Біядерні комплекси 3d-металів з піразолатними лігандами у моделюванні гідролітичних металоферментів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 546.47,546.56,546.711+547.772+577.15.024

02.00.01 - неорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Біядерні комплекси 3d-металів з піразолатними лігандами у моделюванні гідролітичних металоферментів

Пенкова Лариса Володимирівна

КИЇВ - 2008



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі неорганічної хімії хімічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник доктор хімічних наук, професор Фрицький Ігор Олегович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри фізичної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор Шульгін Віктор Федорович, Таврійський національний університет імені В.І. Вернадського, завідувач кафедри загальної хімії

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Черній Віктор Ярославович Інститут загальної та неорганічної хімії імені В.І. Вернадського НАН України, старший науковий співробітник відділу фізико-неорганічної хімії

Захист відбудеться 27 жовтня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.03 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01601, Київ-601, вул. Володимирська, 64, хімічний факультет, Велика хімічна аудиторія).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01601, Київ-601, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий 3 вересня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, д.х.н., професор Іщенко О.В.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з основних завдань біонеорганічної хімії є створення моделей металоензимів, що здатні адекватно відтворювати координаційне оточення і функціональні можливості металоцентрів природних прототипів. Значна частина металоензимів містить бі- та поліядерні активні центри, які завдяки прояву кооперативної дії йонів металів обумовлюють високу активність каталітичної системи. Біметалічні центри нерідко зустрічаються у складі гідролаз - металоферментів, що каталізують реакції гідролізу. Зокрема, особливу увагу привертають біметалічні фосфатази та фосфоестерази, які є каталізаторами гідролізу фосфоестерів. Актуальність моделювання активних центрів фосфатаз підтверджується їх участю у процесах транскрипції, трансляції, реплікації та розкладу ДНК і РНК, передачі нервових сигналів, синтезі та гідролізі АТФ, утворенні та руйнуванні фосфоліпідних мембран. Інтерес до біоміметичних моделей фосфоестераз, зокрема, пов'язаний з їх потенційною здатністю до знешкодження фосфорорганічних пестицидів та бойових отруйних речовин. У цьому контексті можливим стає створення ефективних антидотів на основі синтетичних каталізаторів гідролізу фосфоестерів, за допомогою яких можна було б забезпечити швидке та своєчасне знешкодження згаданих екотоксикантів.

При одержанні модельних сполук важливим є коректний вибір лігандних систем, що імітують донорні та стеричні властивості координаційного оточення металоцентру ензиму, а також вивчення взаємодії природного субстрату або його аналогів з синтетичними модельними комплексами. Зокрема, для створення моделей активних центрів біметалічних гідролаз в останні роки широко використовуються 3-, 5-заміщені похідні 1Н-піразолу. Функціоналізовані похідні цієї гетероциклічної системи, з одного боку, є потужними хелаторами, а з іншого ? самі по собі проявляють широкий спектр біологічної активності. Такі лігандні системи дають змогу забезпечити певною мірою фіксоване розташування йонів металів при можливості тонкого варіювання відстаней метал?метал, а також геометричних та конформаційних параметрів комплексів шляхом зміни довжини та донорної ємності хелатних замісників у 3- і 5-положеннях, поряд з можливістю подальшої координації молекул субстрату до біметальної матриці (схема 1).

В одержаних раніше піразолатних лігандних системах як пендантні хелатні замісники були використані переважно амінні, алкіламінні, тіоетерні групи. До початку наших досліджень у фаховій літературі не було знайдено повідомлень про одержання 3-, 5-заміщених піразолатних лігандів з електроноакцепторними групами (карбоксильними, оксимними, гідразонними тощо), що одночасно були б високоефективними хелатуючими агентами. Використання таких лігандних систем могло б призвести до значного поліпшення функціональних властивостей модельних сполук через полегшення генерування нуклеофільних частинок за участю згаданих груп, а також за рахунок можливості їх участі в утворенні водневих зв'язків з молекулами субстрату.

