Высокоэффективная жидкостная хроматография

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

- недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

- силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

2. Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

3. Применение

Наиболее широкое применение ВЭЖХ находит в следующих областях химического анализа (выделены объекты анализа, где ВЭЖХ практически не имеет конкуренции):

Контроль качества продуктов питания -- тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

Охрана окружающей среды -- фенолы, органические нитросоединения, моно-- и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

Криминалистика -- наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

Фармацевтическая промышленность -- стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

Медицина -- перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

Сельское хозяйство -- определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология -- сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

Органическая химия -- все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений):

контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

анализ качества почв для внесения удобрений, наличия пестицидов и гербицидов в почве, воде и в продукции, а также питательной ценности кормов; сложные исследовательские аналитические задачи; получение микроколичества сверхчистого вещества.

На анализ получены таблетки (лекарственная форма):

Описание: Таблетки белого цвета, слегка пористые, без запаха, плоскоцилиндрические.

Состав на одну таблетку:

Глицин (содержание 0,15 - 0,3 г);

Лимонная кислота (содержание 1,5 - 1,8 г);

Янтарная кислота (содержание 0,07 - 0,09 г).

Определение содержания компонентов проводим методом ВЭЖХ.

Условия хроматографирования:

- колонка из нержавеющей стали «Vydak c18» (250 х 3,9 мм) с размером частиц 5 мкм;

- спектрофотометрический детектор с рабочей длиной волны 210 нм;

- объем пробы 10-20 мкл

- скорость потока (расход подвижной фазы) 0,7 мл/мин;

- подвижная фаза: 0,2 М раствор калия дигидрофосфата;

- температура комнатная.

Приготовление подвижной фазы: 27,22 г калия фосфата однозамещенного (ГОСТ 4198-75) растворяют в 500 мл воды в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят водой объем раствора до метки. рН полученного раствора доводят потенциометрически до значения 2,4, прибавляя по каплям кислоту ортофосфорную концентрированную (ГОСТ 6552-80). Раствор фильтруют и дегазируют. Срок годности раствора 1 месяц.

Приготовление РСО: около 0,02 г (точная навеска) порошков глицина, лимонной кислоты и янтарной кислоты помещают в колбы вместимостью 20-25 мл, добавляют 10 мл подвижной фазы и растворяют с использованием ультразвуковой бани (15 мин.).

Приготовление испытуемого раствора: около 0,2 г (точная навеска) порошка измельченных 10 таблеток помешают колбу вместимостью 20-25 мл, растворяют в 10 мл подвижной фазы с использованием ультразвуковой бани (15 мин.). хроматография жидкостный флуоресцентный

Методика: Отдельно хроматографируют стандартный и испытуемый раствор в равных объемах (10 мкл). Содержание веществ: глицина (x1), лимонной кислоты (х2), янтарной кислоты (х3) рассчитывают по формуле:

Sx а0 b

х = Sx ах

где Sx - площадь пика вещества на хроматограмме раствора испытуемого препарата; S0 - площадь пика вещества на хроматограмме раствора РСО; а0 - навеска вещества в растворе РСО, г; ах - навеска порошка растертых таблеток, г; b - средняя масса таб- летки (b = 4,0). Проведение анализа: m (глицина) = 0,0256;m (лимонной кислоты) = 0,0242 ;m (янтарной кислоты) = 0,0233

Навеска порошка растертых таблеток = 0,1704.

1. Глицин

,

,

,

2. Лимонная кислота

,

,

,

3. Янтарная кислота

,

,

,

Результаты анализа

Заключение

Исследуемая лекарственная форма соответствует требованиям нормативной документации по количественному содержанию веществ.

Размещено на Allbest.ru