Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

направление обучения «Химия»

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Определение бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

Студент 4-го курса

Канашина Дарья Леонидовна

И.о. заведующего кафедрой:

д.х.н., проф. Ермаков С.С.

Научный руководитель:

к.х.н., доц. Тимофеева И.И.

Санкт-Петербург 2018



Перечень условных обозначений

АТФ - аденозинтрифосфат или аденозинтрифосфорная кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-ДМД - высокоэффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектированием

ВЭЖХ-УФ - высокоэффективная жидкостная хроматография с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ГЖЖЭ-ВДГ- гомогенная жидкостно-жидкостная экстракция с высаливанием и диспергированием газовой фазой

ГХ - газовая хроматография

ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ГХ-ПИД - газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектированием

ДЖЖМЭ - дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖЖМЭ - жидкостно-жидкостная микроэкстракция

ЖФЭ - жидкофазная экстракция

ЖХ-МС -жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ЖХ-УФ - жидкостная хроматография с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ИХ-КД - ионная хроматография с кондуктометрическим детектированием

КР - метод комбинационного рассеяния

КЭ - капиллярный электрофорез

КЭ-КД - капиллярный электрофорез с кондуктометрическим детектированием

КЭ-УФ - капиллярный электрофорез с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области

ПО - предел обнаружения

СКО - среднеквадратичное отклонение

ТПМ - микроэкстракция на тонкоплёночном силикагеле

ТФМЭ - твёрдофазная микроэкстракция

УЗ - ультразвук

УФ - ультрафиолетовый

ФКТ - фосфоресценция при комнатной температуре



Введение

В настоящее время современную пищевую промышленность практически невозможно представить без использования различного рода консервантов, загустителей, стабилизаторов, вкусовых добавок, красителей. Умеренные дозы данных веществ не оказывают негативного влияния на здоровье человека, однако многие производители не соблюдают установленные нормы, вследствие чего пищевые добавки могут вызывать не только аллергические реакции, но и такое серьёзное заболевание, как астма, или даже являться причиной раковых опухолей [1]. Поэтому контроль их содержания является важной задачей аналитической химии.

Существует множество различных инструментальных способов определения пищевых добавок, основными из которых являются спектрофотометрические, электрофоретические и хроматографические методы [2]. Учитывая, что большинство продуктов питания обладает сложной многокомпонентной матрицей, возникает необходимость в предварительной стадии пробоподготовки, которая обеспечивает выделение и концентрирование аналитов. Наиболее широкое применение для этих целей находят методы жидкостно-жидкостной и твёрдофазной экстракций. Однако, классические варианты этих методов требуют больших объёмов токсичных растворителей, характеризуются сложностью и длительностью выполнения.

Поэтому целью данной работы стало создание нового простого экспрессного селективного и экологически безопасного метода пробоподготовки для определения консервантов в пищевых продуктах - бензойной и сорбиновой кислот, который не требует дополнительного оборудования и легко сочетается с известными системами детектирования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оптимизировать условия микроэкстракционного выделения и концентрирования целевых аналитов для их последующего ВЭЖХ-УФ определения; 2) проиллюстрировать возможность разработанной методики на реальных образцах; 3) подтвердить правильность полученных результатов с помощью референтного метода.



Глава 1. Обзор литературы

1.1 Пищевые консерванты

Согласно статье 4 Технического Регламента Таможенного Союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» [3], консервантом является пищевая добавка, предназначенная для продления (увеличения) сроков годности пищевой продукции путем защиты от микробной порчи и/или роста патогенных микроорганизмов.

Наиболее популярной является классификация этих веществ по их происхождению. Как правило, их можно разделить на природные или натуральные и синтетические [4]. К природным консервантам относят столовую соль, уксус, лимонную кислоту, сахар, специи, растительное масло и др. Консерванты синтетического происхождения имеют более распространённое применение при массовом производстве продуктов, по причине их большей эффективности и меньшей стоимости. Согласно Решению Евразийской Экономической комиссии, группа пищевых добавок-консервантов имеет маркировку E200-E299. Наиболее распространённые данные пищевые добавки, их функции, пищевая продукция, при изготовлении которой их наиболее часто применяют, а также максимальное содержание в продукции представлены в таблице 1 [3].