Таким чином, одержання поліядерних комплексів, що імітують біядерні активні центри фосфатаз, моделювання активації процесу гідролізу пестицидів та аналогів РНК, з'ясування взаємозв'язку між будовою та функціональною активністю модельних систем є актуальними задачами, що потребують вирішення в рамках підходів сучасної координаційної хімії, хімічної ензимології та біоміметичного каталізу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи пов'язана з тематичним планом науково-дослідних робіт Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Синтез та дослідження координаційних сполук” (номер держреєстрації 0101U002161)); програмою Європейської кооперації в галузі науки і техніки (COST) у рамках напрямку COST D21 “Біоміметичне дослідження металоензимів: функція та інгібіювання”; науковою програмою NATO у рамках напрямку “Нові біоміметичні каталізатори для ефективної дезактивації та знищення органофосфатних нервових агентів та пестицидів”, № CBP.NUKR.CLG 982019; програмою DAAD (програма Леонарда Ейлера та грант № GR 6206?A0609168).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є синтез піразолвмісних лігандів, що здатні інгібіювати ферментативну активність лужної фосфатази, та комплексів на їх основі, що імітують активні центри фосфатаз, дослідження процесів комплексоутворення в системах ліганд?цинк, одержання комплексних сполук цинку(II), купруму(II), нікелю(II) та мангану(II) на основі піразолатних лігандів, встановлення їх будови, спектральних та магнітних властивостей, визначення каталітичної активності модельних комплексів у реакціях гідролізу фосфоестерів.

Для досягнення поставленої мети було необхідно розв'язати наступні задачі: піразолвмісний іганд комплексоутворення інгібіювання

розробити методи синтезу полінуклеативних лігандів, придатних для одержання функціональних моделей ензимів;

дослідити реакції взаємодії субстратів з ферментом лужна фосфатаза у присутності синтезованих піразолвмісних сполук;

знайти раціональні шляхи одержання поліядерних координаційних сполук на основі синтезованих лігандів;

встановити будову, особливості спектральних та магнетохімічних властивостей синтезованих сполук;

?встановити закономірності перебігу реакцій комплексоутворення в системах L?Zn2+?solv, (L = PzDCA, PzDOx, PzOxCA, PzDHn, solv = H2O, CH3OH).

-визначити кінетичні параметри реакцій каталітичного гідролізу фосфоестерних субстратів у присутності модельних біядерних компдексів.

Об'єкт дослідження: Ліганди хелатно-місткового типу на основі 1Н-піразолу з сильно електроноакцепторними групами, які одночасно є високоефективними хелатуючими агентами (карбоксильні, оксимні, гідразонні) у положеннях 3- і 5- гетероциклу; поліядерні комплекси перехідних металів на основі полідентатних азотвмісних лігандів хелатно-місткового типу, придатні для структурного та функціонального моделювання поліметалічних активних центрів гідролаз та оксидаз.

Предмет дослідження: Методики синтезу піразолатних лігандів, будова, спектральні та магнітні властивості комплексів на їх основі; закономірності реакцій комплексоутворення в системах L?Zn2+?solv, (L = PzDCA, PzDOx, PzOxCA, PzDHn, solv = H2O, CH3OH) та кінетичні параметри каталітичного гідролізу біологічно важливих фосфоестерів.

Методи дослідження: рентгеноструктурний аналіз, мас-спектрометрія, ІЧ, ЕПР, ЯМР спектроскопія, UV-Vis спектроскопія, магнетохімічний метод, потенціометричне рН-титрування.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено методики синтезу нових лігандів хелатно-місткового типу похідних 1Н-піразолу з електроноакцепторними групами (карбоксильними, оксимними, гідразонними) у положеннях 3- і 5- гетероциклу. Проведено дослідження комплексоутворення цинку(ІІ), купруму(ІІ), нікелю(ІІ) та мангану(ІІІ) з полідентатними лігандами у водних розчинах, встановлено склад та визначено константи утворення комплексів.

Розроблено методики синтезу поліядерних комплексів - біоміметичних моделей металоензимів. Отримані комплекси охарактеризовано методами ІЧ, ЕПР, ЯМР та UV-Vis спектроскопії, визначені їх магнітні характеристики, методом рентгеноструктурного аналізу встановлено будову 10 нових сполук.

Досліджено процеси інгібіювання фосфатазної активності лужної фосфатази піразолвмісними лігандами. Встановлено кінетичні параметри реакції гідролізу фосфорорганічного пестициду параоксону та синтетичного аналога РНК - 2-(оксипропіл)-п-нітрофеніл фосфату в присутності синтезованих цинквмісних модельних систем.

