Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia Lipolytica - продуцентов органических кислот

03.00.04 - Биохимия

доктора биологических наук

Моргунов Игорь Григорьевич

Пущино - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Татьяна Васильевна Финогенова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Миронова Галина Дмитриевна;

доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна;

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН.

Защита диссертации состоится “ 26 ” ноября 2009 г. в 14 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан “ ” 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

биосинтез кислота углерод гидролиз

Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию неконвенционных дрожжей Yarrowia lipolytica, что обусловлено, с одной стороны, их отличием от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe в плане их филогенетической эволюции, физиологии и генетики (Barth and Gaillardin, 1996; 1997) и, с другой стороны, широким применением их в биотехнологии. Создан международный центр по координации исследований в данной области; международные конференции, посвященные изучению этих дрожжей, проводятся с 1995 г. каждые три года. Значительные успехи достигнуты в области молекулярной биологии и генно-инженерной экспериментальной биологии Y. lipolytica; усилиями нескольких европейских научных коллективов к 2004 г. завершено изучение генома дрожжей, и составлена их генетическая карта (Dujon et al. 2004).

Российская группа, входящая в международный консорциум, на приоритетной основе проводит исследование уникальной особенности дрожжей Y. lipolytica синтезировать в значительных количествах органические кислоты, липиды и ферменты. Физиологические основы образования этих продуктов у Y. lipolytica изучены достаточно хорошо при использовании н-алканов в качестве источника углерода и энергии. Однако биохимические аспекты ассимиляции источников углерода (и особенно новых возобновляемых субстратов, таких как растительные масла и глицерин) и механизмы сверхсинтеза органических кислот на этих субстратах остаются малоизученными. Все энзиматические исследования по изучению процессов сверхсинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК проводились на бесклеточных экстрактах дрожжей. Не были изучены физико-химические свойства ключевых ферментов, участвующих в ассимиляции субстратов и процессах сверхсинтеза, и механизмы их тонкой регуляции. Оставалось неизвестным влияние внутриклеточных концентраций метаболитов на регуляцию ферментов, обеспечивающих процесс сверхсинтеза органических кислот. На момент начала работы еще не было доказанным, что в клетке ферменты одного метаболического пути функционируют не разрозненно, а взаимодействуют между собой и со структурными элементами клетки и создают надмолекулярные комплексы - метаболоны. Исследование ферментов, в условиях, максимально приближенных к тем, которые существуют внутри клетки, открывает новые перспективы в понимании механизмов регуляции метаболизма микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение структурно-функциональной организации путей ассимиляции триглицеридов и глицерина у дрожжей Y. lipolytica и механизмов регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. Изучение путей метаболизма триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжами Y. lipolytica.

2. Исследование механизмов сверхсинтеза органических кислот дрожжами Y. lipolytica при различных физиологических условиях (в условиях лимитирования роста клеток тиамином или азотом) на разных субстратах.

3. Выделение и характеристика ключевых ферментов метаболизма триглицеридов и глицерина и сверхсинтеза органических кислот - липазы (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7).

4. Изучение надмолекулярной организации ферментов ЦТК и механизмов регуляции у дрожжей. Создание новых представлений о механизмах сверхсинтеза органических кислот.

Научная новизна работы. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

Ключевые ферменты ассимиляции метаболизма триглицеридов и глицерина - липаза (КФ 3.1.1.3) и глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) выделены, очищены и охарактеризованы.

Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) из дрожжей Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что кинетические свойства цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in vitro и in situ существенно различаются. Фермент в условиях in situ оказался значительно более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Новизна предполагаемого подхода состоит в том, что ферменты одного метаболического пути впервые рассматриваются не в качестве отдельных функциональных единиц, а как элементы единого структурно-функционального комплекса. С использованием различных методологических подходов показано взаимодействие между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата.

Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

На примере пероксисомальной цитратсинтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

Практическая значимость работы. На основании изучения метаболической организации путей ассимиляции триглицеридов растительных масел и глицерина дрожжей Y. lipolytica созданы научные основы для разработки микробиологических способов получения пировиноградной и лимонной кислот. Процессы получения лимонной кислоты из рапсового масла и пировиноградной кислоты из глицерина были воспроизведены в полупромышленных масштабах на Опытно-технологической установке ИБФМ РАН.

Разработаны простые оригинальные методы очистки внеклеточной липазы, глицеролкиназы, цитратсинтазы и НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica. Глицеролкиназа может быть использована для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицеролкиназы из дрожжей защищен авторским свидетельством № 1433980 (1988). Липаза из Y. lipolytica может применяться в технологических процессах получения ценных жирных кислот из отходов производства растительных масел, а также для замены каталитического метанолиза ферментативным при производстве биодизеля.

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на четырнадцатой конференции "Транспорт и энергетика дрожжей" (Бонн, Германия, 1996), на третьей международной конференции по Y. lipolytica (Дрезден, Германия, 2002), на первом и втором международных конгрессов федерации европейских микробиологов (Любляна, Словения, 2003 и Мадрид, Испания, 2006), на девятнадцатом международном симпозиуме, посвященном достижениям в микробной безопасности пищевых продуктов (Порторош, Словения, 2004), на втором греческом симпозиуме биотехнологов (Афины, Греция, 2005), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2007), на ежегодных международных конференциях Института биотехнологии "Биохимия и биотехнология микроорганизмов - продуцентов органических кислот" (Авги-Салоники, Греция, 2006, 2007, 2008), а также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (1994-2008).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в 1985-2009 гг. в Лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования были поддержаны федеральной целевой научно-технической программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002-2006 гг.” (госконтракт № ИФ-15/02-2006), Российским фондом фундаментальных исследований, международным грантом CRDF RBO - 10305, и договорами с ООО «Зеленые линии» и ООО «НТМ-ФАРМ».

