Размещено на http://www.allbest.ru/

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ ТЕПЛОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В ГЕПАТОЦИТАХ ЖИВОТНЫХ С РАЗЛИЧНОЙ СИСТЕМОЙ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СПЕЦИАЛИЗАЦИИ

Антонова Е.И., Мкртчан О.З., Белецкая Е.Я.,

Регер Е.Н, Щербаков Д.

Эволюционные преобразования тканей у животных в сравнительном ряду позвоночных происходят параллельно, при дивергентном развитии организмов с изменением функционально-аналогичных тканей в одном, для всех групп животных, направлении [3]. Печень, являясь полифункциональным органом, выявляет особенности филогенетического развития - по пути функциональной аналогии. Одной из главных функций является функция детоксикации, другие проявляются в той или иной степени выраженности, что определяется уровнем организации организма, средой обитания, системой терморегуляции и степенью перераспределения функциональной нагруженности органов в системе организма. Межвидовые различия в клеточной теплоустойчивости находятся в соответствии с различиями в температуре обитания видов [2]. Причина неослабевающего интереса к этому органу заключается в его полифункциональности и формировании сложных структурно - метаболических реакций, что обеспечивает выживаемость биологических систем при действии различных эндогенных и экзогенных повреждающих факторов [1, 14, 16]. Среди экстремальных абиотических факторов особое место принадлежит гипертермии. Общее перегревание организма происходит в естественных, производственных и экспериментальных условиях; этот фактор вот уже на протяжении 20 лет используется в комплексной терапии для стабилизации очага трансформированных клеток [15]. В связи с этим целью нашего исследования является выявить характерные для исследуемых видов млекопитающих и рыб изменения в ультраструктуре гепатоцитов после воздействия гипертермии, определяемые эволюционным положением и экологической специализацией.

Эксперимент поставлен на двух группах животных: млекопитающие - вид Muridae Rattus norvegicus (половозрелые беспородные крысы самцы 2 месяцев постнатального развития); рыбы вид - Carassiuus aurata gibelio (двухлетки - 2+). В эксперименте участвовало по 30 особей в каждой группе (15 служили контролем). Термальное воздействие на организм крыс проводили в воздуховентилируемой камере в течение 20-30 минут с термостатированием температуры 42єС. Перегревание рыб проводили в принудительном статичном терморежиме в условиях свободного плавания в термоградиентном лотке с дополнительной аэрацией [7]. Осцилляция температуры осуществлялась в диапазоне 32°С, в течение 20 минут. Животных взвешивали индивидуально на электронных весах WA33 в начале и конце опытов. Ректальную температуру измеряли с помощью электротермометра ТЭП-16. Декапитацию проводили через час после воздействия. Температурное воздействие, применяемые в эксперименте, на 1-2°С выходят за пределы биологического оптимума изучаемых видов животных, в связи с чем моделировался тепловой шок средней тяжести.

Материалы и методы исследования:

Для морфологических исследований образцы печени фиксировали погружением в 4% растворе параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%). Для проведения электронномикроскопического исследования материал дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 2 часов и плоскопараллельно заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе "Hitachi-600H”. Определение объемной плотности, поверхностной плотности и численной плотности изучаемых структур проводили на сканированных электроннограммах с использованием программы UTHSCSA ImageTool 3.0. Количественные параметры оценивалась на единицу площади (100 мкм²) паренхимы печени. Статистическую обработку полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ ”STATISTICA-5" [10]. Различия между независимыми выборками определяли с помощью критерия Манн-Уитни (U) Р?0,05.

Собственные данные:

гипертермия гепатоцит млекопитающее рыба

Рыбы. Ультраструктурная организация гепатоцитов различных видов рыб обусловлена положением в зоолого-таксономической, эколого-физиологической классификации, а так же типом питания [9]. Карась вида Carassiuus aurata gibelio относится к растительноядным эврибионтам, в связи с чем имеет высокую степень адаптации к различным температурным режимам, кислородному градиенту воды.