Практичне значення одержаних результатів. На основі поліядерних комплексів одержано каталізатори реакцій гідролізу біологічно важливих субстратів та пестицидів. Контроль активності каталізаторів здійснюється варіюванням відстані метал-метал шляхом зміни бокових замісників піразолпохідних лігандів. Біядерні комплекси цинку(ІІ) на основі лігандів (4-метил-1H-піразол-3,5-диіл)діетанон дигідразону (PzDHn) та 4-метил-3,5-дигідроксиіміно-1H-піразолу (PzDOx) виявились високоефективними каталізаторами у реакціях гідролізу синтетичного аналога РНК - 2-(оксипропіл)-п-нітрофеніл фосфату (HPNP) та пестициду параоксон-етилу (РОЕ). Встановлено, що ліганди PzDCA, PzDOx, PzOxCA, PzDHn є ефективними інгібіторами каталітичної активності лужної фосфатази у реакції гідролізу п-нітрофеніл-фосфату.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи та обробка одержаних експериментальних даних виконані здобувачем особисто. Основні ідеї, реалізовані в дисертаційній роботі, було сформульовано спільно з науковим керівником д.х.н., проф. І.О. Фрицьким. Заключний аналіз отриманих результатів проведено за участю к.х.н., доц. В.О. Павленка та к.х.н. О.В. Присяжної. Синтез частини органічних сполук було проведено разом з д.х.н., ст.н.с. О.А. Варзацьким та аспірантами університету м. Геттінген (Німеччина) А. Захсе та Д. Ноель.

Рентгеноструктурні дослідження проведені в лабораторії рентгеноструктурного аналізу м. Йоенсуу (Фінляндія) під керівництвом проф. М. Хаукка та в Інституті неорганічної хімії університету м. Геттінген (Німеччина) доктором С. Діхертом. Дослідження комплексоутворення у розчині виконано при участі співробітників Вроцлавського університету (Польща) під керівництвом проф. Г. Козловського. Обробка результатів дослідження комплексоутворення у розчині виконана разом зі студентами М.П. Азархом та М.А. Назарковським. Вимірювання магнітної сприйнятливості проводилися в Інституті неорганічної хімії університету м. Геттінген (Німеччина) спільно з проф. Ф. Майєром.

Апробація результатів дисертації. Результати представленої роботи доповідались на національних та міжнародних конференціях: ІV Всеукраїнській конференції «Сучасні проблеми хімії» (м. Київ, Україна, 2004 р.), XIІ Міжнародній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з фундаментальних наук «ЛОМОНОСОВ - 2005» (м. Москва, Росія, 2005 р.), XV Конференції «Фізичні методи в координаційній та супрамолекулярній хімії» та XVII читаннях в пам'ять академіка А. Аблова (м. Кишинів, Молдова, 2006 р.), XIV Міжнародній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з фундаментальних наук «ЛОМОНОСОВ - 2007» (м. Москва, Росія, 2007 р.), XIII Міжнародній конференції з біонеорганічної хімії (м. Відень, Австрія, 2007 р.), ХХІІІ Міжнародній Чугаєвській конференції з координаційної хімії (м. Одеса, Україна, 2007 р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 3 статті та 6 тез доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п'яти розділів, висновків, списку використаних джерел (153 найменувань) та двох додатків. Робота викладена на 153 сторінках друкованого тексту і містить 74 рисунки та 18 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність роботи, сформульовано мету та задачі дослідження, відображено практичне значення отриманих результатів.

Перший розділ присвячено аналізу наукової літератури за темою дисертаційної роботи. Розглянуто особливості будови активних центрів таких ензимів, як лужна фосфатаза, P1 нуклеаза та фіолетова кисла фосфатаза. Проведено огляд відомих на момент виконання роботи моделей активних центрів гідролітичних металоферментів, зокрема, кореляцій між їх будовою та каталітичними властивостями. Детально розглянуто приклади використання лігандних систем на основі 1H-піразолу, що містять хелатуючі групи у 3- і 5- положеннях гетероциклу, у створенні металовмісних біоміметиків.

У другому розділі описано синтез нових лігандів на основі 1Н-піразолу, наведено методики синтезу поліядерних комплексів цинку(ІІ), купруму(ІІ), нікелю(ІІ) та мангану(ІІІ), а також фізико-хімічні методи досліждення, які були використані в роботі.

Третій розділ присвячено дослідженню будови та властивостей поліядерних координаційних сполук на основі піразолатних лігандів з цинком(ІІ), що є біоміметичними моделями цинквмісних гідролаз.

Попередньо обговорено різні можливості координації лігандів до металу. PzOxCA - полінуклеативний ліганд, тому можлива реалізація декількох способів його координації.

Очевидно, що з усіх перелічених вище типів найбільш сприятливі умови утворення стійких комплексів реалізуються при координації ліганду до йонів металу через атоми оксигену карбоксильної групи, нітрогену депротонованих піразольних циклів та оксимних груп (схема 2, в), або через атоми оксигену оксимних груп (схема 2, г) з утворенням металохелатних циклів.

При розгляді можливих типів координації PzDCA, PzDOx та PzDHn можна побачити, що для них найбільш імовірним способом є бінуклеативний.

