Активність ензимів глутатіонової антиоксидантної системи бактерій chlorobiumlimicola imbk-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату

Размещено на http://www.allbest.ru/

Активність ензимів глутатіонової антиоксидантної системи бактерій chlorobiumlimicola imbk-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату

Т. Сегін, С. Гнатуш, О. Масловська, О. Василів

Мета. Дослідити зміни активностей ензимів глутатіонової антиоксидантної системи бактерій ChlorobiumlimicolaІМВ K-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату. Методи. У роботі використовували бактерії C. limicolaІМВ K-8, які вирощували у середовищі Greensulfurbacteria. Глутатіонпероксидазну активність визначали за швидкістю окиснення відновленого глутатіону до і після інкубації з гідропероксидом третинного бутилу за допомогою кольорової реакції з 5,5-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою. Глутатіон^-транс- феразну активність визначали за швидкістю утворення кон'югату відновленого глутатіону в реакції з 1-хлор-2,4-динітробензолом. Результати. Досліджено глутатіон^-трансферазну, глутатіонпероксидазну та глу- татіонредуктазну активності безклітинних екстрактів C. limicolaІМВ K-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату у концентраціях, які спричиняли зниження накопичення біомаси на 10-70%. Показано, що за впливу всіх досліджуваних концентрацій купрум (ІІ) сульфату зростали глутатіон^-трансферазна та глутатіонпероксидазна активності, порівняно з контролем. Активність цих ензимів змінювалася залежно від концентрації купрум (ІІ) сульфату в середовищі інкубації та тривалості культивування бактерій. Також встановлено, що у досліджуваних бактерій відсутня глутатіонредуктазна активність. Висновок. Зростання глутатіонпероксидазної активності у 2-12 разів та глутатіон^-трансферазної активності у 1,5-2 рази, порівняно з контролем, у безклітинних екстрактах C. limicolaІМВ К-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату свідчить про накопичення у клітинах гідрофобних і гідрофільних органічних пероксидів, а також про те що, ймовірно, ця система є одним із важливих способів захисту клітин зелених фотосинтезувальних бактерій, зокрема C. limicola, від активних метаболітів кисню. chlorobiumlimicola глутатіон окиснення ензим

Ключові слова: зелені бактерії, Chlorobiumlimicola, глутатіон^-транс- фераза, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, купрум (ІІ) сульфат.

Aim. Investigation of changes of glutathione antioxidant system enzymes activity

of Chlorobium limicola IMV K-8 bacteria under the influence of copper (II) sulfate.

Methods. In this investigation there were used C. limicola 1MVK-8 bacteria which were cultivated in Green sulfur bacteria medium. Glutathione peroxidase activity was determined by the rate of oxidation of reduced glutathione before and after incubation with tert-butyl hydroperoxide by color reaction with 5,5-dithiobis-2- nitrobenzoic acid. Glutathione S-transferase activity was determined by the rate of formation of conjugate of reduced glutathione with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene. Results. Glutathione-S-transferase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activity of cell free extracts of C. limicola 1MV K-8 were investigated under the influence of copper (II) sulfate in concentrations that caused decrease of biomass accumulation from 10 to 70%. It was shown that under the influence of all investigated copper (II) sulfate concentrations glutathione-S-transferase and glutathione peroxidase activity increased in comparison with control. Activity of these enzymes changed in dependence on copper (II) sulfate concentration in incubation medium and duration of cultivation. Also it was determined that glutathione reductase activity is absent in investigated bacteria. Conclusion. The increase of activity of glutathione peroxidase by 2-12 times and glutathione- S-transferase by 1.5-2 times, in comparison with control, in cell free extracts of C. limicola 1MV K-8 under the influence of copper (II) sulfate indicates on accumulation of hydrophobic and hydrophilic organic peroxides inside the cells. It also shows that, possibly, this system is one of the important ways of cell defense of green photosynthetic bacteria, in particular C. limicola, against reactive oxygen species.

Key words: green bacteria, Chlorobium limicola, glutathione-S-transferase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, copper (II) sulfate.

Цель. Исследовать изменения активностей энзимов глутатионовой антиоксидантной системы бактерий ChlorobiumlimicolaИМВ K-8 под влиянием купрум (II) сульфата. Методы. В работе использовали бактерии C. limicolaИМВ K-8, которые выращивали в среде Greensulfurbacteria. Глутатионпе- роксидазну активность определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона до и после инкубации с гидропероксидом третичного бутила с помощью цветной реакции с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой. Глутатион^-трансферазну активность определяли по скорости образования конъюгата восстановленного глутатиона в реакции с 1-хлор-2,4-ди- нитробензолом. Результаты. Исследовали глутатион^-трансферазную, глутатионредуктазную и глутатионпероксидазную активности бесклеточных экстрактов C. limicolaИМВ K-8 под влиянием купрум (II) сульфа-

та при концентрациях, которые повлекли снижение накопления биомассы на 10-70%. Под воздействием купрум (ІІ) сульфата при всех исследуемых концентрациях увеличивались глутатион^трансферазная и глутатионпе- роксидазная активности по сравнению с контролем. Активность этих ферментов изменялась в зависимости от концентрации купрум (ІІ) сульфата в инкубационной среде и продолжительности культивирования бактерий.