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором или под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 54 печатные работы, в том числе, 28 статьи (в их числе 3 обзора) из списка журналов ВАК, рекомендуемых для докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 329 страницах, содержит 44 таблицы и 51 рисунков. Список литературы включает 434 наименований, из них 330 - публикации в иностранных изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре обсуждаются современные достижения в области изучения неконвенционных дрожжей Y. lipolytica, физиологические основы биосинтеза органических кислот - интермедиатов ЦТК, регуляция ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у микроорганизмов, а также структурно-функциональная организация ферментов матрикса митохондрий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). В работе использовали коммерческие ферментные препараты и биохимические реактивы фирм «Roche» (Германия), «Sigma» (США), «P-L Biochemicals» (США), «Amersham», США), хроматографические материалы были получены от фирмы «Pharmacia» (Швеция).

Микроорганизмы. В работе использовали природные штаммы дрожжей Y. lipolytica из коллекции культур ИБФМ РАН и мутантные штаммы, полученные путем комбинированной обработки природного штамма Y. lipolytica 704 (ВКМ Y-2373) ультрафиолетовым облучением и N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ATCC 26108 (S288C) и бактерии Escherichia coli XL1-Blue, которые использовались для молекулярно-биологических исследований, были получены из коллекции Департамента биохимии Университета Далласа.

Методы культивирования. Дрожжи культивировали в колбах на качалке или в ферментере АНКУМ-2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5,0 л) общепринятыми методами в минерально-солевой среде Ридер. Источником углерода и энергии служили рапсовое и подсолнечное масла, глицерин, глюкоза, олеиновая кислота. В ряде случаев рост дрожжей лимитировали тиамином (в случае продукции кетокислот) или азотом (в случае продукции лимонных кислот).

Активность ферментов определяли на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония) в бесклеточных гомогенатах клеток, отобранных в разные фазы роста. Дезинтеграцию дрожжей проводили на планетарной мельнице с помощью «баллотини» или на прессе Френча. Методы измерения активности ферментов подробно изложены в диссертации. Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующего превращение одного мкмоль субстрата или образование одного мкмоль продукта в минуту (Ед.).

Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирмы «Pharmacia» (Швеция). Молекулярную массу нативных препаратов ферментов определяли методом гель-фильтрации. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970). Окрашивание препаратов белка проводилось Coomassie R-250.

Экстракция нуклеотидов. НАД и адениновые нуклеотиды экстрагировали кислотой, а НАДН щелочью. Для этого к 20 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из ферментера, быстро добавляли по 7 мл 0,3 N HCl или 1 N NaOH. Суспензию инкубировали на водяной бане при 500 С в течение 10 мин при постоянном перемешивании, охлаждали и нейтрализовали до рН=7,0. Нейтрализованный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, и супернатант использовали для анализа нуклеотидов. Анализ адениннуклеотидов проводили люциферин-люциферазным методом на люминометре LKB 1261 (Швеция). АМФ и АДФ определяли после энзиматической конверсии в АТФ. Пиридиннуклеотиды определяли циклическим методом на спектрофотометре UV-160 «Shimadzu» (Япония).

Получение пермеабилизованых клеток. Пермеабилизацию Y. lipolytica проводили модифицированным методом Yoshina et al. (1979). 1 г (по сух. весу) клеток суспендировали в 4 мл 100 мМ калий-фосфатного буфера (pH=7,5), содержащего 40 мМ сорбитола. К суспензии клеток добавляли 15 мл толуола. Суспензия аккуратно перемешивалась при 37 0С в течение 5 мин и потом охлаждалась на льду. Клетки были собраны центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин, ресуспендированы и отмыты в 20 мМ какодилатном буфере (pH=7,1), содержащем 400 мМ сорбитола. Клетки, обработанные толуолом, суспендировали в вышеприведенном буфере в конечной концентрации 200 мг клеток/мл.

Связывание цитратсинтазы Y. lipolytica с внутренней мембраной митохондрий. Для выделения митохондрий клетки Y. lipolytica дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в среде, содержащей 0,9 М сахарозы, 20 мМ фосфатного буфера (pH=6,0), 1 мМ ЭДТА и 3% лиофилизированного желудочного сока виноградной улитки. Суспензию клеток инкубировали с перемешиванием при 29 0 С в течение 90 мин. Затем клетки дважды промывали средой того же состава без улиточного фермента и центрифугировали при 6000 g 20 мин. Отмытые клетки суспендировали в среде, содержащей 0,5 М манита, 10 мМ фосфатного буфера (pH=7,2), 0,5 мМ ЭДТА и 0,1 % БСА.

Суспензию клеток гомогенизировали при 14000 об./мин в течение 20 мин. Клетки центрифугировали при 3000 g 10 мин для удаления неразрушенных клеток и протопластов. Митохондрии осаждали при 7000 g 10 мин. Осадок митохондрий (10 мг/мл) хранили на льду.

Для удаления внешней мембраны и получения митопластов митохондрии обрабатывали 0,75% раствором дигитонина в течение 10 мин (Greenawalt, 1974). Cубмитохондриальные частицы (СМЧ) получали с помощью обработки митопластов ультразвуком (Hackenbrock and Hammon, 1975). Митопласты (50 мг по белку) суспендировали в 25 мл дистиллированной воды, центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, ресуспендировали в 1 мл воды и обрабатывали ультразвуком (20 кГц/сек, 40 Ватт) на льду. Обработку повторяли 8 раз по 15 сек и последний раз - 30 сек. Полученный препарат центрифугировали (10000 g, 10 мин) для удаления больших “невывернутых” везикул. СМЧ промывали 2 мМ HEPES буфером, рН=7,0 (буфер А) и собирали центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч.

Для электронного микроскопирования препараты мембран со связанными ферментами помещали на никелевые сетки. После промывки буфером А с 2% альбумином, сетки инкубировали с первичными антителами для цитратсинтазы (30 мин, 4 0С), промывали и переносили в смесь вторичных антител, коньюгированных с коллоидным золотом (Amersham, США), для мечения цитратсинтазы использовали частицы золота диаметром 15 нм. После инкубации (30 мин при 4 0C) и отмывки, препарат фиксировали в 2 % растворе глутарового альдегида, и сетки анализировали на электронном микроскопе EM301 (Phillips, США).

