Отбор штаммов базидиальных и микромицелиальных грибов для биопалпинга древесных субстратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Отбор штаммов базидиальных и микромицелиальных грибов для биопалпинга древесных субстратов

Шарапова Ирина Эдмундовна Лаборатория биохимии и биотехнологии. Институт биологии Коми научного центра УрО РАН.

Аннотация

Перспективность использования штаммов-продуцентов для биопалпинга определяется способ-ностью к биоконверсии растительного сырья за счет комплекса лигно-целлюлозолитических ферментов. Работа проводилась с базидиальными и микромицелиальными грибами с целью определения наиболее перспективных штаммов для предварительной обработки (биопалпинга) различных древесных субстратов в сочетании с химическими методами их обработки. Проведен скрининг некоторых штаммов микромицелиальных грибов родов Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Beaveria на способность к деградации лигноцеллюлозы в соответствии с методами тестирования.

В группе микромицетов определены штаммы, проявляющие наибольшую оксидазную и целлюлозолитическую активность на агаризованных средах с галловой кислотой и карбоксиметилцеллюлозой. В ряду повышения оксидазной активности выделенные штаммы расположены: Fusarium sp. < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum (F-98) < Beauveria bassiana (F-145). В ряду повышения целлюлазной активности эти штаммы расположены: Fusarium sp. < Beauveria bassiana < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum. Проведена сравнительная оценка роста и способности выделенных штаммов грибов при твердофазной ферментации на древесной массе хвойных пород в течение 7, 14 и 23 суток.

Модификацию химическими реагентами лигноцеллюлозных субстратов провели обработкой щелочью и кислотой, а также органическими растворителями. Обнаружено, что наиболее адаптированными субстратами для твердофазной ферментации выделенными штаммами грибов являются опилки хвойных пород древесины, обработанные щелочным гидролизом, а также с обработкой обессмоливанием и щелочью. Впервые для целей биопалпинга рассмотрена возможность применения штамма Beauveria bassiana, относящегося к группе энтомопатогенных грибов. Отобраны штаммы микромицетов Penicillium sp. и Trichoderma lignorum, а также штаммы базидиомицетов Panus tigrinus (F-8/18) и Pleurotus еryngii, которые обладают высокой лигно-целлюлозолитической активностью и способностью к биоконверсии трудно гидролизуемых древесных субстратов.

Ключевые слова: биопалпинг, грибы, лигноцеллюлозные материалы, твердофазная ферментация, оксидазная и целлюлазная активность.

Abstract

Prospects of using producer strains for biopulping is evidenced by plant materials' bioconversion ability due to a complex of lignocellulolytic enzymes. The research was performed using basidiomycetes and micromycetes to determine the most promising strains for pretreatment (biopulping) of various wood substrates along with chemical treatment methods. Screening of some strains of fungi of Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Beaveria genera has been performed to find their ability to degrade lignocellulose in accordance with testing methods. Strains with maximum oxidase and cellulase activity on agar media with gallic acid and carboxymethyl cellulose have been selected out of the group of micromycetes.

In the order of oxidase activity increase, Selected strains are positioned as follows: Fusarium sp. < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum (F-98) < Beauveria bassiana (F-145). In the order of cellulase activity increase, these strains are positioned as follows: Fusarium sp. < Beauveria bassiana < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum. Comparative assessment of growth of selected strains of fungi during solid phase fermentation on softwood pulp in the course of 7, 14 and 23 days. Modification of lignocellulosic substrates with chemicals was performed using alkali and acid, as well as with organic solvents. It was found that softwood dust after treatment by alkaline hydrolysis, as well as after resin extraction and alkali treatment, is the most adapted substrate for solid state fermentation with selected strains of fungi. For the first time, use of strain of Beauveria bassiana, which belongs to entomopathogenic fungi group, has been considered for the purposes of biopulping. Strains of micromycetes Penicillium sp. and Trichoderma lignorum, as well as strains of basidiomycetes Panus tigrinus (F-8/18) and Pleurotus еryngii have been found that demonstrate high lignocellulosic activity and bioconversion ability of poorly hydrolysable wood substrates.

