неблагоприятных условиях кроме увеличения кардиоритма они захлопывают створки своих раковин.



4.2 Биотестирование сточных вод при помощи Австралийских раков

Качество невской воды на водопроводных станциях «оценивают» другие раки - узкопалые. Оптимальная температура воды для этих раков не должна превышать 22-23оС. Так как летом температура сточной воды может достигать 26-30 оС, то для использования биоиндикаторов качества очищенных сточных вод на ЮЗОС необходимо было подобрать более теплолюбивый вид раков. С учетом ряда особенностей был выбран краснопалый рак Red Claw Cherax quadricarinatus (красноклешневый рак). Этот вид устойчив к температурному диапазону от 18 до 31оС. Экстремальные температурные границы выживания достаточно широки: от 10 до 36 оС.

Рис. 4.2. Австралийский краснопалый рак Red Claw Cherax quadricarinatus

Стоит заметить, что работа у австралийских раков - сезонная. Когда температура сточной воды понижается, их сменяют аборигенные для средней полосы России узкопалые раки - те, для которых прохладная вода - наиболее привычная среда обитания.

Австралийских раков с лета 2011 года на Юго-Западных очистных сооружениях (ЮЗОС) петербургского Водоканала для биотестирования сточных вод.

Шесть австралийских краснопалых раков Red Claw Cherax quadricarinatus (или красноклешневых раков) живут в аквариумах, через которые проходит очищенная сточная вода. По самочувствию и сердцебиению животных ученые и технологи следят за качеством очищенной на ЮЗОС воды перед тем, как ее выпустить в Невскую губу.

Биоэлектронная система контроля токсикологической безопасности очищенных сточных вод, сбрасываемых ЮЗОС - новая разработка петербургских ученых.

Если качество воды ухудшится, чувствительный рак это ощутит сразу - ученые заметят не только изменения в его поведении, но и получат сигнал от специального оптоволоконного датчика, прикрепленного к панцирю. Датчик в режиме реального времени снимает показания сердечной активности животного. Если одновременно у всех шести раков сердечный ритм резко повысится в 1,5-2 раза, загорится красный сигнал системы «светофор» в диспетчерской. При этом технологи очистных сооружений будут действовать по специальному регламенту - выяснять и устранять причины происшествия.

Качество очистки сточных вод ежедневно проверяют специальные приборы и лаборатория. Однако благодаря биоэлектронной системе контроля с помощью реакций животных можно учитывать синергизм одновременного воздействия многих факторов, которые влияют на воду - среду обитания раков. Например, один прибор измеряет содержание в сточной воде количество фосфатов, другой прибор фиксирует количество нитратов. Но только организм животного-биоиндикатора одновременно оценивает совокупность всех качественных характеристик воды, в которой он живет.

4.3 Биотестирование при помощи улиток

Задача улиток - «следить» за состоянием воздуха в районе завода по сжиганию осадка сточных вод на Юго-Западных очистных сооружениях (ЮЗОС).

Улитки дышат воздухом с примесью дыма, выходящего из трубы завода. К их раковинам прикреплены оптоволоконные датчики сердцебиения и поведения (двигательной активности), благодаря которым с помощью специального программного обеспечения система в автоматическом режиме оценивает функциональное состояние животных, то есть их «самочувствие».

Рис. 3.4. Улитка используемая для биотестирования.

Система очистки дыма на заводе по сжиганию осадка (ЗСО) на Юго-Западных очистных сооружениях - самая современная. Она полностью удовлетворяет требованиям российских нормативных документов, а также Директиве Европейской комиссии, которая регламентирует условия сжигания и требования к выбросам загрязняющих веществ в атмосферный воздух от установок сжигания отходов. За продуктами горения на ЗСО следит специальный аналитический блок. Предусмотрена многократная система защиты, и в случае чрезвычайной ситуации залповый выброс обязательно зафиксирует современная аппаратура.

Однако в воздухе в мизерных дозах могут находиться соединения - продукты сжигания. На каждый из них делать специальные датчики нерентабельно, к тому же концентрация соединений настолько низкая, что не всякий прибор способен их уловить. Для контроля хронической токсичности воздуха ученые Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности РАН предложили использовать моллюсков.

В качестве интегрирующего индикатора на все, что имеет универсальную токсичность по отношению к животным, были выбраны улитки, которые имеют легкие и, как и люди дышат воздухом. К тому же у них есть раковина, к которой можно прикреплять датчики, не влияя на процесс их жизнедеятельности. Большой плюс заключается и в том, что эти животные в меру подвижны.

В течение первого года эксплуатации системы специалисты будут наблюдать за шестью улитками - пока три из них действительно получают воздух, смешанный с тем, который выходит из трубы завода, а еще три дышат обычным. Это нужно для того, чтобы сравнить поведение и показатели сердцебиения улиток из двух групп.

Отличия от системы биомониторинга качества воды с помощью речных раков.

Раки реагируют на резкое изменение условий в среде обитания, а созданная на основе улиток система непрерывного контроля степени загрязненности воздуха на границе санитарно-защитной зоны завода может реагировать не только на резкие и значительные изменения, происходящие в воздухе. Она также может контролировать накопление возможного негативного влияния на здоровье «индикаторной» группы моллюсков, связанного с хроническим токсическим воздействием загрязняющих веществ, выбрасываемых с дымовыми газами, - даже при относительно низких концентрациях таких веществ. То есть постепенное накопление вредных веществ в организме животных от того, что они дышат загрязненным воздухом, скажется на самочувствии улиток.