Дослідження особливостей комплексоутворення PzOxCA та PzDCA з солями цинку(ІІ) у водно-метанольних розчинах було проведено з використанням методу рН-потенціометрії.

PzDCA характеризується трьома константами дисоціації: pKa3 = 5,83 та pKa2 = 4,38 відповідають ступінчастій іонізації карбоксилатних груп, pKa1 = 1,64 відповідає йонізації піразольного циклу. В той же час ліганд PzOxCA характеризується двома константами дисоціації pKa1 = 1,94 та pKa2 = 5,67, що можуть бути віднесені до протонування атому нітрогену піразольного кільця та карбоксилатної групи, відповідно. Діаграми розподілу комплексних часток для PzOxCA та PzDCA з Zn2+, отримані за допомогою потенціометричних розрахунків, відповідні константи стійкості наведено в табл. 1.

Таблиця 1 - Константи протонування лігандів PzDCA та PzOxCA та константи утворення комплексів цинку(ІІ) при 25°C; 0,1 M (NaClO4)

Частинки	PzDCA	PzOxCA
	log	pKa	log	pKa
H3L	11,85(5)	1,64 (Pz-H)
H2L	10,21(1)	4,38 (COOH)	7,62(2)	1,94 (Pz-H)
HL	5,83(1)	5,83 (COOH)	5,672(9)	5,67
ZnL			4,16(2)
ZnHL	9,76(2)
Zn2L2	15,14(3)
Zn2 H-2L2	6,13(5)		-1,85(6)	6,83
Zn2 H-3L2			-8,68(6)	8,32
Zn2 H-4L2			-17,00(9)

Взаємодія солей цинку(ІІ) з PzOxCA, PzDHn, PzDOx та PhPzDox у співвідношенні 2 : 2 призводить до утворення біядерних комплексів нейтрального чи катіонного типу: 2Zn2+ + 2L [Zn2(L-2H)2]

або 2Zn2+ + 2L [Zn2(L-H)2]2+

Отриманні сполуки були вивчені методами ІЧ та 1Н ЯМР спектроскопії, що дозволило встановити спосіб координації лігандів. У випадку комплексів [Zn2(PzOxCA-2Н)2Py4]·2Н2О (К1), [Zn2(PzDHn-Н)2(CH3CОО)2]·ДМФА·2Н2О (К2), [Zn2(PhPzDOx-2H)2] (К4) одержані висновки були підтверджені даними РСтА.

Згідно з результатами РСтА, кристали К1 складаються з біядерних нейтральних комплексних молекул [Zn(PzOxCA-2Н)2Py4] та сольватних молекул води. Комплексна частка є центросиметричним димером, причому центр інверсії знаходиться на середині відрізку, що з'єднує два атоми цинку(ІІ). Відстань Zn(1)···Zn(1') (1,5-x, 0,5-y, 1-z) складає 4,1145(9) Е. Комплексна частка містить два залишки двічі депротонованих лігандів і два йони цинку(II), що умовно лежать в одній площині. Слід зазначити, що сполука утворюється у слабколужному середовищі, тому депротонуються тільки атом нітрогену піразольного кільця та карбоксильна група, в той час як оксимна група залишається протонованою.

Кристали К2 складаються з біядерних комплексних молекул [Zn2(PzDHn-Н)2(CH3CОО)2], сольватних молекул ДМФА та води. Відстань Zn(1)···Zn(2) складає 4,094(7) Е.

Знайдений цікавий факт монодентатно-водневозв'язаної координації ацетат-йону, стабілізованої містковою молекулою води, що на нашу думку, є важливою знахідкою у контексті моделювання активних центрів біметалічних ферментів. Він наочно демонструє можливість ефективного зв'язування субстратів не тільки за рахунок утворення зв'язків метал-ліганд, але і водневих зв'язків. Це дозволяє розглядати запропоновані моделі як багатофакторні, які більш достовірно відображають взаємодію субстрату з активним центром. Адже в багатьох ферментах реалізується утворення водневих зв'язків із субстратом поряд з координаційними.

В основі кристалічної будови сполуки К4 лежать біядерні комплексні молекули, що містять два залишки двократно депротонованих лігандів і два йони цинку(II). За просторовою будовою можна розрізнити молекули двох типів: (1) що містять два кристалографічно незалежні атоми цинку [відстань Zn(1)···Zn(2) складає 3,761 Е]; (2) центросиметричні частки [відстань Zn(3)···Zn(3') (-x, -y, -z) складає 3,750 Е].