После перегревания просветляется цитоплазматический матрикс гепатоцитов. Что отражает нарушение белкового синтеза, проникновение в цитоплазму воды, в следствие увеличения проницаемости плазматической мембраны. В ядре увеличивается объемная плотность гетерохроматина (0,02±0,008 и 0,08±0,02 мкм³/мкм³ соответственно). В процессе конденсации хроматин в ядре занимает маргинальное расположение в виде глыбок различных размеров, что отражает активацию процессов гликолиза и инактивацию транскрипционно активных участков ДНК. В то же время активируются процессы глюконеогенеза, что отражается в увеличении объемной плотности гликогена в цитоплазме гепатоцитов с 0,03±0,008 до 0,09±0,004 мкм³/мкм³. Конденсирование нитей хроматина может быть вызвано повышенной активностью ДНК-азы и лизосомальных катепсинов. Это, в свою очередь, проявляется в увеличении объемной плотности гетерохроматина. Меняется форма ядра, перинуклеарное пространство расширяется.

После перегревания нарушается структура митохондрий, что проявляется в различной их реакции на действие гипертермии. Часть митохондрий проявляет признаки набухания, просветления матрикса, с увеличением объемной (0,1±0,07 и 0,4±0,04 мкм³/мкм³ соответственно) и поверхностной плотности (3,8±0,3 и 5,6±0,8 мкм² /мкм³ соответственно). Что может быть обусловлено усилением обменных процессов в печени в связи с повышенным функциональным запросом который, предъявляется к печени в условиях теплового стресса как к основному метаболическому центру организма. Другая часть митохондрий проявляет конденсированную конфигурацию - матрикс уплотнен, кристы расширены, что указывает на нарушение отвода электронов от митохондрий для использования во внутриклеточном метаболизме. Снижается численная плотность митохондрий с 5,9±1,2 до 3,0±0,9 мкм⁰/мкм³. Набухание митохондрий - это один из признаков разобщения процессов окисления и фосфорилирования, вызванного гипоксией, которая, в свою очередь, опосредована действием гипертермии. После действия термального стресса снижается количество митохондрий, находящихся в тесном топографическом контакте с каналами ГЭС, что отражает снижение белковосинтетической деятельности гепатоцитов. После перегревания уменьшается число стопок ГЭС, который разбивается на везикулы, отдельные полости, радиально расходящиеся от ядра. Наблюдается процесс сужения полостей ГЭС и потеря прикрепленных к мембране рибосом. Снижается объемная плотность АЭС - 0,2±0,06 и 0,04±0,03 мкм³/мкм³ соответственно. В цитоплазме отмечено снижение объемной плотности лизосом с 0,03±0,01 до 0,01±0,004 мкм³/мкм³ и увеличивается объемная плотность гликогена с 0,03±0,008 до 0,09±0,004 мкм³/ мкм³.

Млекопитающие. После перегревания цитоплазма гепатоцитов уплотнена. Мощный пакет гранулярного эндоплазматического ретикулума тесно ассоциирован с ядром. Его каналы удлинены, их четкообразное расширение может демонстрировать активацию синтеза белка. Гиперплазия удлиненных каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума в гепатоцитах может быть следствием влияния повышенного уровня БТШ [17] в результате свободнорадикального повреждения эндотелия синусоидальной выстилки. Увеличивается объемная плотность ГЭС с 0,2±0,07 в контроле до 0,4±0,07 мкм³/мкм³ в эксперименте. В расширенных диктиосомах и вакуолях комплекса Гольджи выявляются липопротеиновые частицы, вероятно, ввиду задержки их транспорта. Митохондрии проявляют тесный топографический контакт с липидными каплями. Матрикс митохондрий уплотнен, в отличие от рыб, снижается объемная (0,3±0,07 и 0,2±0,03 мкм³ /мкм³ в эксперименте) и поверхностная (8,2±1,4 в контроле и 6,3±0,3 мкм² /мкм³ после перегревания) плотность митохондрий. Со стороны АЭС выявляется гиперплазия каналов в перинуклеарной зоне гепатоцитов с повреждением мембран и возникновением очага гидратации. Увеличивается объемная плотность гетерохроматина в ядре с 0,2±0,05 до 0,3±0,02 мкм³/мкм³ и снижается объемная плотность ядрышка (0,2±0,02 и 0,1±0,0 мкм³/мкм³ соответственно), что характеризует затухание матричных синтезов. Перестройка гетерохроматина осуществляется в соответствии с потребностями синтеза РНК и белка, обеспечивая согласование уровней транскрипции и трансляции. Изменение структуры хроматина и ядерного матрикса как следствие повреждения ДНК, включая разрывы и модификации оснований после гипертермии - физиологического агента, вызывающего стресс [13], в свою очередь, могут быть эндогенными индукторами апоптоза. Выявляется почкование липидных капель в цитоплазме как признак начала жировой дистрофии в отдельных гепатоцитах. Увеличивается объемная плотность лизосом (0,02±0,001 и 0,03±0,0мкм³/мкм³ соответственно), объемная (0,04±0,05 и 0,1±0,0 мкм³/мкм³ соответственно) и поверхностная плотность (6,4±0,0 и 12,9±2,0 мкм² /мкм³ соответственно) липидных капель. Предполагается, что продукты лизосомального протеолиза при дефиците источников энергии могут быть использованы для энергетических и пластических потребностей клеток, в чем выражается сущность "реконструктивной функции" лизосом [14]. Наличие липофусцина, гемолиз эритроцитов - свидетельство окислительного стресса, который развивается после гипертермии. При этом снижается антиоксидантная защита в гепатоцитах, угнетается функционирование комплекса Гольджи.