Keywords: biopulping, fungi, lignocellulosic materials, solid state fermentation, oxidase and cellulase activity.

Введение

В настоящее время лигно-целлюлозосодержащие материалы (ЛЦМ) являются одним из наиболее перспективных возобновляемых источников сырья для биоконверсии и получения продуктов, пригодных для применения в различных областях промышленности, в том числе в процессах получения биотоплива (биоэтанол) [1]. Производство биоэтанола включает предва-рительную обработку растительного сырья, ферментативный гидролиз субстрата и фермен-тацию [2, 3]. ЛЦМ имеют сложную молекулярную структуру, которая блокирует ферменты и, таким образом, предотвращает биоконверсию растительной массы в ферментируемые сахара. Сложность биологической конверсии заключается в структурных особенностях основных полимеров ЛЦМ, которые придают растительным тканям устойчивость к ферментам [4]. Наиболее трудно разлагаемым компонентом ЛЦМ является лигнин, состав которого зависит от вида древесины [5].

Степень направленной биоконверсии ЛЦМ зависит от эффективности предварительной обработки для удаления или модификации лигнина и высвобождения углеводов [6]. Предварительная обработка может быть выполнена с применением различных физико-химических методов, изменяющих кристалличность целлюлозы или способствующих удалению гемицеллюлозы и лигнина из матрицы клеточной стенки растения [7, 8]. При этом эффективность предварительной обработки заключается в обеспечении сочетания процессов делигнификации ЛЦМ и уменьшения потери углеводов, а также снижения количества ингибиторов ферментов и токсичных соединений, образование которых сопровождается в ходе физико-химических процессов [9]. Для этих целей ферменты, продуцируемые различными микроорганизмами, являются перспективной альтернативой для предварительной обработки ЛЦМ [10, 11]. За счет биоситеза ферментных комплексов, которые разрушают растительную биомассу, штаммы-продуценты обеспечивают экологически и экономически эффективную альтернативу [11]. Предварительная биологическая обработка, направленная прежде всего на делигнификацию ЛЦМ, также способствует удалению ингибиторов (в основном фенольных) последующих ферментативных процессов [12, 13].

Для эффективной предварительной обработки ЛЦМ важен подбор продуцентов, обеспечивающих биосинтез комплекса из целлюлозолитических и лигнолитических ферментов, участвующих в биотрансформации-биодеградации лигноуглеводных субстратов [14]. Наиболее известными продуцентами окислительных и гидролитических ферментов, отвечающих за расщепление лигноцеллюлозного комплекса, являются базидиомицеты [15]. Однако проблемы, связанные с медленным ростом в глубинной культуре [16], осложняют масштабирование и применение этой группы грибов. Биотрансформацию ЛЦМ, в том числе деструкцию лигнина древесины могут осуществлять представители несовершенных и сумчатых грибов, в частности грибы родов Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Penicillium и др. [17-19]. При этом уровень активности внеклеточных ферментов микроорганизмов различных таксономических групп имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность [15, 20]. Поэтому в изучении процесса биопалпинга актуальным является поиск продуцентов, обладающих прежде всего оксидазной активностью для направленной биоконверсии ЛЦМ.

Целью работы является скрининг штаммов грибов и оценка перспективности примене-ния для твердофазной ферментации (ТФФ) древесной массы в сочетании с обработкой химическими реагентами.

1. Экспериментальная часть

Для скрининга использовали штаммы микромицелиальных грибов: Trichoderma lignorum (ВКПМ F-98), Trichoderma lignorum (ВКПМ F-119); Beauveria bassiana (ВКПМ F-145); Penicillium ochrochloron (ВКМ F-1702), Penicillium sp.; Fusarium sp., Fusarium solani (ВКМ F-5.2), а также базидиальных грибов белой гнили: Panus tigrinus (ВКПМ F-8/18) и вешенки (промышленный штамм Pleurotus еryngii). В исследованиях использованы штаммы грибов, идентифицированные по морфо-физиологическим характеристикам с использованием определителей и интернет-ресурсов [21, 22].