Отличительная особенность данной системы контроля - возможность выявления так называемых синергических эффектов, при которых суммарное негативное влияние загрязнителей на здоровье биологических существ может значительно превышать сумму негативного воздействия отдельных загрязняющих веществ. Система контроля лишь физико-химических характеристик воздушной среды этот эффект учитывать не в состоянии.

Процесс биотестирования.

Улитка сидит на мячике, который плавает на поверхности воды. К раковине животного прикреплены датчики, фиксирующие сердцебиение и двигательную активность. Все улитки находятся в открытой емкости (коробке), куда подается смесь воздуха и очищенного дыма ЗСО. Важно заметить, что улитки не живут непосредственно в трубе, где дышат ее «выхлопами» - для них дым разбавляется от 1000 до 10 000 раз чистым воздухом. Так достигается примерно та концентрация, которая имеет место на границе санитарно-защитной зоны завода.

Разработанная учеными Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности РАН (НИЦЭБ РАН) биоэлектронная система в автоматическом режиме следит за функциональным состоянием улиток, главным образом - за режимом сердцебиения и подвижностью в рамках суточного цикла. Наблюдение за сердцебиением ведется при помощи фотоплетизмограммы, т.е. оптическим способом наблюдается динамика рассеяния света, которая меняется в такт с биением сердца. Наблюдение за подвижностью заключается и в изучении текущей подвижности, и в создании специальных условий. В определенное время суток на один-три часа отключается режим увлажнения и включаются вентиляторы, которые прогоняют через систему сухой воздух.

У улиток во время режима «проветривания» следят за ЧСС и механикой опускания и поднимания раковины. Если со временем все улитки станут хуже себя чувствовать - а это будет понятно по измерениям (иные показатели ЧСС и двигательной активности) - система в автоматическом режиме обнаружит это, после чего специалисты станут выяснять причины.



Заключение

1. Рассмотрены принцы и методики биотестирования на ракообразных Daphnia magna Straus, водорослях Scenedesmus quadricauda и инфузориях Paramecium caudatum.

2. Изучены показатели токсичности природных вод и параметры токсичности химического воздействия

3. Показаны процессы практического применения биотестирования природных вод с помощью невских и австралийских раков.

Биологический мониторинг качества воды является составной частью экологического мониторинга - слежение за состоянием окружающей среды по физическим и биологическим показателям.

В задачи биологического мониторинга входит регулярно проводимая оценка качества окружающей среды с помощью специально выбранных для этой цели живых объектов. Лучше других отработана система биологического мониторинга водной среды.

Для большинства методов требуются квалифицированные специалисты в определении видов живых организмов.

Изучение состояния интересующей нас проблемы показало, что в настоящее время метод биологического мониторинга качества воды эффективно используется в разных странах, в том числе и в России в ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга».

Однако, биологический мониторинга качества воды не имеет общепризнанной системы биологического анализа и нет единых требований, которым он должен. Данный метод используется в качестве дополнительно для получения более надежного результата.



Список литературы

1. Новиков Ю.Ю., Ласточкина К.С., Болдина З.Н. Методы исследования качества воды водоемов. - М.: Медицина, 1990.- с. 400

2. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества: Санитарные правила и нормы (СанПиН 2.1.4.1074-01). - М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 2002 - с. 62

3. Мазур И.И., Молдаванов О.И., Шишов В.Н. Инженерная экология Общий курс: В 2 т. Т.1. Теоретические основы инженерной экологии: Учеб. Пособие для вузов/ Под ред. И.И. Мазура. -- М.: Высш. шк., 1996.- с. 637

4. Горбачев Е.А. Применение системы тестов для определения качества питьевой воды на городских микротерриториях. / Е.А.Горбачев, О.М.Гречканёв // Н.Новгород. Тезисы докладов на научно-промышленном форуме «Великие реки-2011», - ННГАСУ, 2011.- с.456

5. Васильев А.Л. Биологическаяпредочистка в технологиях водоподготовки для питьевых целей: Монография. / А.Л. Васильев, Л.А. Васильев, ,И.В.Бокова// Н.Новгород. ННГАСУ-2011.- с.118

6. Кинебас А. К., Нефедова Е. Д., Гвоздев В. А., Холодкевич С. В., Иванов А. В., Куракин А. С., Корниенко Е. Л. Повышение эффективности и надежности биоэлектронных систем станций производственного биологического мониторинга качества воды. //Водоснабжение и санитарная техника. 2012. №1

7. Никаноров А.М., Хоружая Т.А., Бражникова Л.В., Жулидов А.В. Мониторинг качества вод: оценка токсичности. - С-Пб.: Гидрометеоиздат, 2000, С. 16-39.

8. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / под ред. Р. Шуберта. - М.: Мир, 1988. - с.348

9. Брагинский Л.П. Биологические тесты как метод индикации токсичности водной среды // Проблемы аналитической химии. М., 1977. Т. 5. с. 27

10. Рябухина Е.В., Зарубин С.Л. Биотестирование. Биологические методы определения токсичности водной среды. - Ярославль: ЯрГу 2006, с.22

11. Жмур Н.С. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности к изменению плодовитости цериодафни// Н.С. Жмур - АКВАРОС, 20001. - с.52