Анализ содержания аминокислот в образцах животного и растительного происхождения методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией

Размещено на http://allbest.ru

Размещено на http://allbest.ru

Анализ содержания аминокислот в образцах животного и растительного происхождения методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией

Иван Владимирович Артамонов

Аннотация. В статье излагается работа по оптимизации метода ионообменной ВЭЖХ с постколоночной дериватизацией нингидрином и спектрофотометрическим определением на диодно-матричном детекторе (DAD) общих аминокислот в образцах животного и растительного происхождения на ионообменной колонке Sevko. Исходным материалом для определения послужили образцы мяса животных, птицы и рыбы, образцы травосмесей, миксов и комбикормов. Разделение осуществлялось на хроматографической системе Shimadzu LC-20 Prominence с использованием хроматографической колонки и готовых буферных растворов производства Sevko в режиме градиентного элюирования. В ходе работы выявлены ограничения указанной конфигурации хроматографической системы, в частности, максимально возможная концентрация аминокислот в пробах, при которых происходит полное и стабильное разделение на указанном типе ионообменной хроматографической колонки. Определена оптимальная концентрация аминокислот в анализируемом образце, при которой происходит полное разделение смеси - 0,25 мкМоль/мл. При более высоких концентрациях (например, 0,5 мкМоль/мл) происходит перегрузка хроматографической колонки и слияние пиков аминокислот с небольшой разницей во временах удерживания.

Ключевые слова: аминокислоты, высокоэффективная жидкостная хроматография, белок, ионообменная хроматография, постколоночная дериватизация, нингидрин

Analysis of the content of amino acids in the samples of animal and vegetable origin by ion-exChange Chromatography with post-column derivatizaticn

Ivan V. Artamonov

Abstract. The article describes the work on the optimizing of the method of ion-exchange HPLC with post-column derivatization with ninhydrin and spectrophotometric determination on a diode array detector (DAD) of total amino acids in animal and plant samples on a Sevko ion-exchange column. Samples of animal meat, poultry and fish, samples of grass mixtures, mixes and mixed fodder served as the initial material for the determination. Separation was carried out on a Shimadzu LC-20 Prominence chromatographic system using a chromatographic column and ready-made buffer solutions manufactured by Sevko in the gradient elution mode. In the course of the work, a certain limitation of the specified type of chromatographic system was revealed, namely, the maximum possible concentration of amino acids in the samples, at which complete and stable separation occurs on the specified type of ion-exchange chromatographic column. The optimal concentration of amino acids in the analyzed sample was determined, at which the complete separation of the mixture occurs - 0.25 pmol/ml. At higher concentrations (e.g., 0.5 pmol/ml) the chromatographic column is overloaded and amino acid peaks merge with little difference in retention times.

Keywords: amino acids, high performance liquid chromatography, protein, ion exchange chromatography, post-column derivatization, ninhydrin

аминокислоты высокоэффективная жидкостная хроматография постколоночная дериватизация

Введение

Рост мировой популяции ставит перед пищевой промышленностью и сельским хозяйством задачу обеспечения населения качественным пищевым белком. Эта задача существует как на общемировом уровне, так и на уровне отдельных стран, регионов и отдельных хозяйств и производств [1].

Спрос на качественный белок обусловлен, с одной стороны, потребностью поддержания роста, здоровья и, в целом, полноценной жизнедеятельности человека. С другой стороны - потребностью сельского хозяйства и других отраслей в качественном кормовом сырье и готовых кормах для поддержания высокой продуктивности сельскохозяйственных животных, служащих основным источником полноценного белка [2].

Содержание аминокислот как в конечной продукции, так и в кормах является одним из факторов, определяющих направления коррекции рационов, а также диагностическим показателем состояния сельскохозяйственных животных. Своевременное и точное количественное определение аминокислотного состава белков в кормах позволяет скорректировать рационы введением в них как источника более полноценного белка, так и добавкой отдельных чистых аминокислот.

Определение аминокислот с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) за последние 30 лет стало наиболее распространенной практикой. Однако существуют естественные ограничения, не позволяющие проводить такой анализ без специальной подготовки.

Химическая природа аминокислот такова, что в исходном виде (как в виде чистых кислот, так и в виде солей, например, натриевых) они не содержат структурных элементов, которые бы позволяли обнаруживать их методами FL-спектроскопии и не поглощают в UV-области с достаточной для определения интенсивностью. Также аминокислоты не являются окрашенными веществами, что исключает обнаружение в видимом спектре. Другие способы хроматографического анализа также недостаточно чувствительны для точного количественного определения чистых аминокислот [3, 4]. Исключением является масс-спектрометрия, которая, однако, требует дорогостоящего оборудования.