Определение способности грибов к деградации целлюлозы проводили путем выращивания исследуемых штаммов на агаризованной минеральной среде с добавлением 1% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и обработкой после инкубирования раствором конго красного в соответствии с методиками [23-25]. Оксидазную активность штаммов (лакказы) по методу Бавендамма определяли в чашках Петри на агаризованном пивном сусле с галловой кислотой (0.4%) [25]. Для определения оксидазной и целлюлазной активности конидеальную массу или агаровые блоки с мицелием (3х3 мм) асептически помещали в чашки Петри с агаризованной средой. После инкубирования в течение 3-7 суток отмечали наличие окрашенных зон, их диаметр, отношение диаметра зоны к диаметру колонии.

Титр в культуральной суспензии определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) - проросших спор (фрагментов мицелия). Содержание биомассы в суспензии определяли весовым способом, в пробах объёмом 5 мл, по абсолютно сухой массе (г/л) [25, 26]. Глубинное культивирование грибов проводили в колбах объёмом 250 мл с объёмом среды 100 мл на круговой качалке при 150 об/мин, 24 °С, 5-7 суток на среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10.0; пептон - 3.0; КН₂РО₄ - 0.6; К₂НРО₄ - 0.4; MgSO₄ - 0.5; MnSO₄·7Н₂О - 0.05; ZnSO₄·7Н₂О - 0.001; FeSO₄·7Н₂О - 0.0005; вода водопроводная. Посев в питательную среду проводили агаровыми блоками мицелиальной массы штаммов грибов.

В качестве лигноцеллюлозных субстратов были использованы наиболее трудно гидролизуемые опилки хвойных пород древесины (многотоннажный отход лесопереработки деловой древесины). Модификацию химическими реагентами проводили обработкой щелочью и кислотой, а также органическими растворителями. Обессмоливание древесины (удаление экстрактивных веществ) проводили согласно классической в химии древесины методики [27] с применением нейтральных растворителей, не изменяющих состав древесины. Для обработки опилок применяли спирто-толуольную смесь (1:2), а также этилацетат, как нетоксичный растворитель. Обработку древесной массы, предварительно проэкстрагированной спирто-толуольной смесью, провели 5%-ным раствором азотной кислоты, а также щелочью (1М NaOH) с и без предварительного обессмоливания.

Для твердофазной ферментации (ТФФ) использовали древесную массу с и без обработки химическими реагентами (фракции 0.1-1 см). Опилки предварительно увлажняли до 60% водопро-водной водой и стерилизовали автоклавированием (1 атм, 15 мин). Обработку образцов древесной массы проводили инокулятами грибов с расчетом дозы внесения, где учитывали объем и содержание биомассы или титра, которые были определены для каждого штамма предварительно. Содержание биомассы и титра грибов варьировало (7±0.5)-(12±0.8) г/л и (1±0.5)•10^6-7 КОЕ/мл соответственно. ТФФ на различных образцах ЛЦМ, обработанных накопительными культурами грибов, проводили в емкостях, помещенных в термостат при Т = 25±2 ^oС и оценивали на 7, 14 и 23 сутки.

2. Результаты и обсуждение

Скрининг штаммов проведен чашечным методом на плотной питательной среде сравнительным анализом по степени оксидазной (лигниназной) и целлюлазной активностей в группах макро- и микромицетов. Результаты первого этапа скрининга представлены в табл. 1. Положительную реакцию Бавендамма показали все исследуемые грибы, за исключе-нием трех штаммов микромицетов. Для большинства исследованных штаммов грибов была характерна высокая сумма баллов, наибольшее ее значение составляло 18 баллов. Наивысшими суммами баллов (16-18) обладали 3 штамма из группы микромицетов, а также штаммы базидиомицетов. В группе микромицелиальных грибов наибольшей лигниназной активностью отмечен штамм энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana. В ряду повышения оксидазной активности группы микромицетов штаммы расположены: Fusarium sp. < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum (ВКПМ F-98) < Beauveria bassiana. В ряду повышения целлюлазной активности этой группы микромицетов штаммы расположены: Fusarium sp. < Beauveria bassiana < Penicillium sp. ? Trichoderma lignorum (ВКПМ F-98). Для второго этапа скрининга были отобраны 3 штамма имеющие высокие значения суммы баллов.