бензойный сорбиновый кислота сок



Таблица 1. Синтетические консерванты, используемые в пищевой промышленности

Название (E код)	Функция	Пищевая продукция	Максимальный уровень в продукции
Сорбиновая кислота (Е200); сорбат натрия (Е201); сорбат калия (Е202); сорбат кальция (Е203)	Консерванты	Консервированные и пастеризованные продукты из плодов и овощей, включая соусы, кроме пюре, муссов, компотов, салатов, соковой продукции и подобных продуктов	1 г/кг
		Спреды, маргарины, соусы эмульгированные на основе растительных масел, майонезы, заправки, соусы майонезные, кремы на растительных маслах с содержанием жира 60% и более	1 г/л
		Спреды, маргарины, соусы эмульгированные на основе растительных масел, майонезы, заправки, соусы майонезные, кремы на растительных маслах с содержанием жира менее 60%	2 г/л
		Соусы неэмульгированные	1 г/кг
		Напитки безалкогольные ароматизированные	300 мг/л
		Напитки ароматизированные на винной основе	200 мг/л
		Вина ординарные, плодовые, медовые, сидр, вина безалкогольные	300 мг/кг
		Овощи маринованные, соленые или в масле (кроме маслин)	2 г/кг
		Пряности и приправы	1 г/кг
Бензойная кислота (Е210); бензоат натрия (Е211); бензоат калия (Е212); бензоат кальция (Е213)	Консерванты	Соусы на основе растительных масел, соусы майонезные, кремы на растительных маслах	500 мг/кг
		Соусы эмульгированные на основе растительных масел, майонезы, заправки, соусы майонезные кремы на растительных маслах с содержанием жира менее 60%	1 г/кг
		Соусы неэмульгированные	1 г/кг
		Напитки безалкогольные ароматизированные	150 мг/л
		Овощи маринованные, соленые или в масле (кроме маслин)	2 г/кг
		Пряности и приправы	1 г/кг
		Маргарины, спреды, кремы на растительных маслах с содержанием жира 60% и более	500 мг/кг
		Маргарины, спреды, кремы на растительных маслах с содержанием жира менее 60%	1 г/кг
		Спиртные напитки с содержанием спирта менее 15 об.%	200 мг/кг
Пара-гидроксибензойной кислоты этиловый эфир (Е214); пара-гидроксибензойной кислоты этиловый эфир, натриевая соль (Е215); пара-гидроксибензойной кислоты метиловый эфир (Е218); пара-гидроксисибензойной кислоты метиловый эфир, натриевая соль (Е219)	Консерванты	Желе, покрывающие мясные продукты (вареные, соленые, вяленые), паштеты	1 г/кг
		Сухие завтраки (закуски) на основе злаковых и картофеля, покрытые орехами	300 мг/кг
		Сахаристые кондитерские изделия, конфеты, шоколад с начинкой	300 мг/кг
Сернистая кислота (диоксид серы Е220); сульфит натрия (Е221); гидросульфит натрия (Е222); пиросульфит натрия (Е223); пиросульфит калия (Е224); сульфит калия (Е225); сульфит кальция (Е226); гидросульфит кальция (Е227); гидросульфит калия (Е228)	Консерванты, антиокисли-тели	Овощи и плоды в маринаде (уксусе), рассоле или в масле (кроме маслин)	100 мг/кг
		Глазированные в сахаре (кондированные), фрукты, овощи, цукаты, дягиль	100 мг/кг
		Джемы, мармелады, желе, повидло с низким содержанием сахара и без сахара и другие аналогичные продукты	50 мг/кг
		Джемы, желе, мармелад, повидло, изготовленные с использованием сульфитированных фруктов и ягод	100 мг/кг
		Конфеты и сахаристые кондитерские изделия на высокоглюкозной патоке	50 мг/кг
		Мясные колбасные изделия с содержанием растительных или зерновых ингредиентов более 4%;	450 мг/кг
		Вяленая и соленая рыба	200 мг/кг
		Концентраты на основе фруктовых соков, содержащие не менее 2,5% ячменного отвара	350 мг/кг
		Другие концентраты на основе фруктовых соков или протертых фруктов	250 мг/кг
		Напитки безалкогольные на фруктовых соках ароматизированные	20 мг/кг остаточные количества из концентратов
		Напитки безалкогольные, содержащие высокоглюкозную патоку (не менее 235 г/л)	50 мг/кг
		Пиво, включая низко-алкогольное и безалкогольное	20 мг/кг
		Вина виноградные	300 мг/кг
		Вина плодовые, в т.ч. шипучие, сидр; медовые вина	200 мг/кг
		Вина безалкогольные	200 мг/кг
Муравьиная кислота (E236)	Консервант	Безалкогольные напитки ароматизированные на водной основе, в том числе специализированные (спортивные, тонизирующие, в том числе энергетические, «электролитные» и др.)	100 мг/л
		Соусы эмульгированные, соусы на основе растительных масел, майонезы, соусы майонезные	200 мг/кг
Нитрит калия (Е249); нитрит натрия (Е250)	Консерванты, фиксаторы окраски	Колбасы и мясные продукты сырокопченые, соленокопченые, вяленые	50 мг/кг
		Колбасы вареные и другие вареные мясные продукты	50 мг/кг
		Консервы мясные	50 мг/кг
Нитрат натрия (Е251); нитрат калия (Е252)	Консерванты, фиксаторы окраски	Колбасы и мясные продукты соленые, вареные, копченые; консервы мясные	250 мг/кг
		Сыры твердые, полутвердые, мягкие	50 мг/кг
		Заменители сыров на молочной основе;	50 мг/кг
		Сельдь, килька соленая и в маринаде	200 мг/кг

Механизм действия консервантов различается в зависимости от их структуры и условий реализации. Так, например, при низких значениях pH среды молекулы слабых кислот (бензойная, сорбиновая), а также их солей, не диссоциируют, в таком состоянии они могут диффундировать через плазматическую мембрану бактериальных и грибковых спор. В клетке микроорганизма кислотность среды выше, поэтому молекулы кислот и/или солей распадаются на ионы, происходит накопление анионов и катионов, которые изменяют проницаемость мембран, а также являются токсичными для патогенных микроорганизмов, подавляя их метаболизм и гомеостаз [5]. Сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и их соли, известные как парабены, обладают схожим строением с бензойной кислотой, механизм их действия аналогичен описанному выше механизму, но эффективен он при более высоких значениях pH.

Действие диоксида серы (E220) и сульфитов (E221-E228) также зависит от значения кислотности среды. Так, при pH?1,7 активность данных веществ повышена. Они ингибируют цепочки ферментативных реакций, вступая во взаимодействие с АТФ, который является универсальным источником энергии всех биохимических процессов, протекающих в живых организмах. Результатом взаимодействия является подавление реакций обмена веществ, а также блокировка некоторых транспортных систем [1, 6].

Нитраты (E251-E252), как консервирующее средство, действуют в основном в виде нитритов (E249-E250), которые образуются в пищевых продуктах при термической обработке. Принцип действия нитритов основан на образовании из них оксидов азота, реагирующих с аминогруппами ферментов, которые участвуют в расщеплении веществ, обеспечивающих микроорганизмы энергией. Такие реакции оказывают подавляющее действие на эти ферменты [7].

Несмотря на полезные свойства консервантов, за счёт которых их используют при изготовлении пищевых продуктов, они способны оказывать негативное воздействие на здоровье человека.

Бензойная кислота и её соли не всегда безвредны для здоровья человека даже в тех количествах, в которых они присутствуют в продуктах питания. Поэтому специалисты не рекомендуют часто употреблять в своём рационе, например, газированные напитки, майонезные или томатные соусы. В небольших количествах при частом потреблении данный консервант способен спровоцировать аллергические реакции, следствием которых становятся серьёзные заболевания кожных покровов (крапивница), дыхательных путей (астма, ринит) [8], а также известны случаи увеличения гиперактивности [9]. При превышении допустимой нормы могут возникать более критичные последствия: нарушение когнитивных функций, нейротрансмиссии [10], развитие ацидоза, судорог и гиперпноэ [11]. Помимо вышеперечисленного, консерванты под кодом E210-E213 способны вызывать развитие онкологических заболеваний. Это происходит вследствие образования канцерогенного бензола - продукта реакции бензойной кислоты с витамином С (аскорбиновая кислота) [12]. Бензол является мутагеном, под действием которого изменятся митохондриальная ДНК, что и провоцирует раковые заболевания.

Сорбиновая кислота и её производные менее токсичны для человека, однако были выявлены случаи, в которых она является инициатором аллергических реакций, в том числе дерматита [13]. Известно также, что при попадании в организм человека в больших количествах пищевые добавки данной группы способны разрушать витамин B12, дефицит которого может стать причиной развития анемии, а также и различных неврологических расстройств [14].