Наличие субстратного канала оксалоацетата внутри комплекса ферментов цитрат-синтазы и малатдегидрогеназы было подтверждено с использованием 1) рекомбинантного дрожжевого белка цитрат-синтаза/малатдегидрогеназа и 2) коммерческих препаратов малатдегидрогеназы (митохондриальной и цитозольной) и цитратсинтазы фирмы Sigma методами Hummer-Dreyer хроматография и осаждением комплекса ферментов в полиэтиленгликоле (ПЭГ). Методы анализа подробно изложены в диссертации.

Метаболические эффекты дислокализации цитрат-синтазы определяли в клетках дрожжевых мутантов cit1 (cit1::LEU2) и cit1cit2 (cit1::LEU2 cit2::URA2), неспособных к росту на ацетате. Методы анализа подробно изложены в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пути метаболизма глицерина и растительных масел у дрожжей Y. lipolytica. В настоящее время известно два основных пути метаболизма глицерина у дрожжей:

1) фосфорилирование глицерина глицеролкиназой (КФ 2.7.1.30) с образованием глицерол-3-фосфата и последующее дегидрирование до диоксиацетонфосфата ФАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (КФ1.1.99.5) и НАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (К.Ф. 1.1.1.8) (фосфорилирующий путь);

2) окисление глицерина глицеролдегидрогеназой (КФ 1.1.1.6) и фосфорилирование образовавшегося диоксиацетона диоксиацетонкиназой (КФ 2.7.1.28) (окислительный путь).

Ранее фосфорилирование глицеролкиназой считалось единственным механизмом вовлечения глицерина в метаболизм дрожжей. Для ряда дрожжей описан окислительный путь, в котором глицерин окисляется до диоксиацетона, и последний фосфорилируется до диоксиацетонфосфата (May and Sloan, 1981).

Пути метаболизма глицерина у Y. lipolytica - продуцентов органических кислот были изучены в сравнении с Candida valida (продуцентом цитохрома с). Результаты определения активности ферментов, катализирующих начальные этапы как фосфорилирующего, так и окислительного путей метаболизма глицерина, в бесклеточных экстрактах Y. lipolytica и C. valida представлены в табл. 1. Ферменты, катализирующие реакции окислительного пути НАД- и НАДФ-зависимая глицеролдегидрогеназа, диоксиацетонкиназа и глицерол-оксидаза не обнаружены в грубых экстрактах клеток Y. lipolytica. Высокие активности глицеролкиназы и НАД- и ФАД- глицерол-3-фосфатдегидрогеназ и индуцибельный характер этих ферментов позволяет предположить, что у

Таблица 1. Активности ферментов (ммоль/мин мг белка) метаболизма глицерина

Фермент	Y. lipolytica	C. valida
	Глицерин	Глюкоза	Глицерин
Фосфорилирующий путь
Глицеролкиназа	0,105	0,047	0
Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+)	0,052	0,005	0
Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+)	0,041	0,003	0
Окислительный путь
Глицеролдегидрогеназа (НАД+)	0	н.о.	0,300
Диоксиацетонкиназа	0	н.о.	0,081
Глицеролдегидрогеназа (НАДФ+)	0	н.о.	0
Глицеролоксидаза	0	н.о.	0

Y. lipolytica функционирует только фосфорилирующий путь метаболизма этого субстрата.

Функционирование глицеролдегидрогеназного пути метаболизма глицерина обнаружено у дрожжей C. valida. В экстрактах этих дрожжей обнаружены глицеролдегидрогеназа и диоксиацетонкиназа, а глицеролкиназа и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы отсутствовали. Дрожжи C. valida обладают высокой активностью алкогольдегидрогеназы. Поскольку алкогольдегидрогеназа характеризуется широкой субстратной специфичностью, можно было бы предположить, что этот фермент катализирует НАД-зависимое окисление глицерина. Однако это предположение не подтвердилось. С использованием гидрофобной хроматографии удалось четко разделить алкоголь- и глицеролдегидрогеназу. При этом алкогольдегидрогеназа не катализировала НАД-зависимое окисление глицерина, а глицеролдегидрогеназа, в свою очередь, не проявляла алкогольдегидрогеназной активности. Исходя из полученных результатов, можно полагать, что у дрожжей C. valida имеется фермент, специфичный для глицерина и катализирующий его окисление с НАД в качестве кофактора. НАДФ-зависимого окисления глицерина в экстракте изучаемых дрожжей не обнаружено, отсутствовала также и активность глицеролоксидазы.

Такие различия в путях метаболизма глицерина можно объяснить физиологическими особенностями исследуемых дрожжей: Y. lipolytica - строго аэробный организм, в то время как C. valida являются дрожжами бродильного типа. Побочным продуктом при брожении является глицерин. Образование глицерина происходит из-за избытка НАДН, появляющегося при ассимиляции сахара в биомассу (Hofmann, 1983). Глицеролдегидрогеназа способна катализировать реакцию восстановления диоксиацетона в глицерин при физиологических условиях. Следовательно, можно предположить, что у дрожжей, способных к брожению, в аэробных условиях глицероддегидрогеназа может отвечать за первый этап ассимиляции глицерина, а при анаэробной ферментации сахаров служить клапаном для сброса восстановительных эквивалентов, катализируя образование глицерина. Известно также, что дрожжи C. valida при росте на глюкозе в условиях дефицита фосфора способны накапливать в среде глицерин (Еремина, Финогенова, 1990), а Y. lipolytica экскретирует в среду не глицерин, а лимонную кислоту (Лозинов, 1974). Способность накапливать в среде глицерин у разных видов дрожжей может быть связана с наличием или отсутствием глицеролдегидрогеназы.

Для более детального изучения путей метаболизма глицерина у Y. lipolytica и выяснения механизмов его регуляции глицеролкиназа была выделена, очищена и охарактеризована.

Очистка и свойства глицеролкиназы. Для очистки глицеролкиназы из дрожжей Y. lipolytica была разработана оригинальная, высокоэффективная методика, на которую былао получено авторское свидетельство. Очистка состояла из трех стадий (табл. 2). На первой стадии прогреванием экстракта удаляются менее термостабильные белки. Глицеролкиназа является термостабильным ферментом и выдерживает нагревание до 60 оС в течение 10 мин практически без потери активности. В то же время, тепловая обработка позволила избавиться более чем от 50% всего количества балластных белков. После тепловой обработке препарат фермента подвергали дополнительной очистке с помощью ионно-обменной и гидрофобной хроматографии. В результате глицеролкиназа была очищена более чем в 300 раз с выходом 51% и имела удельную активность 17,8 мкмоль/мин на мг белка.