Также установлено, что в исследуемых бактерий отсутствует глутати- онредуктазная активность. Вывод. Увеличение глутатионпероксидазной активности в 2-12 раз и глутатион^-трансферазной активности в 1,5-2 раза, по сравнению с контролем, в бесклеточных экстрактах C. limicolaИМВ К-8 под влиянием купрум (ІІ) сульфата свидетельствует о накоплении в клетках гидрофобных и гидрофильных органических пероксидов, а также о том, что, вероятно, эта система является одним из важных способов защиты клеток зелёных фотосинтезирующих бактерий, в частности C. limicola, от активных метаболитов кислорода.

Ключевые слова: зелёные бактерии, Chlorobiumlimicola, глутати- он^-трансфераза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, купрум (ІІ) сульфат.

Мікроорганізми у навколишньому середовищі, особливо у техногенно трансформованих біотопах, зазнають впливу стресових чинників. Важливим забруднювачем кар'єрних водойм у місцях промислового видобування сірки, є гідроген сульфід, який утворюється у значних кількостях і згубно впливає на функціонування організмів [8, 10]. Виділені нами зелені фотосинтезуваль-

ні бактерії ChlorobiumlimicolaІМВ К-8 з води озера Яворівське (Україна, Львівська обл.) використовують гідроген сульфід як донор електронів, внаслідок чого водойма очищується від нього [1]. Такі властивості C. limicolaІМВ К-8 можуть бути використані для створення біотехнологій для очищення вод, забруднених гідроген сульфідом. Відомо, що забруднювачами навколишнього середовища, у тому числі і техногенних водойм, є сполуки важких металів

[10] . Йони металів із змінною валентністю спричиняють утворення активних метаболітів кисню (АМК) [2, 4, 6]. Щоб протидіяти шкідливому впливу АМК багато анаеробних мікроорганізмів виробили систему захисту, важливою ланкою якої є глутатіонзалежна антиоксидантна система [8, 11]. Її функціонування у клітинах прокаріот досліджено не достатньо. Відомо, що глутатіонова антиоксидантна система є видоспецифічною, а інколи і штамоспецифічною

[11] . Гени, які кодують глутатіонпероксидазу чи глутатіон^-трансферазу у бактерій C. limicolaу базі даних GenBankне виявлено. Однак, ідентифіковано амінокислотні та нуклеотидні послідовності ензимів глутатіонової системи у близькоспоріднених родів і задепоновано послідовність ензиму штаму ChlorobiumtepidumTLS (NP_661153.1) довжиною 164 амінокислоти, який характеризується глутатіон^-трансферазною активністю. Також задепонова- но дві амінокислотні послідовності ензимів штаму Chlorobiumsp. GBChlBдовжиною 163 (GI:662569203) та 157 амінокислот (GI:662568093), для яких характерна глутатіонпероксидазна активність [9]. Глутатіонова система забезпечує відновлення Н₂О₂ і різних органічних гідропероксидів та знешкодження токсичних альдегідів, внаслідок кон'югації з відновленим глутатіоном [2, 4, 11]. У літературі немає даних щодо функціонування такої системи у зелених сіркобактерій.

Метою роботи було дослідити зміни активностей ензимів глутатіонової антиоксидантної системи бактерій C. limicolaІМВ K-8за впливу купрум (ІІ) сульфату.

Матеріали і методи

У роботі використовували бактерії ChlorobiumlimicolaІМВ K-8, які вирощували у середовищі Greensulfurbacteria (GSB) [1] як описано в роботі [6]. Суспензію клітин бактерій з експоненціальної фази росту обробляли упродовж однієї години трис-НСІ буфером (50 мМ, рН 7,0), який містив купрум