Помимо аллергического воспаления кожных покровов, парабены обладают мутагенной активностью, провоцирующей рак молочной железы [15, 16]. К тому же, эти консерванты негативно воздействуют на эндокринную систему, вмешиваясь в функционирование такого гормона, как эстроген [17].

Пищевые добавки E220 - E228 относят к третьему классу опасности. Продукты, содержащие данные вещества, особенно противопоказаны людям, которые имеют предрасположенность к астме [18]. В концентрациях, превышающих норму, сульфиты способны оказывать пагубное влияние на дыхательную систему любого человека, вызывая такие заболевания как ринит, респираторный дистресс и другие [8, 19]. Кроме того, встречались случаи, когда диоксид серы являлся причиной непереносимости некоторых видов пищевых продуктов [20].

Негативное влияние нитратов заключается в том, что они имеют способность в мясных продуктах восстанавливаться до нитритов в присутствии нитратредуктазы. Нитриты, в свою очередь, под действием желудочного сока превращаются в N - нитрозoсоединения, которые являются канцерогенами и мутагенами [21, 22].

Таким образом, можно сделать вывод, что консерванты способны оказывать негативное влияние на здоровье человека не только в концентрациях, превышающих норму, но и в незначительных количествах. Поэтому контроль их наличия и содержания является важной задачей для химиков-аналитиков.

1.2 Методы определения бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах

В настоящее время разработано большое количество инструментальных методик определения синтетических консервантов в пищевых продуктах: электрокинетических [23, 24], спектрофотометрических [25-27], а также хроматографических [28-30].

Среди электрокинетических методов широкое распространение получил капиллярный электрофорез (КЭ). Метод основан на электромиграционном перемещении заряженных частиц, а также на электроосмосе раствора-носителя. На рисунке 1 показано разделение смеси двух компонентов (отрицательно заряженных) при помощи капиллярного электрофореза. В раствор-носитель (чаще всего это буфер) вводится анализируемый раствор, вдоль тонкого капилляра прикладывают электрическое поле, в результате чего возникает пассивное перемещение жидкости и движение заряженных частиц, а поскольку электромиграционные параметры различны для каждого сорта частиц, то проба разделяется на индивидуальные компоненты. Эффективность такого разделения достаточно высокая, это обуславливается тем, что такие мешающие факторы, как диффузия, сорбция, конвекция, перепад температур и другие в капилляре минимальны, так как внутренний радиус таких капилляров находится в диапазоне от 20 до 100 микрометров [31]. Для определения компонентов используются различные детекторы: спектрофотометрические, флуоресцентные, электрохимические.

Рисунок 1. Разделение фенилуксусной (A) и бензойной кислот (B) методом капиллярного электрофореза [31] (t - время миграции веществ, мин)



К достоинствам КЭ также можно отнести высокую селективность, низкую стоимость и экспрессность анализа [32], быстрое разделение компонентов, а также высокую эффективность (большое число теоретических тарелок) [33]. Несмотря на значительное количество преимуществ, данный метод обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, КЭ в редких случаях применим для образцов, не способных растворяться в водных или водно-спиртовых растворах. Во-вторых, при спектрофотометрическом детектировании наблюдается низкая чувствительность, что связано с малыми объёмами пробы и незначительной длиной оптического пути [34].

Спектрофотометрические методы исследования основаны на измерении спектров поглощения веществ в ультрафиолетовой (УФ) (200 - 400 нм) и видимой (400 - 750 нм) областях света. Образец раствора поглощает электромагнитное излучение от подходящего источника, при этом количество поглощённого излучения зависит от концентрации исследуемого соединения в растворе [35].

Для определения бензойной и сорбиновой кислот используется спектрофотометрия в УФ-области. Это очень простой, быстрый и дешёвый метод анализа. Однако зачастую требуется проанализировать не индивидуальный компонент, а смесь веществ, из-за этого возможно наложение их полос поглощения, что обуславливает погрешности идентификации. Отсюда и возникает основное ограничение УФ-спектрофотометрии [36]. Решение этой проблемы было найдено с помощью метода многомерной калибровки [37]. Однако, он не может быть применён, если ставится задача определения очень низких концентраций аналитов, или если объект исследования обладает сложной матрицей [38]. Также, данный метод является достаточно трудоёмким.

Наиболее популярными методами определения консервантов являются хроматографические методы с различными типами детектирования. Это обуславливается тем, что они универсальны, многокомпонентны, информативны, способны обеспечивать высокую чувствительность, экспрессность, легки в автоматизации, также при их реализации необходимы малые объёмы пробы [39].

Хроматография - метод разделения веществ, основанный на многократном распределении компонентов между фазами при их относительном перемещении в условиях, когда одна из фаз находится в диспергированном состоянии [40]. Существует большое разнообразие хроматографических методов. На основании литературных данных, для идентификации консервантов используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием в УФ-области (ВЭЖХ-УФ) [41], жидкостную хроматографию с масс-сспектрометрическим детектированием (ЖХ-МС) [42], мицеллярную электрокинетическую капиллярную хроматографию [43], газовую хроматографию с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ПИД) [44], газовую хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) [45], суперкритическую флюидную хроматографию [46].

1.3 Пробоподготовка при определении бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах

На сегодняшний день существует множество различных методов пробоподготовки, позволяющих увеличить эффективность определения консервантов в пищевых продуктах. Из литературных данных известно, что для обнаружения бензойной и сорбиновой кислот применяются жидкофазная экстракция (ЖФЭ) [47], жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ЖЖМЭ) [48], микродиализ [25], твёрдофазная микроэкстракция (ТФМЭ) [49]. Их основными недостатками являются трудоёмкость, длительность, большой расход реактивов.

В таблице 2 представлены варианты методов пробоподготовки различных пищевых продуктов при определении в них бензойной и сорбиновой кислот.