Изучение физико-химических и кинетических свойств глицеролкиназы дрожжей Y. lipolytica показало, что фермент имел молекулярную массу 200 кДа, проявлял максимальную активность при pH=10,0, являлся термостабильным, ингибировался 0,5 мМ АМФ на 50 % и, был нечувствителен к фруктозо-1,6-бисфосфату.

Субклеточная локализация ферментов метаболизма глицерина у

Y. lipolytica и физиологическая роль глицерол-3-фосфат-дегидрогеназ. Первый этап превращения глицерина - фосфорилирование - локализован в цитоплазме. Доказательством этого служит тот факт, что 93% активности глицеролкиназы обнаруживалось в растворимой фракции после дифференциального центрифугирования. Следующий этап ассимиляции глицерина - дегидрирование образовавшегося в глицеролкиназной реакции глицерол-3-фосфата - может катализироваться двумя различными оксидоредуктазами - ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой и НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой. ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа ассоциирована с фракцией мембранных органелл. Более 75% активности этого фермента при дифференциальном центрифугировании обнаружено во фракции частиц. При этих же условиях примерно 70% активности фумаразы, маркерного фермента митохондрий, определялось в той же фракции. Одинаковый характер распределения этих двух ферментов позволяет предположить, что они ассоциированы с одной субклеточной органеллой.

Таблица 2. Очистка глицеролкиназы Y. lipolytica

Стадия очистки	Общий белок (мг)	Общая активность (Ед.)	Удельная активность (мкмоль/мин мг белка)	Выход (%)	Степень очистки
Грубый экстракт	1320	77,9	0,059	100	1
Прогрев	510	77,5	0,152	99	2,6
ДЭАЭ-сефароза	32,4	48,6	1,5	62	25,4
Фенил-сефароза	2,3	40,9	17,8	51	301,3

Более 55% НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связано с фракцией частиц. Примерно также распределяются активности пероксисомальных ферментов (изоцитрат-лиазы и каталазы).

Теоретически можно предположить три метаболических функции для НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы: восстановление диокси- ацетонфосфата для биосинтеза триглицеридов, окисление глицерол-3-фосфата, образовавшегося при ассимиляции глицерина, и поддержание редокс-потенциала.

Литературные данные о метаболической роли глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы из различных источников немногочисленны и противоречивы. Участие в поддержании редокс-состояния предполагается для фермента из мышц курицы (Wait, Kaplan, 1972) и дрожжей, ассимилирующих н-алканы (Kawamoto et al. 1979); катаболическая роль - для ферментов из Escherichia coli (Kito, Pizer, 1968), печени курицы (Harding, 1975) и Neurospora crassa (Courtright, 1975). Биосинтетическая роль обсуждалась для ферментов из Saccharomyces cerevisiae (Hofmann, 1983) и E. coli (Kito, Pizer, 1968).

Десятикратное увеличение активности НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы наблюдалось в клетках Y. lipolytica, при росте на глицерине, по сравнению с клетками, выращенными на глюкозе (табл. 1). Казалось бы, что основная роль данного фермента в клетках заключается в дегидрировании глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции. С другой стороны, японские исследователи предположили, что НАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа вовлечена в глицерол-3-фосфат-диоксиацетонфосфат-челночную систему, функционирующую в алкан-утилизирующих дрожжах. Данная система служит для транспорта восстановительных эквивалентов, образующихся в пероксисомах во время в-окисления жирных кислот (Kawamoto et al., 1979).

Дрожжи Y. lipolytica, Trichosporon candida и Candida maltosa были выращены на глицерине и гексадекане, и в бесклеточных экстрактах дрожжей определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина. Активности этих же ферментов были определены у C. utilis, не способных ассимилировать н-алканы, и у метанольных дрожжей C. boidinii, выращенных на глицерине. Также были определены активности ферментов начальных этапов ассимиляции гексадекана. Результаты представлены в табл. 3. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы в клетках дрожжей, выращенных на гексадекане, значительно выше, чем на глицерине.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 3. Активности ферментов (ммоль/мин на мг белка) метаболизма глицерина и н-алканов у дрожжевых организмов

Фермент	Y. lipolytica	T. candida	C. maltosa	C. utilis	C.boidinii
	глицерин	гексадекан	глицерин	гексадекан	глицерин	гексадекан	глицерин	гексадекан
Глицеролкиназа	0,105	0,021	0,121	0,065	0,095	0,029	0,172	0,073
Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (НАД+)	0,052	0,208	0,045	0,275	0,044	0,137	0	0
Глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД+)	0,041	0,040	0,049	0,063	0,032	0,052	0,048	0,027
Цитохром Р-450	0,012	0,045	0,015	0,039	0,010	0,051	0	0
Оксидаза высших жирных спиртов	0,015	0,080	0,044	0,120	0,035	0,153	0	0
Дегидрогеназа высших альдегидов	0,034	0,096	0,075	0,180	0,064	0,179	н.о.	н.о.
Ацил-КоА-оксидаза	0,023	0,109	0,056	0,115	0,045	0,120	н.о.	н.о.
Изоцитрат-лиаза	0,030	0,089	0,039	0,123	0,042	0,122	н.о.	н.о.

Размещено на http://www.allbest.ru/

У дрожжей, не ассимилирующих н-алканы, этот фермент вообще не обнаружен. Активности ферментов, участвующих в метаболизме н-алканов (цитохром Р-450, оксидаза высших спиртов, дегидрогеназы высших альдегидов, ацил-КоА-оксидаза, изоцитрат-лиаза), у всех исследованных дрожжей были выше при росте на гексадекане. В тоже время активность ключевого фермента ассимиляции глицерина - глицеролкиназы - выше в клетках дрожжей, выращенных на глицерине. Активность ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы при выращивании дрожжей на глицерине и гексадекане изменялась незначительно. Эти результаты дают возможность предположить, что основная физиологическая роль НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы связана не с ассимиляцией глицерина, а с метаболизмом н-алканов. В окислении глицерол-3-фосфата, образующегося в глицеролкиназной реакции, основную роль, по-видимому, играет ФАД-зависимая глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа.