Як каталізатори реакцій гідролізу фосфоестерів випробувано комплекси на основі PzDCA (K5), PzOxCA (K1), PzDHn (K2) та PzDOx (K3) з цинком(ІІ), що можуть виступати аналогами активних центрів гідролаз. Каталітична активність біядерних комплексів цинку(ІІ) на основі цих лігандів у реакціях гідролізу перевірялася по відношенню до пестицидів параоксон-етил (РОЕ) та паратіон-метил (PThM), а також до 2-гідроксипропіл-п_нітрофеніл фосфату (HPNP), що використаний як модельний аналог РНК. Комплекси не проявили активності в системах з PThM, однак виявились ефективними каталізаторами в реакцях гідролізу РОЕ та HPNP. Гідролітичне розщеплення РОЕ та HPNP у лужному середовищі вивчали шляхом фотометричного контролю.

Кінетичні дані для всіх комплексів показують, що початкова швидкість реакції гідролізу РОЕ та HPNP лінійно залежить від концентрації каталізатора. Константи псевдопершого порядку kobs (розраховані за рівнянням v0 = kobs[каталізатор]0) наведено у табл. 2.

Таблиця 2 - Кінетичні параметри реакції гідролітичного розщеплення РОЕ та HPNP у присутності каталізаторів К1, К2, К3 та К5

Каталізатор	kobs, с-1	kcat*, с-1	КМ*, моль•л-1
РОЕ
К1	23,26 • 10-7	4,39(±0,4) • 10-5	26±1
К2	6,36 • 10-7	1,28(±0,2) • 10-4	13±1
К3	39,46 • 10-7	1,52(±0,3) • 10-4	35±1
К5	9,48 • 10-7	8,98(±0,6) • 10-5	24±1
автогідроліз	2,68 • 10-7	-	-
HPNP
К1	7,88 • 10-6	1,34(±0.3) • 10-3	12,4±0.2
К2	53,09 • 10-6	3,35(±0.8) • 10-4	74±2
К3	23,41 • 10-6	7,58(±0.2) • 10-4	21,5±0,5
К5	8,84 • 10-6	5,53(±0.2) • 10-4	23,6±0,3
автогідроліз	3,70 • 10-7	-	-

* kcat ? константа псевдопершого порядку швидкості гідролізу зв'язаного з каталізатором субстрату, або число оборотів; KM ? константа Miхаеліса; визначення проводиться після лінеаризації залежності

де

(рівняння (dc/dt)-1 = (kcat·[каталізатор])-1 + (KM·kcat·[каталізатор]·[субстрат]0)-1, що ілюструється графіком Лайнуівера-Берка).

Швидкості автогідролізу РОЕ та HPNP є близькими, а в присутності цинквмісних комплексів як каталізаторів константи kobs для HPNP на два порядки вище, ніж для РОЕ. Це можна пояснити дещо різною природою активації субстратів: у випадку HPNP існує можливість для координації до обох атомів цинку, тоді як у випадку РОЕ більш імовірною є координація лише до одного з них. Додатково швидкість реакції у випадку HPNP підвищується за рахунок того, що нуклеофільне заміщення при атомі фосфору відбувається внутрішньомолекулярно за участю гідроксильної групи 2-гідроксипропільного залишку самого субстрату, в результаті чого проходить інтрамолекулярна циклізація фосфодіестеру. Величини констант kobs підпорядковуються різним послідовностям: К3 К1 > К5 К2 для РОЕ, К2 К3 > К5 К1 для HPNP. Це також може бути пояснено відмінностями у механізмах гідролітичного розщеплення субстратів.

З метою моделювання активних центрів гідролаз було досліджено комплексоутворення вищенаведених лігандів з нікелем(ІІ), купрумом(ІІ) та манганом(ІІІ), результати якого представлено у четвертому розділі. Введення атомів зазначених металів замість цинку до складу комплексів з піразолатними лігандами викликане можливістю всебічного дослідження властивостей таких сполук з використанням широкого спектру сучасних фізико-хімічних методів.

Згідно з результатами РСтА, сполука [Ni2(PzOxCA-2Н)2Py4]·2Н2О (К6) (відстань Ni•••Ni 4,065 Е) має молекулярну будову і є ізоструктурною до К1.

Для комплексу K6 дослідження температурної залежності магнітної сприйнятливості (cM) було проведено в діапазоні температур 1,7 - 300 K. При кімнатній температурі значення еф становить 4,07 М.Б., що знаходиться у відповідності з розрахованим для двох іонів нікелю(ІІ), які не взаємодіють (3,80 М.Б.). При зниженні температури до 85 K еф повільно спадає до 3,47 М.Б., і при температурах нижче 75 K зменшується більш різко, досягаючи величини 0,47 М.Б. при 2 K, що свідчить про наявність антиферомагнітного обміну між металічними центрами.