Таблица 2. Сравнительные характеристики методов определения бензойной и сорбиновой кислот

Объект исследования	Пробоподготовка	Метод детектирования	ПО, мг/л	ДОК, мг/л
Соки	Фильтрация, УЗ	ВЭЖХ-ДМД	7	20-180
Соевые соусы	ЖЖЭ	ВЭЖХ-УФ	0,2	20-100
Соки	ТФМЭ	ЖХ-УФ	0,003	0,001-3
Молоко	ТФМЭ	ИХ-КД	0,001	0,1-20
Напитки	Дериватизация	ФКТ	0,08	0-85,4
Газированные напитки	ТПМ	КР	3,6	25-500
Обработанное мясо, цукудани, безалкогольный напиток, молочный продукт и соленые огурцы	Микродиализ	Спектрофото-метрия	-	до 10
Соевые соусы	ЖЖЭ	КЭ-КД	0,01	0,04-2,44
Соевые соусы, уксус	ЖЖЭ, разбавление	КЭ-УФ	2,19	2,93-73,27
Йогуртные напитки	ДЖЖМЭ	ВЭЖХ-УФ	0,06Ч10-3	0,001-10
Сырое и обработанное молоко	Этерификация, УЗ	ГХ-ПИД	0,02	0,04-2,5
Безалкогольный напиток, чай	ГЖЖЭ-ВДГ	ВЭЖХ-УФ	0,0052Ч10-3	0,005-0,1

Очевидно, что наиболее распространёнными методами пробоподготовки являются экстракционные методы, особенно жидкостно-жидкостная экстракция. Однако, классическая ЖЖЭ трудно автоматизируется, требует больших объемов токсичных органических растворителей и весьма продолжительна по времени [56]. Кроме того, зачастую при анализе образуются устойчивые эмульсии, что мешает разделению фаз. Ещё одним недостатком жидкостной экстракции является слабое концентрирование аналита из водной фазы в органическую, что снижает предельные возможности метода [57]. Для устранения недостатков традиционной ЖЖЭ была разработана микроэкстракция, отличие которой заключается в том, что при её реализации отношение объёмов водной и органической фаз находятся на уровне [58].

Один из наиболее популярных вариантов жидкостной микроэкстракции - дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ДЖЖМЭ). В классическом варианте она предполагает введение в водную фазу пробы смеси экстрагента и диспергатора. Экстрагентом является органический растворитель нерастворимый в воде и обладающий низкой летучестью, обычно его плотность выше, чем у воды. Диспергатор, наоборот, должен быть растворим как в водной фазе, так и в фазе экстрагента. При быстром введении такого раствора через шприц благодаря диспергатору образуется стойкая эмульсия, в результате чего резко повышается площадь соприкосновения двух фаз по сравнению с классической жидкостно-жидкостной экстракцией. Для удаления эмульсии и выделения органической фазы чаще всего прибегают к центрифугированию [59]. На рисунке 2 представлена схема ДЖЖМЭ.

Рисунок 2. Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции

К основным её преимуществам можно отнести малый расход токсичных дорогостоящих растворителей, высокие коэффициенты концентрирования, простоту исполнения, и экспрессность. Однако наряду с её достоинствами, имеется ряд недостатков. Во-первых, диспергирующий растворитель, оставаясь в системе отрицательно влияет на процесс выделения аналитов в фазу экстрагента за счёт увеличения их растворимости в водной фазе. Во-вторых, к недостаткам можно отнести необходимость использования стадии центрифугирования и ограниченный набор подходящих органических растворителей, которые используются в качестве диспергаторов [60].

Авторы статьи [55] разработали методику пробоподготовки, основанную на дисперсионной микроэкстракции, для выделения и концентрирования бензоатов и сорбатов из йогуртов. В качестве диспергатора использовали этиловый спирт, экстрагентом был выбран октиловый спирт. Их предварительно смешивали, а затем вводили в раствор пробы, который содержал соль, обеспечивающую эффект высаливания. После чего, перемешивали, центрифугировали и анализировали с помощью ВЭЖХ-УФ.

Интересным является способ пробоподготовки молока, основанный на проведении этерификации in situ: 3 мл молока смешивали с 3 мл метанола и 1 мл концентрированной серной кислоты для образования метилового эфира бензойной кислоты, полученный раствор подвергали ультразвуковому воздействию в течение 15 минут. Затем, одну минуту перемешивали с помощью магнитной мешалки с 3 мл 10 %-ого раствора карбоната калия для удаления того количества аналита, которое не вступило в реакцию. На заключительном этапе проводили экстракцию полученного эфира 5 мл гексана с последующим ГХ-ПИД анализом [44].

В исследовании [32] была разработана пробоподготовка для уксуса и соевого соуса с целью определения в них 5 органических кислот, в том числе бензойной и сорбиновой. Её суть заключалась в экстракции липидов из 2 мл раствора образца в 1 мл тетрахлоруглерода, которые оказывали мешающее влияние на определение аналитов. Полученный водный раствор разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10, затем фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм и проводили определение кислот методом КЭ-УФ.

Как уже было отмечено ранее, твёрдофазная микроэкстракция также входит в число экстракционных методов при определении бензойной и сорбиновой кислот. Так, например, её возможности продемонстрированы в работе [52], где пробоподготовка молока предполагала предварительное смешение пробы с ацетонитрилом (1:1), после чего полученную смесь выдерживали в УЗ-ванне в течение 10 минут, а затем ещё 10 минут подвергали центрифугированию. Полученный супернатант отфильтровывали, пропускали через активированную колонку С18, и проводили элюирование бензойной кислоты с колонки с последующим её определением методом ИХ-КД. Однако твёрдофазная экстракция имеет один существенный недостаток - неполная десорбция соединений, что приводит к искажениям результатов [61].

1.4 Оптимизация условий. Дизайн эксперимента

Основной задачей при разработке методов пробоподготовки является оптимизация условий. Традиционные методы исследований требуют значительных трудозатрат, так как основаны на большой серии экспериментов, предполагающих поочерёдное варьирование отдельных независимых факторов, в то время, как остальные фиксируют. Выводы, полученные на основании подобного планирования, в большинстве случаев являются случайными, а следовательно, и условия далеки от оптимальных [62]. Таким образом, классический подход не всегда эффективен.

В настоящее время широко используют статистические методы дизайна эксперимента, которые позволяют за минимальное число экспериментов подобрать подходящие условия [63].

Планирование начинается с определения факторов, влияющих на ход эксперимента. Значения или уровни для этих факторов выбирают таким образом, чтобы они были отличны друг от друга, но не слишком сильно, чтобы это не привело к снижению эффективности поиска оптимальных условий. После, строят матрицу дизайна, в которой столбцы - это значения параметров, а строки - условия эксперимента [64, 65]. Общее количество экспериментов рассчитывается по формуле:

, (1)

где - число экспериментов; - число уровней факторов; - число факторов.

Столбцы матрицы заполняют так, чтобы они были ортогональны, к тому же значения факторов должны быть сбалансированы. Пример матрицы трёхфакторного двухуровневого дизайна эксперимента представлен в таблице 3 [66]. Как правило, для удобства значения факторов кодируют: например, минимальному значению условно присваивают «-1», максимальному - «+1», а промежуточному - «0» [67].