Таким образом, у Y. lipolytica (рис. 1) вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацеионфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.



Рис. 1. Окисление глицерина у Y. lipolyticа (1 - глицеролкиназа, 2 - глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД), 3 - глицерол-3-Ф- дегидрогеназа (НАД), 4 - триозофосфат-изомераза).

Особенности ассимиляции триглицеридов растительных масел и продуктов их гидролиза у Y. lipolytica. Начальным этапом ассимиляции триглицеридов у дрожжей является их гидролиз с образованием глицерина и жирных кислот:

Гидролиз осуществляется внеклеточными липазами (Fickers et al., 2005). До настоящего времени не были определены механизмы ассимиляции продуктов гидролиза. Предполагалось, что могут быть реализованы два механизма потребления этих субстратов: одновременное потребление глицерина и жирных кислот или последовательное потребление вначале одного, потом другого метаболита (т.е. диауксия).

При выращивании дрожжей Y. lipolytica в среде с рапсовым маслом в качестве единственного источника углерода, показано, что при потреблении масла на протяжении всего процесса культивирования содержание глицерина в среде сохранялось на одном уровне (0,059 - 0,125 г/л). В процессе культивирования не менялся также и качественный состав внеклеточных липидов (три-, ди-, моноглицеридов) и свободных жирных кислот в среде. Исходя из полученных результатов высказано предположение, что потребление глицерина и жирных кислот у Y. lipolytica происходит одновременно.

Дополнительным доводом в пользу этого предположения явилось сравнительное изучение активности ферментов в разные фазы роста Y. lipolytica на подсолнечном масле, глицерине и олеиновой кислоте (табл. 4). При ассимиляции масла с первых часов культивирования (6 ч) наблюдается индукция ключевого фермента метаболизма глицерина - глицеролкиназы, активность которой на 30% снижена в сравнении с активностью фермента у клеток, растущих на глицерине, но существенно выше активности фермента у клеток, растущих на олеиновой кислоте. Также у дрожжей при росте на масле с первых часов индуцировались и ферменты глиоксилатного цикла - изоцитрат-лиаза и малат-синтаза, участвующие в метаболизме жирных кислот. В клетках, растущих на олеиновой кислоте, активность изоцитрат-лиазы в 14,7 и малат-синтазы в 10 раз выше в сравнении с клетками, растущими на глицерине. В последующие часы культивирования (12 ч и 24 ч) активность глицеролкиназы у дрожжей при росте на масле поддерживалась на постоянно высоком уровне, что, по-видимому, связано с активным потреблением глицерина, непрерывно образуемого в ходе всего процесса ассимиляции масла.

Таблица 4. Активности ферментов (мкмоль/мин мг белка) ЦТК и глиоксилатного цикла при росте Y. lipolytica на различных С-источниках

Источник углерода	Время (ч)	ГК	ЦТК	ГЦ
			ЦС	АК	НАД-ИДГ	НАДФ-ИДГ	ИЛ	МС
Масло	6	0,254	2,04	0,92	0,06	0,058	0,089	0,054
	12	0,254	2,44	1,02	0,06	0,068	0,109	0,064
	24	0,254	1,96	0,87	0,058	0,068	0,093	0,035
Глицерин	6	0,363	0,82	0,33	0,105	0,120	0,009	0,012
	12	0,360	0,90	0,43	0,115	0,132	0,009	0,014
	24	0,300	0,84	0,42	0,117	0,152	0,01	0,010
Олеат	6	0,112	1,70	0,53	0,1	0,07	0,133	0,1
	12	0,112	1,90	0,53	0,1	0,06	0,134	0,13
	24	0,112	1,90	0,52	0,1	0,07	0,144	0,12

ГЦ - глиоксилатный цикл, ГК - глицеролкиназа, ЦС - цитрат-синтаза, АК - аконит-гидратаза, НАД-ИДГ - НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа, НАДФ-ИДГ - НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа, ИЛ - изоцитрат-лиаза, МЛ - малат-синтаза

Также активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы сохранялись на высоком уровне, что, обусловлено активным потреблением образуемых жирных кислот в ходе всего процесса.

Однако необходимо отметить, что одновременное потребление из среды двух субстратов не является типичным для микроорганизмов. Традиционно считается, что микроорганизмы при росте на двух и более субстратах используют преимущественно углеводы, в сравнении с другими источниками углерода. Этот феномен, известный как катаболитная репрессия, позволяет микроорганизмам более эффективно использовать углеродные субстраты, присутствующие в среде. Модели, описывающие молекулярные механизмы катаболитной репрессии были разработаны для E. coli. Дрожжи S. cerevisiae также являются объектами изучения катаболитной репрессии (Gancedo, 1992; Entian and Shuller, 1997). Данный феномен у дрожжей Y. lipolytica не изучен.

Для Y. lipolytica обнаружено, что при выращивании на среде, содержащей смесь двух субстратов (глицерин + олеиновая кислота) в течение всего процесса культивирования происходило одновременное потребление из среды и глицерина, и олеиновой кислоты. Ферменты глицеролкиназа, малат-синтаза и изоцитрат-лиаза индуцировались с первых часов роста и их активности сохранялись высокими в течение всего культивирования.

Вместе с тем, на среде, содержащей одновременно глюкозу и олеиновую кислоту, в первые 12 ч роста наблюдалось потребление глюкозы, а уровень олеиновой кислоты практически не изменялся. После потребления глюкозы из среды начиналась ассимиляция олеиновой кислоты, сопровождающаяся резким приростом биомассы. Показано, что первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были очень низкими, т.е. ферменты репрессировались высокими концентрациями глюкозы в среде. Индукция ферментов, вовлеченных в метаболизм жирных кислот, отмечалась только после 12 ч роста, когда содержание глюкозы в среде снижалось до 2,5 г/л.