Експериментальні дані були апроксимовані, використовуючи процедуру наближення згідно спін-гамільтоніану Гейзенберга-Дірака-ван-Флека для ізотропних обмінних взаємодій та Зеєманівського розщеплення:

H = -2J1S1•S2 + gмB(S1 + S2)B (1)

Внесок парамагнітних домішок (с) зі спіном S = N/2 та температурно-незалежний парамагнетизм (ТНП) було включено згідно рівняння:

Найкраще узгодження експериментальних та розрахованих даних було досягнуто для J = -15,23 см-1, g = 2,175, r = 3,9 % та R2 = 3,28·10-6.

З лігандом PzOxCA було отримано три комплекси купруму(ІІ). В залежності від рН середовища, ліганд депротонувався у різній мірі, тому вдалося виділити різні нейтральні частинки: [Cu2(PzOxCA-2Н)2]0 та [Cu3(PzOxCA-3Н)2]0. При додаванні одного еквіваленту Cu(ClO4)2 до диметилсульфоксидного розчину ліганду утворювався синій розчин, з якого виділено кристали [Cu2(PzOxCA-2Н)2 (ДМСО)(Н2О)]·Н2О (К8). Другий біядерний нейтральний комплекс [Cu2(PzOxCA-2Н)2(ДМСО)2]·Н2О (К9) отримували з аналогічної суміші, але у цьому випадку додавали один еквівалент піразину як буфер. Структури молекулярних комплексів К8 та К9 досить подібні.

При взаємодії солей купруму(ІІ) з PzOxCA у співвідношенні 2 : 2 чи 3 : 2 в лужному середовищі в присутності піридину утворюється нейтральний комплекс зі співвідношенням M:L = 3:2 за наступною реакцією: 3Cu2+ + 2PzOxCA + 5Py 6H+ + [Cu3(PzOxCA-3Н)2(Py)5] (К10).

Через те, що в сполуках К8 та К9 відстані Сu···Cu та координаційні поліедри ідентичні, магнітні властивості були досліджені тільки для комплексу К9.

Для комплексу К9 при кімнатній температурі значення еф становить 1,79 М.Б., що менше розрахованого значення для двох іонів купруму(ІІ), які не взаємодіють (2,45 М.Б.). Це свідчить про наявність антферомагнітного обміну між металічними центрами вже при даній температурі. При зниженні температури значення еф зменшується, виходячи на поличку при 65 К, і при 2 К складає лише 0,2 М.Б. Для комплексу К10 при 295 К значення еф становить 2,27 М.Б., і є нижчим, ніж розраховане для трьох іонів купруму(ІІ), що не взаємодіють (3,0 М.Б.). При зниженні температури еф зменшується, виходячи на поличку при 100 К, і при 2 К складає 1,97 М.Б., що свідчить про наявність антиферомагнітного обміну між металічними центрами, при цьому один електрон залишається неспареним (що відповідає розрахованим даним 1,73 М.Б.).

Експериментальні дані були апроксимовані, використовуючи процедуру наближення згідно спін-гамільтоніану Гейзенберга-Дірака-ван-Флека для ізотропних обмінних взаємодій та Зеєманівського розщеплення (рівняння 3 для К9, 4 для К10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Внесок парамагнітних домішок (с) зі спіном S = N/2 та температурно-незалежний парамагнетизм (ТНП) було включено згідно рівняння 2.

Таблиця 3 - Магнітні дані для комплексів К9 та К10

Комплекс	К9	К10
g1	2,042	2,232
g2	-	2,100
J (cм-1)	-160	-191
с (%)	2,1	1,0
TНП (cм3 мoль-1)	8,56·10-4	1,80·10-4



Найкраще узгодження експериментальних та розрахованих даних було досягнуто для параметрів, наведених в таблиці 3.

Значна антиферомагнітна взаємодія спостерігається для обох комплексів завдяки значному у-перекриванню між копланарними магнітними орбіталями та містковими фрагментами. Для біядерних біс(м-піразолато)-місткових сполук купруму(ІІ) параметр J зазвичай знаходиться у діапазоні 140-270 cм-1, тому значення -160 см-1 для К9 повністю закономірне.

У випадку К10 взаємодія (J = -191 cм-1) є навіть більшою, ніж для К9. Дійсно, оксимні містки є ефективними медіаторами антиферомагнітного обміну, при цьому значення J може сягати ?1000 см-1. Сильніша взаємодія у К10 порівняно з К9 викликана компліментарністю двох місткових груп.