Таблица 3. Полный трёхфакторный двухуровневый дизайн с матрицей планирования

Номер эксперимента	Фактор 1	Фактор 2	Фактор 3	Матрица дизайна
1	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2	+	+	-	+	+	+	-	+	-	-	-
3	+	-	+	+	+	-	+	-	+	-	-
4	+	-	+	+	+	-	+	-	-	+	+
5	-	+	-	+	-	+	-	-	-	+	-
6	-	+	+	+	-	+	+	-	+	-	+
7	-	-	-	+	-	-	-	+	-	-	+
8	-	-	+	+	-	-	+	+	+	+	-

Выполняют серию этих экспериментов. Затем, создаётся математическая модель, которая соотносит экспериментально измеренный отклик (оптическая плотность, площадь хроматографического пика, разность потенциалов и т.п.) и величину фактора (температура, рН, масса катализатора и т.п.). В итоге, получается уравнение взаимосвязи между независимыми переменными и откликом:

, (2)

где - значения факторов; - линейные коэффициенты; - коэффициенты двойного взаимодействия; - отклик.

Также, данную зависимость (2) можно представить и в матричном виде:

, (3)

где - матрица дизайна.

Коэффициенты находят из уравнения (2) следующим образом:

, если - квадратная матрица; (4)

, если - неквадратная матрица. (5)

На основании полученных коэффициентов определяют значимость фактора: чем выше численное значение коэффициента, тем сильнее параметр влияет на процесс, а близость значения коэффициента к нулю, говорит о его незначительном воздействии, если значение отрицательное - то фактор негативно сказывается на процессе. Также, зная коэффициенты в уравнении (2) или (3), можно прогнозировать результаты эксперимента для новых условий [66, 68].

Если количество факторов велико, то учёт всех коэффициентов приводит к тому, что количество экспериментов возрастает. И, зачастую, полученная информация избыточна и не актуальна для экспериментатора.

Обычно наибольшей значимостью обладают линейные коэффициенты, а коэффициенты взаимодействий, начиная с тройных и выше, часто не так важны. Поэтому стараются сократить число опытов так, чтобы матрица дизайна эксперимента оставалась оптимальной. Такое планирование называют дробным факторным экспериментальным дизайном. Дробный факторный план является наиболее распространённым в настоящее время, поскольку значительно сокращает время исследования, при этом оставаясь эффективным при планировании эксперимента [70].

Синтетические консерванты находят широкое применение в пищевой промышленности, вследствие чего необходим контроль их содержания, поскольку они способны оказывать токсическое воздействие на организм человека.

На сегодняшний день разработано большое количество экспериментальных методик определения консервантов в пищевых продуктах. Почётное место среди них занимает дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, которая представлена в различных вариантах. ДЖЖМЭ обладает множеством достоинств, основным из которых является повышение эффективности концентрирования за счёт увеличенной площади соприкосновения фаз вследствие диспергирования экстрагента. Однако у неё есть и явный недостаток - наличие диспергатора, негативно влияющего на процесс выделения аналитов в фазу экстрагента. К тому же, необходимость центрифугирования увеличивает время анализа.

Среди инструментальных методов предпочтение по праву отдаётся хроматографическим методам анализа с различными типами детектирования, поскольку они способны обеспечить многокомпонентный, высокоинформативный, универсальный, быстрый, легко автоматизируемый анализ. Стоит также отметить, что государственные стандарты рекомендуют проводить определение консервантов и красителей в пищевых продуктах методом жидкостной экстракции с последующим ВЭЖХ-УФ детектированием [71, 72].

Оптимизация условий анализа с помощью статистического дизайна эксперимента, позволяющего за минимальное число экспериментов, подобрать оптимальные условия, является значительным преимуществом при разработке методики определения аналитов в объектах исследования.

Для определения бензойной и сорбиновой кислот было разработано большое количество методов идентифицирования их в пищевой и косметической продукции, однако, учитывая сложность матрицы пищевых продуктов, разработка простых высокоэффективных методов пробоподготовки всегда остаётся актуальной задачей. Кроме того, в настоящее время уделяется большое внимание «зеленой» аналитической химии, что вызывает стремление к созданию экологически-безопасных методов, исключающих работу с токсичными реагентами.



Глава 2. Методика экспериментальных исследований

2.1 Средства измерений и оборудование

1. ВЭЖХ анализ проводился с помощью жидкостного хроматографа LC - 20 Prominence (Shimadzu, Япония) с фотометрическим детектором при длине волны 230 нм. Хроматографическое разделение осуществлялось на колонке Phenomenex C18 (250 Ч 4,6 мм, размер частиц 5мкм) в изократическом режиме при температуре 43?C. Подвижная фаза представляла собой смесь метанола и 0,05 М ацетата аммония в соотношении 30:70. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин.

2. Электронные весы «Ohaus Pioneer PA214C» (Китай), 2-ой класс точности, предел взвешивания 210 г, погрешность 0,1 мг.

3. Термостат LOIP LT-910, диапазон рабочих температур 10-150 ^оС.

2.2 Реактивы и материалы

При выполнении экспериментальной части работы были использованы следующие реактивы:

1. Бензойная кислота, х.ч., ГОСТ 10521-78 ;

2. Сорбиновая кислота, х.ч., ГОСТ 32779-2014;

3. Ментол х.ч.;

4. Метанол о.с.ч. (Sigma-Aldrich);

5. Ацетат аммония х.ч.; ГОСТ 3117-78;

6. Серная кислота, х.ч., ГОСТ 4204-77;

7. Сульфат натрия, х.ч. по ГОСТ 4166-76;

8. Хлорид натрия, х.ч., ГОСТ 4233-77;

9. Аскорбиновая кислота, ч.д.а.;

10. Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 908-2004;

11. Хлорид алюминия, х.ч., ГОСТ 3759-75;

12. Глюкоза, х.ч., ГОСТ 975-88;

13. Октан-1-ол, ч.д.а. («Эколан», Россия);

14. Яблочная кислота, х.ч., ГОСТ 32748-2014;

15. Янтарная кислота, х.ч., ГОСТ 6341-75;

16. Винная кислота, х.ч., ГОСТ 5817-77;

17. Щавелевая кислота, х.ч., ГОСТ 22180-76;

18. Рутин, х.ч. (Alfa Aesar);

19. Изопропиловый спирт, о.с.ч. (Sigma-Aldrich);

20. Ацетонитрил, о.с.ч. (Sigma-Aldrich).

2.3 Приготовление растворов

Приготовление 100 мг/л растворов бензойной и сорбиновой кислот

В химический стакан помещали 0,01 г каждой из кислот и растворяли в 300 мкл метанола. После полного растворения навески кислоты, раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, стакан промывали тремя порциями деионизованной воды по 5 мл, доводили объём раствора в колбе до метки деионизованной водой и тщательно перемешивали. Исходные растворы хранили в холодильнике. Рабочие растворы готовили ежедневно путём последовательного разбавления исходных растворов дистиллированной водой.