Дрожжевая изоцитрат-лиаза рассматривается как конститутивный фермент, подвергающийся катаболитной репрессии (Whitworth and Ratledge, 1975; Evans and Ratledge, 1985; Ermakova et al. 1986; Kubicek et al. 1988). Известно, что фосфоенолпируват является ингибитором изоцитрат-лиазы у ряда бактерий, грибов и водорослей, и значение Ki для этого соединения очень низкое - 0,13 - 0,20 мМ (Entian and Shuller, 1997; Holdsworth et al. 1988; Barth and Scheuber, 1993). Еще одним ингибитором изоцитрат-лиазы является пируват, значение Ki для этого соединения у С. guilliermondii равно 0,8 мМ, а у C. tropicalis - 0,5 мМ (Gancedo, 1992).

При выращивании Y. lipolytica на среде, содержащей глюкозу и гексадекан, также наблюдается двухфазность роста: в первые 14 ч роста происходило потребление глюкозы и содержание гексадекана в среде не изменялось; после 14 ч следовал 4,5 ч лаг-период, когда не происходило потребления азота и гексадекана и далее с 18 ч культивирования накопление биомассы происходило только за счет потребления гексадекана. Как и в случае со средой, содержащей глюкозу и олеиновую кислоту, в первые часы роста активности изоцитрат-лиазы и малат-синтазы были низкими. Индукция ферментов отмечалась только после 14 ч роста культуры, и оставалась высокой на протяжении всего процесса культивирования. Можно заключить, что глюкоза или продукты ее окисления у Y. lipolytica репрессируют ферменты, ответственные за метаболизм других источников углерода, в то время как глицерин является нерепрессирующим субстратом.

Очистка и свойства липазы у Y. lipolytica. Таксономическим признаком Y. lipolytica является липолитическая активность (Lodder et al. 1972). Еще в 80-е годы в работах Института микробиологии РАН было выдвинуто предположение, что липаза дрожжей Candida lipolytica структурно связана с клеточной стенкой (Звягинцева, 1972; Рубан с соавт. 1976). В литературе обсуждается способность дрожжей продуцировать различные типы липаз и зависимость их продукции от состава среды и условий культивирования (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997; Pereira-Meireles and Rocha Leao, 2000).

Для отбора продуцента липазы предварительно был проведен скрининг среди 29 штаммов Y. lipolytica в чашках с агаризованной средой Lodder (1952), содержащей говяжий жир и в среде Ридер с рапсовым маслом. Y. lipolytica 704 отобран в качестве активного продуцента липазы с активностью 2760 Ед./мл (табл. 5). Кроме того, продуцент липазы характеризовался высокой кислотообразующей активностью, содержание лимонной кислоты на 6 сутки при культивировании в колбах составляло 12,7 г/л.

Установлено, что такие факторы, как фаза роста, pH среды, аэрация, концентрация масла, состав питательной среды оказывают существенное влияние на экскрецию липазы. Подобраны условия, обеспечивающие максимальную реализацию липазы в культуральную жидкость: источник углерода - рапсовое или подсолнечное масло, источник азота - смесь пептона (3%) и сульфата аммония (3%), оптимум pH=5,5-6,5, низкая аэрация среды (концентрация кислорода в среде 15-20% насыщения).

Таблица 5. Активность липазы и образование лимонных кислот у дрожжей Y. lipolytica

Штаммы	Липаза	ЛК (г/л)	Штаммы	Липаза	ЛК (г/л)
	Метод А	Метод Б			Метод А	Метод Б
Y. lipolytica 47	++++	1956	3,1	Y. lipolytica 681	++	180	н.о.
Y. lipolyticaN15	++++	1836	10,0	Y. lipolytica 682	++++	840	5,1
Y .lipolytica 212	+++	600	2,7	Y. lipolytica 683	++++	1200	4,0
Y .lipolytica 217	+++	600	2,9	Y. lipolytica 694	+++	1200	2,8
Y. lipolytica 374	+++	396	2,5	Y .lipolytica 695	+++	396	1,7
Y. lipolytica 607	+++	900	3,8	Y.lipolytica 696	++	264	н.о.
Y .lipolytica 645	++++	756	2,9	Y. lipolytica 702	+++	396	3,8
Y. lipolytica 646	+	264	н.о.	Y. lipolytica 704	++++++	2760	12,7
Y. lipolytica 655	++	288	н.о.	Y. lipolytica 706	++++	798	4,1
Y. lipolytica 666	+	222	н.о.	Y. lipolytica 709	++++	420	4,1
Y. lipolytica 667	+++	516	2,7	Y. lipolytica 710	++++	840	5,3
Y. lipolytica 668	+++	798	4,0	Y. lipolytica 711	+++	600	5,1
Y. lipolytica 672	++++	120	н.о.	Y. lipolytica 716	+++	810	4,4
Y. lipolytica 674	++++	1680	3,2

Метод А - Липолитическую активность оценивали по зонам помутнения среды, связанным с появлением нерастворимых кальциевых солей жирных кислот, образуемых в ходе гидролиза жира. Метод Б - Активность липазы (Ед./мл) определяли титрометрическим методом у дрожжей при культивировании в жидкой среде Ридер с рапсовым маслом (20 г/л) в качестве источника углерода и энергии.

Метод очистки липазы состоит из трех стадий. Внеклеточная липаза из Y. lipolytica 704, при культивировании в среде с подсолнечным маслом была очищена за три стадии (табл. 6). На первой стадии в связи с отсутствием фермента в фильтрате культуральной жидкости клетки подвергали солюбилизации 0,2%-ным раствором Triton X-100 или обрабатывали ультразвуком.

На следующей стадии экстракт фракционировали сульфатом аммония (80% от насыщения). Полученный после высаливания осадок растворяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH=7,5) и наносили на колонку с фенил-сефарозой. Элюцию липазы проводили в градиете сульфата аммония (1 - 0 М). Фракции, содержащие активность фермента, объединяли и концентрировали на диализной ячейке. В результате внеклеточная липаза была очищена более чем в 16,7 раз с выходом 44,21 % и имела удельную активность 1350 ммоль/мин мг белка. Очищенная липаза была гомогенна при ультрацентрифугировании и электрофорезе.