Однако всеми указанными свойствами обладают дериваты аминокислот - продукты химической реакции с участием определяемого соединения, в результате которой образуется удобное для детектирования вещество, которое является либо производным исходного вещества, либо образуется попутно и количественно.

Аминокислоты могут быть дериватизированы как до разделения на хроматографической колонке, так и после. В первом случае речь идет о предколоночной дериватизации, во втором - о постколоночной.

Для дериватизации аминокислот как правило применяются о-фталевый альдегид [5, 6], фенили- зотиоцианат (ФИТЦ) [7, 8], дасилхлорид [9], 9-флуоренилметилхлорформиат [10], нафталиндиальде- гид, нингидрин. Нингидрин и о-фталевый альдегид применяются в реализациях метода с постколоночной дериватизацией.

Мы использовали постколоночную дериватизацию с использованием нингидринового реагента Так как методика с постколоночной дериватизацией нингидрином является основной для ГОСТ, касающихся анализа аминокислот методом ВЭЖХ, это стало важным аргументом при выборе из множества используемых методик и дериватизирующих агентов.. В результате реакции с веществами, содержащими a-аминогруппы, образуется соединение (синефиолетовый комплекс Руэмана), обладающее интенсивной сине-фиолетовой окраской с максимумом поглощения l = 570 нм [11].

Соединения, не имеющие аминогруппы в a-положении (например, пролин и гидроксипролин), образуют с нингидрином производное желтого цвета с максимумом поглощения l = 440 нм.

Максимумы поглощения дериватов обусловливают длины волн, на которых производится детектирование с использованием UV-VIS или DAD детекторов.

Стоит отметить, что примененный в данном исследовании тип хроматографических колонок (Na-ионообменная) не является единственным возможным. С аналогичной (а часто и более высокой) эффективностью применяются классические обращенно-фазовые колонки типа RP-18C, в некоторых случаях дающие лучшее разделение. Особенно это касается методик с предколоночной дериватизацией [12, 13].

Также необходимо указать, что данная методика пробоподготовки исключает определение триптофана ввиду его деградации при кислотном гидролизе [14]. Для анализа содержания триптофана требуется проведение отдельной процедуры, как правило - щелочного гидролиза (например [15]).

Объект и методы исследований. В работе использовался диодно-матричный детектор Shimadzu SPD-M20A в сочетании с системой классической жидкостной хроматографии Shimadzu LC-20 Prominence и модулем дериватизации ARM-1000 производства Sevko. Разделение проводилось на Na-ионообменной колонке при температуре 60°С в режиме градиентного элюирования. Градиентная программа приведена в табл. 1.

В качестве компонентов подвижной фазы использованы готовые буферные растворы производства Sevko: компоненты А, В - цитратные буферы с установленным показателем pH = 2,20, компонент С - раствор гидроксида натрия с pH = 11,0 для регенерации хроматографической колонки. Все растворы могут быть приготовлены самостоятельно в соответствии с ГОСТ 32195-2013. В качестве дериватизирующего реагента применялся готовый нингидриновый реагент, обработанный активатором непосредственно перед началом анализа.

Калибровка хроматографической системы выполнена с использованием готового раствора стандартов аминокислот концентрацией 1 мкМ/мл. Стандартный раствор объемом 250 мкл разбавляли буфером для разведения образцов (цитратный буферный раствор с установленной pH = 2,20) вдвое. Далее половину полученного раствора переносили в отдельную виалу и разбавляли 250 мкл буфера для разведения образцов. Таким образом, получили два калибровочных раствора с концентрациями 0,25 и 0,125 мкМ/мл. Калибровочные растворы вводили в хроматограф посредством автосэмплера SIL-20A, начиная с раствора с наименьшей концентрацией. Хроматограмма стандарта аминокислот представлена на рис. 1.

Рис. 1. Хроматограмма стандарта аминокислот, включая метионин (MET) и его окисленную форму - метионин-сульфон (MET-S), длина волны - 570 нм. Пролин (PRO) регистрируется на длине волны 440 нм.

Fig. 1. Chromatogram of amino acid standard, including methionine (MET) and its oxidized form - methionine sulfone (MET-S), wavelength - 570 nm. Proline (PRO) is registered at a wavelength of 440 nm.

Пробоподготовка образцов травосмесей, комбикорма и мяса включала кислотный гидролиз раствором соляной кислоты с концентрацией 6М в течение 24 часов. Растительные образцы перед гидролизом высушивали до постоянной массы и измельчали на лабораторной мельнице.