Приготовление 25 мг/л раствора смеси бензойной и сорбиновой кислот с рН=2

В мерную колбу объёмом 50 мл помещали по 12,5 мл каждого из растворов кислот с концентрацией 100 мг/л и 5 мл раствора серной кислоты с концентрацией М (рН=1), доводили объем раствора до метки деионизованной водой и тщательно перемешивали.



2.4 Пробоотбор и подготовка

Детские соки, газированные напитки и соевый соус были приобретены в местных супермаркетах. Все соки, газированные напитки были различных марок и вкуса. Предварительной пробоподготовки перед анализом не проводилось, несмотря на то, что некоторые соки содержали мякоть, а газированные напитки - красители.

Реальные образцы с добавкой бензойной кислоты (100 мг/л) готовили следующим образом: в химический стакан помещали 0,001 г кислоты и растворяли в 300 мкл метанола. После полного растворения навески кислоты, раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, стакан промывали тремя порциями соответствующего продукта по 1,5 мл, доводили объём раствора в колбе до метки соком и тщательно перемешивали. При необходимости получения более низкой добавки аналита - образцы разбавляли соответствующим продуктом питания.

Образцы с введенной добавкой смеси бензойной и сорбиновой кислот готовили аналогичным образом.

2.5 Приготовление экстракционных виал

Для приготовления экстракционных виал ментол в термостойком стакане нагревали в термостате при температуре 45 ?C до перехода его в жидкое агрегатное состояние. Дозатором отбирали ментол объёмом 100-300 мкл, аккуратно помещали на дно эппендорфа. Оставляли открытым сосуд с жидким ментолом при комнатной температуре на 20 минут до полного застывания экстрагента. Приготовленные виалы хранили при комнатной температуре в закрытом эппендорфе. Срок годности - не ограничен.



Глава 3. ВЭЖХ-УФ определение бензойной кислоты в соках с предварительным микроэкстракционным концентрированием

3.1 Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции бензойной кислоты

В данной работе был разработан новый вариант дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Основным преимуществом, которого является отсутствие диспергирующего растворителя, который, как было показано в главе 1, уменьшает коэффициенты распределения гидрофобных аналитов в экстрагенте. Реализовать данный подход удалось благодаря такому свойству экстрагента, как относительно низкая температура плавления. Первое упоминание об использовании растворителей с таким свойством найдено в работе М. Сатака и др. [53]. Авторы разработали метод жидкостно-жидкостной экстракции металлов в нафталин с последующим выделением твердой фазы экстрагента. Для этого металл экстрагировали в виде комплекса расплавленным нафталином при высокой температуре и перемешивании; после застывания фазы экстрагента путем понижения температуры, её отделяли от водной фазы фильтрованием, растворяли в диметилформамиде, смешивали с электролитом и проводили определение методом полярографии.

В рамках данного исследования в качестве экстрагента с низкой температурой плавления использовали ментол, свойства которого представлены в таблице 4. Он представляет собой прозрачное вещество, которое можно получить, выделив из эфирного масла мяты, что делает его привлекательным с точки зрения «зелёной» химии [73].



Таблица 4. Структурная формула и физические свойства ментола

Структурная формула	Температу-ра плавления, °С	Темпе-ратура кипения, °С	Моляр-ная масса, г/моль	Плотность,	Раство-римость в воде	Раство-римость в спиртах
	41-44	212	156,27	0,89	Малорас-творим	Хорошо раство-рим

Рисунок 3. Схема определения бензойной кислоты в соках

На рисунке 3 представлена схема разработанного метода. Согласно данной схеме, жидкую пробу помещали в экстракционную виалу, приготовленную по п. 2.5. Затем виалу выдерживали в термостате при температуре выше температуры плавления ментола. По мере нагревания системы, экстрагент, плотность которого меньше плотности воды, поднимался вверх. В результате на поверхности раствора пробы появлялась отдельная фаза экстрагента, с выделенным в неё аналитом. Органическую фазу отбирали, добавляли к ней метанол (1:1) во избежание последующего застывания ментола, и анализировали методом ВЭЖХ-УФ.

3.2 Выбор условий ВЭЖХ-УФ определения бензойной кислоты

Важным этапом работы оказался выбор условий ВЭЖХ-УФ анализа.

На первоначальном этапе условия определения бензойной кислоты были выбраны на основании литературных данных [25]: детектирование проводилось при длине волны 230 нм в изократическом режиме на колонке на основе силикагеля. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрила и фосфорной кислоты (5 мМ) в отношении 40:60 соответственно. Скорость потока фазы составляла 1 мл/мин. Температура колонки поддерживалась при постоянном значении, которое составляло 43 °С, во избежание застывания ментола в колонке.

Однако, на этапе изучения мешающего влияния компонентов матрицы пробы, было установлено, что сорбиновая кислота также способна экстрагироваться в ментол, при этом реализуемые условия ВЭЖХ-УФ анализа не обеспечивают разделение пиков двух кислот.

Поэтому, условия ВЭЖХ-УФ определения бензойной кислоты (а в последствии и сорбиновой кислоты) были взяты из литературных данных [47]: в качестве подвижной фазы использовалась смесь метанол:ацетат аммония (0,05 М) в соотношении 30:70, стационарная фаза представляла собой колонку с привитыми октадецильными группами. Режим разделения - изократический, длина волны - 230 нм, скорость потока фазы - 0,5 мл/мин. Времена удерживания бензойной и сорбиновой кислот составляли =8,4 мин и =10,4 мин соответственно (рис. 4).



Рисунок 4. Хроматограмма определения бензойной и сорбиновой кислот = 25 мг/л, = 25 мг/л) в соках.

3.3 Выбор оптимальных условий микроэкстракционного извлечения бензойной кислоты

Выбор оптимальных условий осуществлялся в соответствии с дробным двухуровневым многофакторным дизайном эксперимента. Как было показано в главе 1, применение статистических подходов к планированию эксперимента позволяют за минимальное число экспериментов выявить подходящие условия проведения анализа.

На основании экспериментальных и литературных данных, были определены факторы, которые способны оказывать влияние на микроэкстракцию бензойной кислоты. К таким были отнесены: объём экстрагента, объём раствора образца, рН, температура нагревания системы, и наличие или отсутствие высаливающего реагента (сульфат натрия с концентрацией в растворе 1 г/л).