Таблица 6. Очистка липазы из Y. lipolytica

Стадия очистки	Общий белок (мг)	Общая активность (Ед)	Активность (мкмоль/ мин мг белка)	Выход (%)	Степень очистки
Грубый экстракт + УЗ	25,0	4580,0	183,20	100	1
Осаждение (NH4)2SO4	6,6	1634,61	247,67	35,69	3,79
Фенил-сефароза	1,5	2025,0	1350,00	44,21	16,7

Свойства липазы. Липаза из Y. lipolytica имела молекулярную массу порядка 38 кДа. Молекулярная масса липазы других штаммов Y. lipolytica составляет 32-39 кДа (Ota et al. 1982; Pereira-Meireles et al. 1997). Оптимум рН=8,0, стабильность препарата сохраняется в диапазоне рН=6,0-9,0. Фермент выдерживает инкубацию при 500 в течение 10 мин. Активность липазы ингибировалась ионами тяжелых металлов и активировалась ионами Mn2+, Mg2+ и Ca2+.

Механизмы сверхсинтеза органических кислот у Y. Lipolytica.

Биосинтез кетокислот дрожжами Y. lipolytica при росте на глицерине и глюкозе. Определяющим условием сверхсинтеза кетокислот является лимитирование роста дрожжей тиамином при одновременном избыточном содержании в среде источников углерода, азота и других биогенных элементов (Ермакова, 1971; Лозинов, Финогенова, 1972).

17 штаммов дрожжей, относящихся к роду Candida были проверены на образование кетокислот при росте в среде с глицерином или глюкозой. Большинство из исследуемых дрожжей были способны синтезировать пировиноградную кислоту (ПВК) и б-кетоглутаровую кислоту (КГК) как в среде с глицерином, так и в среде с глюкозой. При этом как абсолютное количество накапливаемых в среде кетокислот, так и их соотношение было различным. Для дальнейших исследований как наиболее активные кислотообразователи выбраны штаммы Y. lipolytica 374/4.

Дрожжи Y. lipolytica выращивали в среде с различными лимитирующими концентрациями тиамина. В качестве источника углерода использовали глюкозу или глицерин (рис. 2). Накопление биомассы на обоих субстратах было пропорционально количеству внесенного в среду тиамина, причем и на глюкозе и на глицерине этот прирост был практически одинаков. Однако при этом наблюдались различия в экскреции кетокислот. В среде с глюкозой при повышении концентрации тиамина в пределах исследуемых концентраций повышался выход КГК, в то время как выход пирувата падал. При концентрациях тиамина в среде 1-2,5 мкг/л накапливалась преимущественно ПВК, а при концентрациях 3-5 мкг/л соотношение менялось в пользу КГК. В среде с глицерином при всех исследованных концентрациях тиамина наблюдался преимущественный синтез ПВК, хотя соотношение пируват/2-оксоглутарат менялось в зависимости от концентрации тиамина.

Биосинтетическая активность Y. lipolytica была проверена в ферментере при концентрации тиамина в среде 8 мкг/л, которая обеспечивает накопление 10 г/л биомассы. Накопление кетокислот начинается в фазе замедленного роста и интенсивно продолжается в стационарной фазе. Как на глицерине, так и на глюкозе наблюдается преимущественный синтез ПВК, и на 78 ч в среде с глицерином отмечалось накопление 61,3 г/л ПВК и 10 г/л КГК, а в среде с глюкозой - 41 г/л ПВК и 8 г/л КГК (рис. 3).



Рис. 2. Влияние концентрации тиамина в среде на кислотообразование у Y. lipolytica 374/4.

? - Биомасса, ^- ПВК, ¦ - КГК

Для изучения путей биосинтеза кетокислот были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма глицерина и глюкозы, ЦТК и анаплеротических путей. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (нет кислот), в фазу замедленного роста (начало синтеза кислот) и в стационарную фазу (в период активного синтеза кетокислот) (табл. 7, 8).

Рис. 3. Сверхсинтез кетокислот у Y. lipolytica 374/4 в условиях дефицита тиамина (культивирование в ферментере). ? - Биомасса, ^- ПВК, ¦ КГК

Как было отмечено выше, фосфорилирование глицерина до глицерол-3-фосфата с участием глицеролкиназы является единственным путем вовлечения глицерина в метаболизм у Y. lipolytica. Как видно из табл. 7, активность глицеролкиназы не изменяется в фазе замедления роста, когда начинается синтез кетокислот, и остается на высоком уровне в стационарной фазе. Активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы снижается в 2 раза в условиях дефицита тиамина и синтеза кетокислот. В то же время активность ФАД-зависимого фермента возрастает вдвое при замедлении роста культуры, что подтверждает предположение о ключевой роли данного фермента в окислении глицерол-3-фосфата. Активности ключевых ферментов, участвующих в превращении диоксиацетонфосфатата в пируват, - глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и пируваткиназы - при дефиците тиамина сохраняются на уровне, близком к таковому в период экспоненциального роста.

Таблица 7. Активность ферментов (ммоль/мин мг белка) путей метаболизма глицерина у Y. lipolytica

ФЕРМЕНТЫ	Экспоненциальная фаза	Фаза замедления роста	Стационарная фаза
I. Начальные этапы ассимиляции глицерина:
Глицеролкиназа	0,105	0,095	0,130
Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (НАД+)	0,052	0,026	0,023
Глицерол-3Ф-дегидрогеназа (ФАД+)	0,041	0,085	0,082
II. Гликолиз
6-фосфофруктокиназа	0,07	0,06	0,05
Фруктозо-бис-фосфатальдолаза	0,105	0,105	0,100
Триозофосфатизомераза	0,200	0,170	0,165
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа	0,120	0,098	0,130
Пируваткиназа	0,350	0,300	0,280
Пируватдегидрогеназа	0,120	0,06	0,03
	0,120	0,10	0,09
III. ЦТК
Цитратсинтаза	0,9	0,885	0,825
Изоцитратдегидрогеназа (НАД+)	0,115	0,152	0,195
Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ+)	0,152	0,250	0,255
2-оксоглутаратдегидрогеназа	0,110	0,024	0,016
	0,110	0,11	0,042
Малатдегидрогеназа	2,00	2,125	2,55
1V. Анаплеротические пути
Малатсинтетаза	0,014	0,012	0,016
Изоцитратлиаза	0,009	0,022	0,012
Пируваткарбоксилаза	0,014	0,028	0,053
Пируватдекарбоксилаза	0,008	0,013	0,0112

Жирным шрифтом приведены активности ферментов, измеренные при внесении в реакционную смесь тиаминпирофосфата.