(ІІ)сульфат у концентраціях від 0,05 до 0,5 мМ як описано у нашій попередній роботі [6]. У зразки, що слугували за контроль, купрум (ІІ) сульфат не вносили. Обрані концентрації купрум (ІІ) сульфату зумовлювали зниження нагромадження біомаси від 10% до 70%, що дозволяє оцінити зміни показників антиоксидантної системи за зростання пригнічувального впливу [6]. Безклітинні екстракти одержували руйнуванням клітин на ультразвуковому гомогенізаторі УЗДН-2Т (22 кГц, 5 хв, 0 °С) [6]. Концентрацію білків у без- клітинних екстрактах визначали за методом Лоурі [7]. Глутатіонпероксидазну активність визначали за швидкістю окиснення відновленого глутатіону до та після інкубації з гідропероксидом третинного бутилу за допомогою кольорової реакції з 5,5-дитіобіс-2-нітробензойною кислотою [2]. Глутатіон^-транс- феразну активність визначали за швидкістю утворення кон'югату відновленого глутатіону в реакції з 1-хлор-2,4-динітробензолом, який характеризується максимумом поглинання за довжини хвилі 340 нм [3]. Глутатіонредуктазну активність визначали за зниженням вмісту НАДФН упродовж 1 хв, вимірюючи оптичну густину за довжини хвилі 340 нм [2]. Вираховували основні статистичні показники за отриманими даними (середнє арифметичне - М; стандартну похибку середнього арифметичного - m). Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками трьох альтернативних сукупностей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента. Критичний рівень значимості «р» був прийнятий рівним 0,05 [5]. Для обробки даних використовували пакети програм MSЕхсеї 2003 та Origin8.

Результати досліджень та їх обговорення

Внесення купрум (ІІ) сульфату, як стресового чинника, до середовища інкубації C. limicolaІМВ K-8в концентраціях 0,05-0,5 мМ спричиняє вільно- радикальне окиснення ліпідів, що призводить до активації системи антиоксидантного захисту [6].

Глутатіон^-трансферазна активність C. limicolaІМВ K-8у контролі була найвищою на сьому добу культивування (41±2,7 од. акт./мг білка) (рис. 1).

Рис. 1. Глутатіон^-трансферазна активність безклітинних екстрактів C. limicolaІМВ K-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату (* - p= 0,05, n=3 - вірогідні зміни, порівняно з контролем)

Fig. 1. Glutathione-S-transferase activity of cell-free extracts C. limicola of IMV K-8 under the influence of copper (II) sulfate (* - p = 0.05, n = 3 - probable changes compared with control)

Внесення купрум (ІІ) сульфату в інкубаційне середовище зумовлювало зростання глутатіон^-трансферазної активності у безклітинних екстрактах

C. limicolaІМВ К-8, порівняно з контролем. За внесення купрум (ІІ) сульфату в інкубаційне середовище у концентраціях 0,05-0,125 мМ глутатіон^-транс- феразна активність була найвищою на шосту добу вирощування і зі збільшенням тривалості вирощування до восьми діб знижувалася. Ензиматична активність безклітинних екстрактів С. Іітісоїа ІМВ К-8, інкубованих у середовищі із 0,25 та 0,5 мМ купрум (ІІ) сульфату, була найвищою на сьому добу культивування (відповідно 70±0,34 та 66±6,02 од. акт./мг білка). Упродовж шостої та восьмої діб глутатіон^-трансферазна активність не змінювалася, порівняно з контролем. За впливу цих концентрацій купрум (ІІ) сульфату біомаса

С.Іітісоїа ІМВ К-8 знижувалася у 2,7 та 3,2 рази, порівняно з контролем.

Припускаємо, що за цих умов у клітинах С. Іітісоїа ІМВ К-8 пошкоджується поліпептидний ланцюг глутатіон^-трансферази внаслідок впливу АМК, оскільки відомо, що токсичні продукти перекисного окиснення ліпідів, зокрема малоновий диальдегід та 4-гідроксиноненаль, здатні взаємодіяти з амінокислотами і, таким чином, знижувати або унеможливлювати ензиматичну активність [4]. Також, причиною зниження активності глутатіон^-транс- ферази може бути пошкодження генів, які кодують цей ензим або забезпечують його синтез, внаслідок взаємодії АМК з ДНК. Тому клітини С. Іітісоїа ІМВ К-8, інкубовані у буфері із купрум (ІІ) сульфатом у концентраціях 0,250,5 мМ, внаслідок пошкодження структури ензиму або зниження його синтезу не здатні відновлювати гідропероксильні групи окиснених фосфоліпідів, що, ймовірно, негативно впливає на функціональний стан мембрани і відображається у значному зниженні накопичення біомаси за впливу цих концентрацій купрум (ІІ) сульфату.