Изначально каждый из этих факторов рассматривался на двух граничных уровнях, значения которых приведены в таблице 5. Для того, чтобы в дальнейшем коэффициенты рассматривать на одном уровне, значения факторов кодировали: «+1» соответствовал максимальному значению из рассматриваемого диапазона, а «-1» - минимальному.

Таблица 5. Кодированные значения факторов

, мкл	, мл		T, °C
100	300	1	10	1	7	45	70	есть	нет
-1	+1	-1	+1	-1	+1	-1	+1	-1	+1

Выбор граничных условий температуры связан с температурой плавления ментола, взятой с учётом погрешности нагревания прибора (нижняя граница), и ограничениями возможностей оборудования (верхняя граница). Диапазон значений рН был выбран в кислой области для предотвращения диссоциации бензойной кислоты. Эффект высаливания изучался на двух категориальных уровнях. Объём экстрагента рассматривался от минимального для возможности последующего его отбора из системы до максимально разумного (в целях сокращения расхода реагента). Объём образца исследовался в таком диапазоне, чтобы при этом обеспечить экспрессность анализа.

Далее была составлена матрица дизайна, представленная в таблице 6. Используя дробный факторный анализ, число экспериментов составило 16.

Таблица 6. Матрица дробного пятифакторного двухуровневого дизайна эксперимента.

№ эксперимента		T	pH				T*pH	T*	T*	T*	pH*	pH*	pH*	*	*	*
1	1	-1	-1	-1	-1	1	1	1	1	-1	1	1	-1	1	-1	-1
2	1	-1	-1	-1	1	-1	1	1	-1	1	1	-1	1	-1	1	-1
3	1	-1	-1	1	-1	-1	1	-1	1	1	-1	1	1	-1	-1	1
4	1	-1	-1	1	1	1	1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1	1	1
5	1	-1	1	-1	-1	-1	-1	1	1	1	-1	-1	-1	1	1	1
6	1	-1	1	-1	1	1	-1	1	-1	-1	-1	1	1	-1	-1	1
7	1	-1	1	1	-1	1	-1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1
8	1	-1	1	1	1	-1	-1	-1	-1	1	1	1	-1	1	-1	-1
9	1	1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	-1	1	1	1	1	1	1
10	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1	1	1	-1	-1	-1	-1	1
11	1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	-1	1	-1
12	1	1	-1	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	-1	1	1	-1	-1
13	1	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1	-1	-1	1	1	-1	-1
14	1	1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	-1	1	-1	-1	1	-1
15	1	1	1	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1	-1	-1	-1	-1	1
16	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

После выполнения каждого эксперимента (n=3), были получены отклики (значения площадей хроматографических пиков), на основании которых были рассчитаны коэффициенты регрессии, связывающие значения отклика и факторы, влияющие на методику определения. Их значения представлены в таблице 7.

Таблица 7. Коэффициенты регрессии, полученные для кодированной матрицы при дробном факторном планировании.

	T	pH				Т*pH	Т*
3560,56	-1116,06	-703,94	21,06	-1020,56	-248,94	244,94	-238,06
Т*	Т*	pH*	pH*	pH*	*	*	*
254,31	71,19	-396,44	122,19	408,31	-91,06	-2,44	449,94

На основании полученных коэффициентов можно сделать следующие выводы:

Ш самым важным параметром является температура и, поскольку соответствующий коэффициент имеет отрицательный знак, чем ниже температура - тем выше эффективность извлечения. Таким образом, для дальнейшего исследования температура термостатирования составила 45 °С;

Ш более низкий объем экстрагента обеспечивает лучшую эффективность выделения бензойной кислоты;

Ш чем ниже значение рН, тем лучше извлечение;

Ш следующий наиболее важный коэффициент после рН - коэффициент взаимодействия между объемами экстрагента и образца;

Ш также важны взаимодействия между рН и объемом рвствора образца, и между рН и солью;

Ш остальные коэффициенты, по меньшей мере, в два раза меньше и, таким образом, имеют ограниченное влияние на результат эксперимента;

Ш эффекта высаливания не наблюдалось, поэтому соль не использовалось в дальнейших экспериментах.

Принимая во внимание значения коэффициентов взаимодействия между pH, объёмом экстрагента и объёмом образца, было сделано другое планирование эксперимента, включающее эти параметры. На этот раз, это был полный факторный дизайн для трех параметров по двум уровням. Значения рН составляли 1 и 2 для более подробного изучения его влияния в кислой области, объем растворителя составлял 100 и 200 мкл, объем образца - 1 и 2 мл. Матрица дизайна представлена в таблице 8. Таким образом, еще восемь экспериментов было проведено при фиксированной температуре 45 °С и без высаливающего агента (n=3).

Таблица 8. Матрица полного трёхфактороного двухуровневого дизайна эксперимента

Номер эксперимента		pH			pH*	pH*	*	pH**
1	1	1	1	1	1	1	1	1
2	1	1	1	-1	1	-1	-1	-1
3	1	1	-1	1	-1	1	-1	-1
4	1	1	-1	-1	-1	-1	1	1
5	1	-1	1	1	-1	-1	1	-1
6	1	-1	1	-1	-1	1	-1	1
7	1	-1	-1	1	1	-1	-1	1
8	1	-1	-1	-1	1	1	1	-1

На основании полученных откликов (площадь хроматографических пиков бензойной кислоты) были рассчитаны соответствующие коэффициенты регрессии (Таблица 9).

Таблица 9. Коэффициенты регрессии, полученные для кодированной матрицы при полном факторном проектировании

	pH	Vэкстрагента	Vобразца	pH*Vэкс-трагента	pH*Vобразца	Vэкстра-гента*Vоб-разца	pH*Vэкс-трагента* Vобразца
6248,25	117,75	-867,25	1662,5	7,75	-253	-160	-46

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы:

Ш объем раствора образца, равный 2 мл, обеспечивает лучшее извлечение аналита в фазу экстрагента;

Ш объем экстрагента 100 мкл приводит к более эффективному концентрированию бензойной кислоты;

Ш в указанном диапазоне рН не оказывает влияния на эффективность экстракции;

Ш взаимодействия между параметрами не существенны.

На основании результатов двух приведенных выше серий экспериментов были выбраны следующие оптимальные условия пробоподготовки: температура нагревания системы 45 °С, pH 2, объём экстрагента 100 мкл, объём раствора образца 2 мл.

3.4 Изучение мешающего влияния матрицы сока

Было изучено мешающее влияние сорбиновой, аскорбиновой, лимонной, янтарной, яблочной, винной, щавелевой кислот, солей (хлорид алюминия, хлорид натрия, сульфат натрия), глюкозы и сахарозы, рутина, как возможных компонентов матрицы сока. Допустимая концентрация каждого мешающего агента считается менее 5 % относительной погрешности сигнала.