Навеску образца (для животных образцов - 0,4 г, для растительных - 1 г) помещали в банки с винтовыми крышками и добавляли раствор для окисления (надмуравьиная кислота, приготовленная путем смешивания растворов муравьиной кислоты и перекиси водорода), через 1 час в банки добавляли метабисульфит натрия и заливали 6М раствором соляной кислоты, после чего помещали в сушильный шкаф при температуре 110°С на 24 часа.

Таблица 1. Градиентная программа элюирования смеси аминокислот Table 1. Gradient program for eluting a mixture of amino acids

Источник: техническая документация Sevko. Source: Sevko technical documentation.

После окончания гидролиза пробы нейтрализовали 7,5М раствором гидроксида натрия и доводили pH проб до значения 2,20. После этого пробы переносили в мерную колбу объемом 200 мл и доводили до метки буфером для разведения образцов.

Полученный раствор фильтровали через мембранные фильтры с порами 0,45 мкм В таком виде пробы могут длительное время храниться при температурах от 2 до 6^оС без заметного изменения концентраций аминокислот., переносили в виалы и вводили в хроматограф посредством автосэмплера. После разделения на Na-ионообменной колонке аминокислоты дериватизировались в модуле АРМ-1000. Дериваты регистрировались DAD- детектором на длинах волн, указанных выше для дериватов a-аминокислот и пролина (оксипролина).

Результаты и их обсуждение. Подбор условий разделения проводился на растворе стандартов аминокислот. Процесс оптимизирован для объема ввода 100 мкл. Все испытания выполнены не менее, чем в двух повторениях. Установлено, что при концентрации стандарта в 0,5 мкМ/мл и выше не происходит полного разделения валина, метионина, изолейцина, лейцина, тирозина и фенилаланина, а также гистидина и лизина, а времена удерживания смещаются в большую сторону (рис. 2).

Рис. 2. Хроматограммы 0,5 мкМ/мл и 0,25 мкМ/мл калибровочных растворов аминокислот. Объем ввода - 100 мкл.

Fig. 2. Chromatograms of 0.5 pM/ml and 0.25 pM/ml amino acid calibration solutions. The injection volume is 100 pl.

Источник: составлено автором.

Source: compiled by the author.

Аналогичная ситуация наблюдается при разделении аминокислот в пробах животного происхождения (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограммы образцов мяса рыбы (тилапия) без разведения (1) и с двукратным разведением (2). Исходные концентрации указаны в табл. 2.

Fig. 3. Chromatograms of fish (tilapia) samples without dilution (1) and with twofold dilution (2). The initial concentrations are listed in table. 2.

Источник: составлено автором.

Source: compiled by the author.

Аналогичным образом разделяются растительные образцы с высоким содержанием белка, например, образцы семян бобовых (горох, люцерна, люпин). При двукратном разведении исходного образца, полученного из 1 грамма материала (образцы люпина и гороха), наблюдалось неполное разделение (или отсутствие такового) пар «аспарагиновая кислота - метионин-сульфон», «изолейцин-лейцин» (рис. 4) и характерные признаки перегрузки хроматографической колонки. Результаты количественного анализа содержания аминокислот в исследованных образцах растительного происхождения представлены в табл. 3.

Таблица 2. Содержание аминокислот в образцах животного происхождения в граммах на 100 г исходного образца (без удаления жира), среднее по 3 испытаниям (пробоподготовка проводилась без окисления образцов)

Table 2. The content of amino acids in samples of animal origin in grams per 100 g of original sample (without fat removal) on average over 3 tests (sample preparation was carried out without sample oxidation)

Рис. 4. Хроматограмма разделения пробы, полученной из образца семян люпина узколистного массой 1 г с разведением 1:2 (1) и 1:4 (2).

Fig. 4. Chromatogram of the separation of the test obtained from a sample of seeds of angustifolia lupine weighing 1 g with a dilution of 1:2 (1) and 1:4 (2).

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Таблица 3. Содержание аминокислот в образцах семян бобовых в граммах на 100 г исходного образца Table 3. Content of amino acids in samples of legume seeds in grams per 100 g of the initial sample

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Таблица 4. Содержание аминокислот в образцах растительного происхождения в граммах на 100 г сухого образца

Table 4. The content of amino acids in samples of plant origin in grams per 100 g of dry sample

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Присутствие метионина в исходной форме обусловлено неполным его окислением ввиду крупного размера частиц образца. В настоящее время проводится размол до размера частиц не более 0,5 мм.

Кроме высокой концентрации аминокислот это может свидетельствовать о низкой емкости используемого типа колонок (рис. 5).

Рис. 5. Признаки перегрузки хроматографической колонки Sevko (выраженный наклон пиков в направлении тыла хроматограммы) при анализе пробы с концентрацией глутамина ~0,5 мкМоль/мл, глицина --0,23 мкМоль/мл.