Рис. 2. Глутатіонпероксидазна активність безклітинних екстрактів C. limicolaІМВ K-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату (* - p= 0,05, n=3 - вірогідні зміни, порівняно з контролем)

Fig. 2. Glutathione peroxidase activity of cell-free extracts of C. limicola of IMV K-8

under the influence of copper (II) sulfate

(* - p = 0.05, n = 3 - probable changes compared with control)

Під час дослідження глутатіонпероксидазної активності безклітинних екстрактів С. Іітісоїа ІМВ К-8, інкубованих без внесення купрум (ІІ) сульфату, виявлено зростання активності ензиму зі збільшенням тривалості куль- тивування (рис. 2). За внесення усіх досліджуваних концентрацій купрум (ІІ) сульфату в середовище інкубації спостерігали зростання глутатіонперокси- дазної активності. За впливу купрум (ІІ) сульфату у концентраціях 0,05; 0,1 та 0,125 мМ на сьому добу культивування бактерій активність ензиму зростала відповідно у 2,4; 4,2 та 4,7 рази, порівняно з контролем. За впливу купрум (ІІ) сульфату найвищу активність ензиму (187±7 од. акт./мг білка) спостерігали на шосту добу вирощування за впливу 0,5 мМ купрум (ІІ) сульфату, що в 12 разів вище за контрольний показник. Глутатіонпероксидазна активність безклітин- них екстрактів C. limicolaІМВ К-8, інкубованих у буфері, який містив купрум (ІІ) сульфат у концентраціях 0,1-0,25 мМ, була найвищою на сьому добу вирощування, а за впливу 0,5 мМ купрум (ІІ) сульфату була найвищою на шосту добу вирощування. За подальшого збільшення тривалості культивування глу- татіонпероксидазна активність за впливу 0,5 мМ купрум (ІІ) сульфату знижувалася, що може бути зумовлено зниженням вмісту відновленого глутатіону.

Біорегенерація окисненого глутатіону, який утворюється в глутатіонпе- роксидазній реакції, здійснюється з участю глутатіонредуктази [2], активності якої ми не виявили у C. limicolaІМВ К-8. У базі даних GenBankне виявлено гени, які кодують цей ензим у C. limicola,однак є задепонована послідовність гіпотетичного ензиму, який характеризується глутатіонредуктазною активністю у бактерій Chlorobium ferrooxidans DSM 13031 (EAT59077.1) [9]. У E. coliдля оновлення вмісту відновленого глутатіону більш важливими процесами є синтез глутатіону de novo,ніж його відновлення глутатіонредук- тазою [11]. Ймовірно, бактерії C. limicolaІМВ К-8 також синтезують відновлений глутатіон de novo, а не відновлюють окиснену форму у глутатіонредук- тазній реакції. Однак, це буде предметом наших наступних досліджень.

Отже, зростання глутатіонпероксидазної активності у 2-12 разів та глутатіон^-трансферазної активності у 1,5-2 рази, порівняно з контролем, у безклітинних екстрактах C. limicolaІМВ К-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату свідчить про накопичення у клітинах гідрофобних і гідрофільних органічних пероксидів, а також про те що, ймовірно, ця система є одним із важливих способів захисту клітин зелених фотосинтезувальних бактерій, зокрема limicola,від активних метаболітів кисню.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Гнатуш С., ГоришныйМ., Сегин Т. Фотосинтезирующие зелёные серобактерии, выделенные из озера Яворовское (Украина, Львовская область) // Интер-медикал. - 2014. - № 3. - С. 63-68.

2. Головчак Н. П., Тарновська А. В., Коцюмбас Г. І., Санагурський Д. І. Процеси перекисного окиснення ліпідів у живих організмах. - Львів: ЛНУ ім. Івана Франка, 2012. - 250 с.

3. Мартинчик А., Бондарев И. Активность глутатионредуктазы и глута- тион^-трансферазы в печени крыс в зависимости от содержания восстановленного глутатиона // Вопр. мед. химии. - 1986. - 32, № 2. - С. 39-43.

4. Меньшикова Е., Ланкин З., Зенков Н., Боднарь И., Кругловых Н., Тру- факин В. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - Москва: Слово, 2006. - 553 с.

5. Лакин Г. Биометрия. - Москва: Высшая школа, 1990. - 352 с.

6. Сегін Т., Гнатуш С., ГорішнийМ.Процеси ліпопероксидації у клітинах ChlorobiumlimicolaІМВ К-8 за впливу купрум (ІІ) сульфату // Вісн. Дніпропетр. ун-ту. Сер. Біол. Екол. - 2016. - 24, № 1. - С. 72-77.

7. Lowry O., Rosebrough N., Farr A., Randall R. Protein measurement, with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - 193. - P 265-275.

8. Fareleira P, Santos B. Response of a strict anaerobe to oxygen: survival strategies in Desulfovibrio gigas// Microbiology. - 2003. - 149. - P. 1513-1522.

9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

10. Jaishankar M., Tseten T., Anbalagan N., Mathew B., Beeregowda K. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals // Interdiscip. Toxicol. - 2014. - 7, № 2. - P. 60-72.

11. Rui-Yan F, Jian C., Yin L. The function of the glutathione/glutathione peroxidase system in the oxidative stress resistance systems of microbial cells // Chinese J. Biotechnol. - 2007. - 23, № 5. - P 770-775.

Размещено на Allbest.ru