Активность пируватдегидрогеназного комплекса снижается от 0,12 мкмоль/мин мг белка в экспоненциальной фазе до 0,06 мкмоль/мин мг белка в фазе замедления роста и 0,03 мкмоль/мин мг белка в стационарной фазе. При этом необходимо отметить, что синтез апофермента в условиях дефицита тиамина в клетке идет с высокой скоростью - активность пируватдегидрогеназы, измеренная при внесении в реакционную смесь пирофосфата, хотя и несколько ниже активности, обнаруживаемой при экспоненциальном росте, но значительно более высока, чем в отсутствии тиаминового кофактора. Активность ключевого фермента ЦТК цитратсинтазы незначительно снижается при переходе клеток в стадию синтеза кислот, а активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы даже несколько увеличивается. Наблюдается увеличение активности и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Высокой на всем протяжении культивирования остается активность малатдегидрогеназы. Дефицит тиамина вызывал резкое снижение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (от 0,11 мкмоль/мин мг белка в экспоненциальной фазе до 0,016 мкмоль/мин мг белка при синтезе кетокислот).

При добавлении в реакционную смесь тиаминпирофосфата активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса увеличивается незначительно (до 0,042 мкмоль/мин мг белка).

Причиной этого может быть нарушение биосинтеза фермента, вызванное дефицитом тиамина, или протеолитическое расщепление фермента в отсутствии кофактора.

Окисление глюкозы протекало по механизму гликолиза и пентозофосфатного пути.

Для A. niger показано, что пентозофосфатный путь доминирует над гликолизом в фазу роста (Rohr et al. 1987; Legisa and Kidric, 1989). Для Y. lipolytica характерны и высокие активности гликолитических ферментов (гексокиназы, 6-фосфофруктокиназы, фруктозобисфосфат-альдолазы и пируваткиназы), и высокие активности ферментов пентозофосфатного пути (глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, фосфоглюконатдегидрогеназы и транскетолазы) в фазу роста (табл. 8). При недостатке тиамина в фазе замедления роста активность гексокиназы сохранялась на уровне активности в ростовой фазе и снижалась на 30% в стационарной фазе роста, активность 6-фосфофруктокиназы увеличивалась в 2 раза и удерживалась на этом уровне. Активность фруктозобисфосфат-альдолазы увеличивалась в 2 раза в фазе замедления роста культуры и достигала значения контроля в стационарной фазе роста. Активность пируваткиназы не изменялась в фазе замедления роста и уменьшалась в два раза в стационарной фазе роста, продолжая оставаться на высоком уровне. При дефиците тиамина постепенно снижалась активность глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы, достигая в стационарной фазе роста 50% от контроля. Активность фосфоглюконатдегидрогеназы практически не изменялась.

Активность тиаминового фермента - транскетолазы, резко снижалась, и в клетках стационарной фазы составляла только 10% от исходной.

Таблица 8. Активность ферментов (ммоль/мин мг белка) метаболизма глюкозы у Y. lipolytica

ФЕРМЕНТЫ	Экспоненциальная фаза	Фаза замедления роста	Стационарная фаза
I. Пентозофосфатный путь:
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа	0,412	0,346	0,246
Фосфоглюконатдегидрогеназа	0,447	0,408	0,402
Транскетолаза	0,427	0,060	0,044
	0,430	0,070	0,072
II. Гликолиз
Гексокиназа	0,359	0,334	0,224
6-фосфофруктокиназа	0,072	0,145	0,154
Фруктозобисфосфатальдолаза	0,058	0,099	0,055
Пируваткиназа	0,1	0,1	0,12
Пируватдегидрогеназа	0,151	0,158	0,083
	0,151	0,110	0,076
III. ЦТК
Цитрат-синтаза	0,71	0,631	1,3
Изоцитратдегидрогеназа (НАД)	0,110	0,142	0,257
Изоцитратдегидрогеназа (НАДФ)	0,136	0,142	0,360
2-оксоглутаратдегидрогеназа	0,110	0,042	0,010
	0,110	0,042	0,012
Малатдегидрогеназа	2,500	4,70	7,000
1V. Анаплеротические пути
Малатсинтетаза	0,020	0,018	0,011
Изоцитратлиаза	0,014	0,016	0,014
Пируваткарбоксилаза	0,067	0,081	0,080
Пируватдекарбоксилаза	0,032	0,036	0,031

Жирным шрифтом приведены активности ферментов, измеренные при внесении в реакционную смесь тиаминпирофосфата.

Превращение пирувата в ацетил-КоА осуществлялось двумя путями. С одной стороны, пируват декарбоксилировался до ацетил-КоА при участии пируватдегидрогеназного комплекса, а с другой стороны, пируват декарбоксилировался до ацетальдегида пируватдекарбоксилазой, и ацетальдегид окислялся до ацетата альдегид-дегидрогеназой. Ацетил-КоА-синтетаза катализировала образование Ацетил-КоА из КоА и ацетата.

Удельная активность пируватдегидрогеназного комплекса в фазу роста составляла 0,151 мкмоль/мин мг белка, сохранялась на этом уровне в фазе замедления роста культуры и уменьшалась в 2 раза в стационарной фазе. Активности пируватдекарбоксилазы, альдегид-дегидрогеназы и ацетил-КоА-синтазы в экстрактах были значительно ниже активности пируватдегидрогеназного комплекса, но сохранялись на том же уровне в процессе синтеза кислот. В клетках стационарной фазы роста активности ферментов ЦТК - цитрат-синтазы, аконитазы, НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ и малатдегидрогеназы - увеличивались в 2-3 раза, по сравнению с экспоненциальной фазой роста. Недостаток тиамина вызывал резкое уменьшение активности 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса. Активность этого фермента практически не обнаруживалась в стационарной фазе роста. В экстрактах Y. lipolytica довольно высокой была активность пируваткарбоксилазы, которая несколько увеличивалась в условиях недостатка тиамина и синтеза кислот.