Інтерпретація спектрів ЕПР заморожених водно-диметилсульфоксидних розчинів (ДМСО:Н2О = 80:20) системи PzOxCA:Cu2+ = 1:1 в залежності від рН показала, що при низьких значеннях рН комплексоутворення не відбувається, і в розчині існують вільні сольватовані йони купруму. Розраховані параметри спектру (gx = gy = 2,080; gz = 2,406; A = 10,2•10?4, AІІ = 118,5•10?4 см?4) відповідають аксіально-симетричному оточенню атома купруму атомами оксигену (основний стан ). У нейтральному середовищі утворюється біядерна частка з сильною обмінною взіємодією, про що свідчить присутність в спектрі широкої асиметричної нерозділеної смуги, та наявність у ESI мас-спектрах водно-диметилсульфоксидних нейтральних розчинів сигналу [Cu2(PzOxCA_2Н)2-Н]-.

При підвищенні рН спостерігається утворення моноядерної частинки: спектри мають розділену НТС від ядра купруму в області паралельної орієнтації. Крім того, в області перпендикулярної орієнтації спостерігається добре розділена додаткова надтонка структура (ДНТС) від атомів нітрогену лігандів. Моделювання спектру дало можливість визначити його параметри: gx = 2,032; gy = 2,049; gz = 2,180; Ax = 9,7•10?4; Ay = 14,6•10?4; Az = 198,8•10?4; AN ? 15,5•10?4 см?1). Значення gІІ, АІІ та характер ДНТС свідчать про присутність іонів Cu2+ з плоско-квадратним [CuN4] оточенням.

Ідентифікація моноядерної частинки з мотивом [CuN4] в розчині методом ЕПР та масс-спектрометрично дала змогу встановити як відбувається самоорганізація трияденої сполуки К10. Процес перебігає через формування моноядерної аніонної частинки [Cu(PzOxCA-2Н)2]2- чи [Cu(PzOxCA-3Н)2]4-, що характеризується хромофором [CuN4], з наступною прикоординацією ще двух іонів купруму з результуючим координаційним оточенням {N,O,O} від лігандів та молекул піридину.

Взаємодія PzOxCA з солями мангану(ІІІ) відбувалась за наступною схемою: 2Mn3+ + 2PzOxCA [Mn(PzOxCA-3H)]2 + 6H+. Зелені кристали [MnIII2(PzOxCA-3Н)2(CH3ОH)4]·2CH3ОH (К11) та [MnIII2(PzOxCA-3Н)2(Py)4]·2Py (К12) були отримані з метанолу повільною дифузією парів діетилового ефіру та піридину, відповідно.

За результатами ESI мас-спектрометрії у спектрі розчину К11, присутній єдиний сигнал, що відповідає частинці [Mn2(PzOxCA-3H)2(CH3OH)3ДМФА-1Н]+ (m/z = 638,6 а.о.м.), тобто у розчині переважно існують частинки зі співвідношенням М : L = 2 : 2.

Кристали комплексів складаються з центросиметричних нейтральних молекул [MnIII2(PzOxCA-3Н)2(CH3ОH)4] або [MnIII2(PzOxCA-3Н)2(Py)4] та двох сольватних молекул метанолу чи піридину для К11 та К12, відповідно. Відстані метал-метал складають 3,9544(6) та 3,9932(9) Е для К11 та К12, відповідно.

У п'ятому розділі обговорюється можливість інгібіювання ферментативної активності лужної фосфатази (ЛФ) піразолвмісними бінуклеативними лігандами.

При вивченні нових каталітичних систем бажано дослідити, наскільки подібною є топологія активного центру до геометрії лігандів. Оскільки факт сповільнення процесу гідролізу може свідчити про просторову сумісність системи "біметалічний центр-ліганд", було досліджено можливу інгібіторну дію піразолвмісних ліган-

дів на каталітичну активність цинквмісного ензиму лужної фосфатази з біядерним активним центром (міжметальна відстань у лужній фосфатазі та розмір «кишені» активного центру добре корелює зі стандартними значеннями міжметальних відстаней у типових біметальних комплексах з піразольними лігандами, що містять замісники в третьому і п'ятому положеннях гетероциклу, при реалізації місткових способів координації).

Дослідження інгібіювання каталітичної активності лужної фосфатази з E. coli сполуками PzDCA, PzOxCA, PzDHn та PzDOx проводили при 298 К та рН = 8,0. Концентрація водного розчину лужної фосфатази складала 60 одиниць/мл, як субстрат викорисовували моно(4-нітрофеніл)фосфат (МNPP).

З графіків Лайнуівера-Берка, що ілюструють залежність 1/v0 від 1/[S], S - концентрація субстрату МNPP, були розраховані значення констант Міхаеліса (КМ), максимальної швидкості реакцій vmax (табл. 4) та визначено типи інгібіювання.