Табл. 1. Результаты скрининга штаммов грибов на наличие целлюлозо- и лигнолитической активности (в баллах)

Примечания: По интенсивности роста: 0 баллов - отсутствие признаков роста, 1 балл - слабый рост, 2 балла - умеренный рост, 3 балла - значительный рост. Баллы «отношение диаметра зоны просветления/потемнения к диаметру колонии»: 0 баллов - отсутствие зоны просветления/потемнения, 4 балла - диаметр зоны просветления/потемнения меньше диаметра колонии (уже зоны растущего края мицелия), 5 баллов - диаметр зоны просветления/потемнения равен диаметру колонии (граница зоны просветления совпадает с растущим краем мицелия), 6 баллов - диаметр зоны просветления/потемнения больше диаметра колонии (шире зоны растущего края мицелия).

Второй этап скрининга заключался в оценке способности исследуемых штаммов грибов к деградации ЛЦМ. Оценивали колонизацию и рост грибов на древесных субстратах до и после обработки химическими реагентами (химически модифицированных субстратах). Для оценки роста колоний и дезорганизации субстратов применили четырехбальную систему по методике Билай [25]. Результаты представлены в табл. 2.

Отмечено, что наименьшей способностью к росту на древесных субстратах обладал штамм Beauveria bassianа, несмотря на то, что проявил значительную оксидазную активность на первом этапе исследований (табл. 1). Наибольшие показатели роста определены для вешенки, что подтверждает высокую лигно-целлюлозолитическую активность базидиальных грибов белой гнили. Микромицеты Penicillium sp. и Trichoderma lignorum (ВКПМ F-98) проявили значительную активность роста в отношении наиболее трудно гидролизуемых ЛЦМ - древесной массы хвойных пород. Данные штаммы микромицелиальных грибов, а также штаммы базидиомицетов предложены для дальнейших этапов исследования.

Табл. 2. Оценка роста штаммов грибов при твердофазной ферментации

Примечание: 0 баллов - отсутствие роста; 1 - слабый единичный рост; 2 - зональный рост (типичное спороно-шение или сплошной слабый рост); 3 балла - сплошной рост, обволакивание субстрата мицеллием, появление отдельных зон дезагрегации субстрата; 4 балла - обильный рост, образование обширных зон дезагрегации и растворения субстрата.

Выводы

Проведен скрининг 7 штаммов микромицелиальных грибов родов Trichoderma, Fusarium, Penicillium, Beaveria на способность к деградации лигноцеллюлозы в соответствии с методами тестирования.

Отобраны штаммы микромицетов, проявляющие наибольшую оксидазную (лигниназную) и целлюлозолитическую активность, а также способность к деградации ЛЦМ: Beauveria bassianа (ВКПМ F-145), Penicillium sp. и Trichoderma lignorum (ВКПМ F-98).

Показано, что для твердофазной ферментации грибов на опилках хвойных пород древесины наиболее адаптированными и перспективными субстратами являются химически модифицированные опилки, которые были обработаны щелочным гидролизом, а также щелочью и обессмоливанием.

биопалпинг древесный субстрат гриб

Литература

1. Arora R., Behera S., Kumar S. Bioprospecting thermophilic/thermotolerant microbes for production of lignocellulosic ethanol: a future perspective. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 2015. Vol.51. P.699-717.

2. Xu Z., Huang F. Pretreatment methods for bioethanol production. Applied biochemistry and biotechnology. 2014. Vol.174. No.1. P.43-62.

3. Putro J. N. et al. Pretreatment and conversion of lignocellulose biomass into valuable chemicals. RSC Advances. 2016. Vol.6. No.52. P.46834-46852.