Fig. 5. Signs of overloading the Sevko chromatographic column (pronounced slope of the peaks towards the rear of the chromatogram) when analyzing a sample with a concentration of glutamine ~0,5 мmol/ml, glycine --0,23 мmol/ml.

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Заключение

Проведенные испытания показывают, что важной задачей при подготовке проб к анализу на содержание аминокислот в описанных условиях хроматографирования является правильная оценка концентрации аминокислот в пробе и соответствующая подготовка пробы перед вводом в хроматографическую систему.

В общем случае рекомендуется разведение проб, полученных из растительных образцов, вдвое, из животных и растительных образцов с высоким содержанием белка (например, семена бобовых) - вчетверо для получения качественных хроматограмм.

Тем не менее, желательно проводить пробное разделение, по результатам которого принимать решение о разведении подготовленных проб.

Чувствительность метода достаточна для количественного определения аминокислот вплоть до 0,01 мкМ/мл (соотношение S/N сохраняется на уровне 9-10), при этом предел обнаружения составляет порядка 0,0001 мкМ/мл (соотношение S/N при этом - 2,12).

Все параметры, такие как максимальная концентрация, при которой аминокислоты разделяются полностью, времена удерживания (и др.) проверены в испытаниях на двух аналогичных хроматографических Na-ионообменных колонках Sevko.

Список источников

1. Otter D.E. Standardised methods for amino acid analysis of food // British Journal ofNutrition. 2012. 108(2). P. 203-237.

2. Toomer O.T. et al. Feeding high-oleic peanuts to meat-type broiler chickens enhances the fatty acid profile of the meat produced // Poultry Science, Elsevier Inc. 2020. 99(4). P. 2236-2245. doi:10.1016/ j.psj.2019.11.015

3. Sherwood R.A. Amino acid measurement by high-performance liquid chromatography using electrochemical detection // Journal of Neuroscience Methods. 1990. 34. P. 17-22. doi:10.1016/0165- 0270(90)90037-g

4. Joseph MH., Davies P.T. Electrochemical activity of o-phthalaldehyde-mercaptoethanol derivatives of amino acids. Application to high-performance liquid chromatographic determination of amino acids in plasma and other biological materials // Journal of chromatography 1983. Vol. 277. P. 125-136.

5. Brent R.L., Frederick GW. A method for quantitative amino acid analysis using precolumn o-phthalaldehyde derivatization and high performance liquid chromatography // Journal of Chromatographic Science. 1981. Vol. 19(5). P 259-265.

6. Tcherkas Y.V., Denisenko A.D. Simultaneous determination of several amino acids, including homocysteine, cysteine and glutamic acid, in human plasma by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection // Journal of Chromatography. 2001. Vol. 913(1-2). P. 309-313. doi:10.1016/s0021-9673(00)01201-2

7. Albin D.M., Wubben J.E., Gabert V.M. Effect ofhydrolysis time on the determination of amino acids in samples of soybean products with ion-exchange chromatography or precolumn derivatization with phenyl isothiocyanate // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000. Vol. 48(5). P 1684-1691.

8. Sato K. et al. Improved method for identification and determination of .epsilon.-(.gamma-glutamyl)lysine cross-link in protein using proteolytic digestion and derivatization with phenyl isothiocyanate followed by high-performance liquid chromatography separation // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. Vol. 40(5). P 806-810.

9. Kang X. et al. Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples // Clinica Chimica Acta. 2006. Vol. 366(1-2). P 352-356. doi:10.1016/j.cca.2005.11.011

10. Zhou W., Zhang X.Y., Duan G.L. Liquid-chromatography quantitative analysis of 20 amino acids after derivatization with FMOC-CI and its application to different origin Radix isatidis // Journal of the Chinese Chemical Society. 2011. Vol. 58(4). P 509-515.

11. Friedman M. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. Vol. 52(3). P. 385-406.

12. Sharma G. et al. Analysis of 26 amino acids in human plasma by HPLC using AQC as derivatizing agent and its application in metabolic laboratory // Amino Acids. 2014. 46(5). P 1253-1263.

13. Захарова А.М., Гринштейн И.Л., Карцова Л.А. Определение аминокислот в сухом экстракте мозга коров, пробах мяса телят и кур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т 12. N° 6. С. 845-853.

14. Molnar-Perl I. Advances in the analysis of tryptophan and its related compounds by chromatography // In: Huether G. et al. (eds.) Tryptophan, serotonin and melatonin: basic aspects and application. 1999. P. 801-816.

15. Yust M.M. et al. Determination of tryptophan by high-performance liquid chromatography of alkaline hydrolysates with spectrophotometric detection // Food Chemistry. 2004. Vol. 85(2). P. 317-320.

Размещено на Allbest.ru