Было обнаружено, что все изученные вещества не влияют на определение бензойной кислоты даже при их 1000-кратном избытке.

Кроме того, использование ментола в качестве экстрагента при анализе реальных образцов обеспечивает появление единственного на хроматограмме пика бензойной кислоты (рис. 5).

Рисунок 5. Хроматограмма, полученная при определении бензойной кислоты ( = 25 мг/л) в соках с помощью разработанного метода

3.5 Аналитические характеристики разработанной схемы

В выбранных оптимальных условиях эксперимента были изучены следующие параметры: диапазон определяемых концентраций, предел обнаружения, коэффициент корреляции и повторяемость. Градуировочный график, построенный по семи точкам, линеен в области концентраций от 0,5 до 100 мг/л и выражается уравнением: Площадь пика = 285,6*[Концентрация бензойной кислоты] - 73,4 (R²=0,996) (рис. 6). Предел обнаружения по 3у, составил 0,15 мг/л.



Рисунок 6. Градуировочная зависимость для определения содержания бензойной кислоты с применением предложенной схемы анализа

Повторяемость характеризовалась при помощи среднеквадратичного отклонения (СКО), которое рассчитывалось по полученным данным в течение 5 дней. Таким образом, СКО составило 3-6 % и 4-8 % для 1 и 25 мг/л соответственно. Аналитические характеристики разработанного метода приведены в таблице 10.

Таблица 10. Аналитические характеристики разработанной схемы

Параметр	Значение параметра
Объём экстрагента, мкл	100
Объём пробы, мл	2
Диапазон определяемых концентраций, мг/л	0,5-100
Предел обнаружения, мг/л	0,15
Коэффициент корреляции	0,996
СКО, % (n=3)	3-8
Продолжительность экстракции, мин	3

Время процедуры пробоподготовки составляет 3 минуты. Описанный метод извлечения является простым, легким, быстрым, недорогим и не требует сложного оборудования. Ментол обеспечивает селективное извлечение бензойной кислоты.

3.6 Испытание разработанной схемы анализа на реальных образцах

Разработанный метод был продемонстрирован на примере определения бензойной кислоты в детских соках. На упаковках приобретенных напитков было указано, что они не содержат консервантов. Концентрации целевого аналита в реальных образцах, полученных стандартным методом добавления, приведены в таблице 11. Был обнаружен только один образец (ягодный сок), содержащий бензойную кислоту. Это можно объяснить тем, что некоторые ягоды, например, морошка, содержат её в естественном виде.

Правильность полученных результатов была подтверждена референтным методом. В качестве референтного метода была выбрана классическая дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракия с ВЭЖХ-УФ детектированием [55]. Пробоподготовка осуществлялась следующим образом: к 5 мл раствора сока, полученного предварительным разбавлением пробы сока дистиллированной водой в пять раз, добавляли 1 г NaCl, а также раствор серной кислоты в таком количестве, чтобы рН сока было равно 3 (кислотность контролировали с помощью индикаторной бумаги). Затем, в данный раствор вводили смесь, состоящую из 500 мкл метанола (диспергатор) и 100 мкл октилового спирта (экстрагент). Виалу с раствором образца и смесью экстрагентов трясли в течение 2 минут на шейкере, а затем центрифугировали в течение 10 минут при скорости 4000 об/мин. После этого, 20 мкл поднявшейся фазы экстрагента отбирали с помощью микродозатора и анализировали на ВЭЖХ-УФ. Подвижная фаза состояла из ацетатного буфера (0,2 М; pH=4,4) и ацетонитрила (50:50). Разделение проводили со скоростью потока 1 мл/мин при длине волны 225 нм.

Результаты, полученные с помощью двух методов были сравнены с помощью t- и F-тестов. Полученные F-значения ? 19 указывают на незначительное различие в величинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ? 2,78 указывают на то, что нет статистически значимого различия между результатами, полученными при помощи двух методов. Данные представлены в таблице 11.

Таблица 11. Сравнение результатов определения бензойной кислоты, полученных при помощи разработанного и референтного методов (n=3, P=0,95; F_k = 19,00; t_k = 2,78)

Образец	Концентрация бензойной кислоты, мг/л	t-критерий	F-критерий
	Добавка	Разработанный метод	Референтный метод
Яблочный сок	0	?ПО	?ПО
	1	1,17±0,26	1,27±0,34	0,44	1,47
	10	10,40±0,57	9,67±0,22	2,77	6,86
	25	24,73±0,46	24,87±0,65	0,42	1,97
Мультифруктовый сок	0	?ПО	?ПО
	1	1,07±0,22	1,03±0,36	0,20	2,71
	10	10,00±0,66	10,77±0,65	2,07	1,03
	25	24,73±0,30	24,67±0,22	0,45	1,86
Апельсиновый сок	0	?ПО	?ПО
	1	1,08±0,30	1,13±0,36	0,67	1,95
	10	10,60±0,57	10,87±0,82	0,66	2,02
	25	24,87±0,79	25,07±0,30	0,59	7,00
Вишнёвый сок	0	?ПО	?ПО
	1	0,93±0,30	0,87±0,08	0,53	13,00
	10	10,00±0,66	10,13±0,50	0,40	1,70
	25	25,00±0,57	24,67±0,22	1,35	6,86
Ягодный сок	0	13,50±0,38	13,27±0,58	0,84	2,33
	1	14,66±0,36	14,63±0,48	0,73	2,58
	10	23,80±0,66	23,87±0,60	0,19	1,21
	25	38,63±0,60	38,00±0,52	1,99	1,33



4. Схема ВЭЖХ-УФ определения бензойной и сорбиновой кислот в пищевых продуктах с предварительным микроэкстракционным концентрированием

4.1 Схема дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции бензойной и сорбиновой кислот с застыванием фазы экстрагента

При изучении мешающего влияния компонентов матрицы сока (п. 3.4.) было установлено, что сорбиновая кислота также способна экстрагироваться в ментол, в этом случае при оптимизированных ВЭЖХ-УФ условиях, она представлена отдельным пиком на хроматоргамме (п. 3.2.). Сорбиновая кислота и её соли, как было отмечено в п.1.1., являются консервантами, оказывающими негативное влияние на здоровье человека [75]. В связи с этим, была рассмотрена идея разработать метод выделения и концентрирования не только бензойной, но и сорбиновой кислот, а также их солей, из сложных по составу матриц жидкофазных пищевых продуктов.