4. Dashtban, M., Schraft, H., and Qin, W. Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives. Int. J. Biol. Sci. 2009. Vol.5. P.578-595.

5. Лигнины (структура, свойства и реакции). Под ред. Сарканяна К.В., Людвига К.Х. М.: Лесная промышленность. 1975. 652c.

6. Madadi M, Tu Y., Abbas A. Pretreatment of lignocellulosic biomass based on improving enzymatic hydrolysis. Int J Appl. Sci. Biotechnol. 2017. Vol.5. No.1. P.1-11.

7. Sharma R., Palled V., Sharma-Shivappa R.R., and Osborne J. Potential of potassium hydroxyde pretreatment of switchgrass for fermentable sugar production. Appl. Biochem. Biotechnol. 2011. Vol.28. P.616-626.

8. Banerjee G. et al. Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment / biomass feedstock combinations. Biotechnology for biofuels. 2010. Vol.3. No.1. P.22.

9. Rezende C. A. et al. Chemical and morphological characterization of sugarcane bagasse submitted to a delignification process for enhanced enzymatic digestibility. Biotechnology for biofuels. 2011. Vol.4. No.1. P.54.

10. Meyer A.S., Rosgaard L., Sшrensen H.R. The minimal enzyme cocktail concept for biomass processing. Journal of Cereal Science. 2009. Vol.50. No.3. P.337-344.

11. Behera S., Arora R., Kumar S. Bioprospecting the cellulases and xylanases thermozymes for the production of biofuels. In: Paper presented at AICHE annual meeting, San Francisco. 2013. 3-8 November.

12. Guo L.Q., Lin S.X., Zheng X.B. et al. Production, puri cation and characterization of a thermostable laccase from a tropical white-rot fungus. World J. Microbiol Biotechnol. 2011. Vol.27. P.731-735.

13. Giardina P. et al. Laccases: a never-ending story. Cellular and Molecular Life Sciences. 2010. Vol.67. No.3. P.369-385.

14. Xu X., Lin M., Zang Q., Shi S. Solid state bioconversion of lignocellulosic residues by Inonotus obliquus for production of cellulolytic enzymes and sacchari?cation. J. Bioresource Technology. 2018. Vol.247. P.88-995.

15. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондратенко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Т. 2. Ферменты, модели, процессы. М.: Наука. 2002.

16. Русинова Т.В. Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes. Автореф. дис. … канд. техн. наук. М. 2007.

17. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Васильченко Л.Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор). Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т.40. No.1. С.5-23.

18. Мокрушина Н.С., Тарасова Т.С., Дармов И.В. Биоконверсия древесных отходов методом компостирования с получением органического удобрения. Изв. Сам. научн. центра РАН. 2009. Т.11. No.1. С.228-232.

19. Пат. РФ 2355753. Штамм Penicillium sizovae - деструктор лигнина древесины. Мокрушина Н.С., Дармов И.В. № 2007126013/13; заявл. 09.07.2007; опубл. 20.05.2009. Бюл. №14.

20. Гелес И.С. Древесное сырье-стратегическая основа и резерв цивилизации: Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 2007. 499c.

21. Саттон Д.А., Фотергилл А.В., Ринальди М.Г. Определитель патогенных и условно патогенных грибов: Пер. с англ. М.: Mир. 2001. 486с.

22. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. М.: Наука. 1969. 303c.

23. Teather R.M., Wood P.J. Use of congo-red polysaccharide interaction in erumeration and characterization of cellulolytic bacteria the bovine rumen. Appl. Environ Microbiol. 1982. Vol.43. P.777-780.

24. Соловьева И.В., Окунев О.Н., Вельков В.В. и др. Получение и свойства мутантов Penicillium verruculosum - суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз. Микробиология. 2005. Т.74. No.2. С.172-178.

25. Методы экспериментальной микологии. Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка. 1982. 552c.

26. Градова Н.Б. и др. Лабораторный практикум по общей микробиологии. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева. 1999. 130с.

27. Оболенская А.В. и др. Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М.: Лесная промышленность. 1965. 320c.

Размещено на Allbest.ru