Таким образом, выявлены как сходства в реактивных изменениях ультраструктуры гепатоцитов рыб и млекопитающих, так и отличия. В частности, общей реакцией является конденсация хроматина в ядрах гепатоцитов. Остальные показатели проявляют межвидовые отличия - у рыб увеличиваются, а у млекопитающих снижаются объемная и поверхностная плотность митохондрий; со стороны лизосом наоборот - увеличивается объемная и поверхностная площадь у млекопитающих и снижается у рыб. После гипертермии выявлено увеличение объемной плотности гликогена в группе рыб, у млекопитающих - липидов. В гепатоцитах рыб снижается объемная плотность АЭС, что является показателем угнетения процессов детоксикации. В свою очередь у млекопитающих отмечается увеличение объемной плотности ГЭС. Т.о. в группе рыб отмечено доминирование анаболических процессов, на что указывает высокое содержание гликогена, тогда как в группе млекопитающих доминируют катаболические процессы, это проявляется в снижение содержания гликогена и увеличении показателей лизосомальных структур.

Выводы:

Проблема эволюционных преобразований и приспособительных особенностей клеток органов входит в число важнейших вопросов биологической науки, являясь составной частью фундаментальных исследований эволюции и адаптации организма животных в различных условиях среды.

Так, в частности, полиморфизм митохондрий связан с тем, что органеллы активно меняют свою форму для увеличения контакта с немногочисленными цистернами ГЭС, в результате чего наиболее полно при существующих в клетке возможностях осуществляется синтез белков, подлежащих выведению из клетки. Различия в ультраструктуре наблюдались от клетки к клетке и даже среди органелл в одной и той же клетке, что подтверждает на ультраструктурном уровне действие закона перемежающейся активности функционирующих структур [6, 12]. Учитывая различный временной период функционирования органелл гепатоцитов, в частности митохондрий, они могут отражать наличие в клетках широкого спектра танатогенных подпрограмм [8], которые реализуются в отдельных гепатоцитах в ответ на действие термального стресса.

гипертермия гепатоцит млекопитающее рыба

Перемежающееся функционирование однотипных структур включается на определенном этапе развития органа в соответствии с функциональной нагрузкой. Компенсаторной реакцией является обилие липидных капель, видимо, поступающих из жировых депо для их метаболизма в качестве энергетического субстрата. Увеличение гликогена выявленное у рыб является следствием преобладания процессов гликонеогенеза над процессами гликогенолиза. Т.е. в данной группе пойкилотермных животных увеличивается значение гликогена, как источника энергетического субстрата в период первичной тепловой устойчивости после воздействия гипертермии. Отмечен значительный полиморфизм гепатоцитов, отражающий разную степень их реакции на гипертермию, что связано с различным ритмом их функционирования, а следовательно - и степенью адаптации к нагрузке.

Увеличение количества цистерн ГЭС, размеров, количества митохондрий, гипертрофия и гиперплазия комплекса Гольджи выявляют наличие внутриклеточной физиологической регенерации [11]. Тесный топографический контакт митохондрий с липидными каплями указывает на течение АТФ-зависимого процесса в-окисления жирных кислот липидов с помощью ферментов митохондрий [4]. Большое количество вторичных лизосом тоже следует рассматривать как компенсаторную реакцию, так как с ними удаляются в желчный капилляр трансформированные продукты жизнедеятельности клеток. Отмечено тесное топографическое взаиморасположение с митохондриями капель липидов и липофусцина, что отражает наличие окислительного стресса, угнетение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и взаимосвязь митохондрий с процессами липогенеза.

Полученные данные выявили на ультраструктурном уровне приспособительное значение морфологических особенностей клеток печени, их взаимоотношение с функцией и со средой в процессе эволюции и подтвердили высказывания А.Н. Северцова, что "все эволюционные изменения животных происходят в прямой или косвенной зависимости от изменений окружающей среды", "вся организация животных во всякий период эволюции является адаптивной".

Литература

1. Алматова К.Т., Мусоев Х.Н., Кадирова З.Х. О фосфолипидном составе мембран митохондрий печени при тепловых стрессах // Вопр. мед. химии. - 1994. - №2. - С.48-52.

2. Александров Александров В.Я., Кислюк И.М. // Цитология. 1994. № 1. С.5-43. Реакция клеток на тепловой шок: физиологический аспект

3. Заварзин А.А. Труды по теории параллелизма и эволюционной динамике тканей. Л-д. "Наука". 1986.194с.

4. Калашникова М.М. Особенности морфологической дифференцировки гепатоцитов различных животных в онтогенезе в зависимости от характера питания // Бюлл. экспер. биол. 1997. Т.122. N1. С.4-10.

5. Коун К, Сарджент Док. Питание, // в кн". Биоэнергетика и рост рыб", пер с англ.М. "Легкая и пищевая промышленность". 1983. С.8-61.

6. Крыжановский Г.Н. Биоритмы и закон структурно-функциональной временной дискретности биологических процессов. // В кн.: Биологические ритмы в механизмах компенсации нарушенных функций.М. 1973.С. 20-34.

7. Константинов А.С., Зданович В.В., Пушкарь В.Я. Энергобюджет карпа CYPRINUS CARPIO и золотой рыбки CARASSIUS AURATUS в оптимальных стационарных и переменных терморежимах // ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР.16. БИОЛОГИЯ. 2005. - № 1 c.39-44

8. Проскуряков С.Я. Некроз - активная форма программируемой клеточной гибели // Биохимия Т.67, вып 4.2002. с.468-487

9. Руднева И.И. Эколого-физиологические особенности антиоксидантной системы рыб и процессов перекисного окисления липидов // Успехи соврем. биол. 2003. - Т.123, №4, С. - 391-400.

10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA.М., МедиаСфера, 2002. - 305c.

11. Саркисов Д.С. О формах внутриклеточной регенерации. /Арх. пат. 1970. В.1. С.40-45.

12. Саркисов Д.С. Ультраструктурные основы биоритмов и проблема гомеостаза / В кн. Биологические ритмы в механизмах компенсации нарушенных функций. М. 1973. С.35-46.

13. Тронов В.А., Е.М. Константинов, И.И. Крамаренко Сигнал к апоптозу, индуцированный гипертермией, и пути его передачи в клетке // Цитология. - 2002, Т.44, №11. - с. С.1079-1087

14. Шкурупий В.А. Ультраструткура клеток печени при стрессе. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989. - 144с.

15. Ademeyiva O., Adesanya O., Ajuwon O. R. Vitamin C in hepatokxidy. A preliminary report // Hum. and Exp. Toxticol. 1994.13,N2. p.107-109.

16. Harari P. M., Fuller D. J., Carper S. W., Groghan M. K., Meyscens F. L., Shimm D. S., Gerner E. W. Poliamine biosyntesise ihibithors combined with systemic hupervermia in cancer therapy // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phis. - 1990. - vol. 19.,N1. - p.89-96.

17. Jarnagin W., Rockey D., Kotelinsky V. Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the EШA segment in rat hepatic fibrogenesis // J. Cell. Biol., 1994. - 127. - № 6. - H. 2037-2048.

Размещено на Allbest.ru