Таблиця 4 - Кінетичні параметри реакції гідролітичного розщеплення МNPP, промотованої ЛФ, у присутності інгібіторів PzDCA, PzOxCA, PzDHn та PzDOx

Інгібітор	КМ•105, моль•л-1	Vmax•106, моль•л-1•хв-1
Реакція без інгібіювання	8,44	3,82
PzOxCA	6,50	2,92
PzDOx	7,27	3,01
PzDCA	6,04	3,23
PzDHn	9,94	3,35

У відповідності до характеру графічних залежностей (рис. 11, а-г) у присутності інгібіторів спостерігається неконкурентне (PzOxCA та PzDOx), конкурентне (PzDCA) та змішано-неконкурентне (PzDHn) інгібіювання. Проте, розраховані кінетичні параметри (табл. 5) для процесів за участю інгібіторів PzOxCA та PzDOx свідчать, що їх також можна віднести до змішано-неконкурентного типу інгібіювання. Отримані дані підтверджують доцільність використання PzOxCA, PzDOx, PzDCA та PzDHn у моделюванні активних центрів фосфатаз.



ВИСНОВКИ

1. Вперше синтезовано лігандні системи хелатно-місткового типу на основі 3-, 5-заміщених 1Н-піразолів з електроноакцепторними групами (карбоксильними, оксимними, гідразонними): 3-[N-гідроксиетанімідоіл]-4-метил-1H-піразол-5-карбонова кислота (PzOxCA), (4-метил-1H-піразол-3,5-диіл)діетанон дигідразон (PzDHn), (4-феніл-1H-піразол-3,5-диіл)біс(фенілметанон) діоксим (PhPzDOx); охарактеризовано їх будову та кислотно-основні властивості.

2. Методами потенціометричного рН-титрування, ESI, MALDI та GALDI мас-спектрометрії досліджено процеси комплексоутворення йонів цинку з 3-, 5-заміщеними піразолвмісними лігандами в розчині. Визначено константи утворення комплексів цинку(ІІ), встановлено розподіл комплексних частинок в залежності від рН та способи координації лігандів. Показано, що у нейтральному та слабколужному середовищі найстійкішими є частинки зі співвідношенням М : L = 2 : 2.

3. Методами спектрофотометричного титрування, ESI мас-спектрометрії та ЕПР встановлено, що рН діапазон існування комплексних частинок, які утворюються при взаємодії солей Cu(ІІ) з PzOxCA у розчині зі співвідношеннями M : L = 1 : 2 та 2 : 2, складає 4,5-8.

4. Розроблено методики синтезу поліядерних координаційних сполук, за якими синтезовано 11 нових комплексів, що є моделями активних центрів гідролітичних ензимів. За допомогою методів мас-спектрометрії, електронної та ІЧ спектроскопії встановлено їх склад та способи координації лігандів.

5. Методом рентгеноструктурного аналізу встановлено будову 10 нових комплексів. Показано, що:

всі комплекси мають молекулярну будову з планарним розташуванням піразолатних лігандів та йонів металів;

у випадку оксимвмісних лігандів реалізуються три найбільш типові способи координації оксимної групи: 1) через атом нітрогену; 2) через атом оксигену, що спричинене депротонуванням групи в сильнолужному середовищі; 3) 2-(N,O)-місткова координація оксимної групи, яка реалізується у триядерному комплексі ([Cu3(PzOxCA-3Н)2(Py)5] (К10));

у кристалах упаковка здійснюється за рахунок р-стекінгових та С-Н···Х (де Х = О, N) взаємодій, а також водневих зв'язків за участю молекул розчинників.

6. За допомогою дослідження кріомагнетохімічної поведінки поліядерних комплексів в інтервалі температур 1,7-300 К встановлено, що в усіх сполуках реалізується сильний антиферомагнітний обмін між іонами металів, що обумовлено ефективною передачею взаємодії по механізму надобміну через місткові оксимні групи та орбітальні системи піразольних циклів.

7. Дослідження каталітичних реакцій гідролізу пестициду параоксон-етилу (РОЕ) та внутрішньомолекулярної трансестерифікації активованого фосфодіестеру - синтетичного аналога РНК 2-(оксипропіл)-п-нітрофеніл фосфату (HPNP) в присутності біядерних комплексів на основі PzDCA, PzOxCA, PzDHn та PzDOx з цинком(ІІ) дозволило встановити, що:

перебіг реакцій підпорядковується моделі Міхаеліса-Ментен;

взаємодія комплекс-субстрат є дійсно каталітичним актом, оскільки за допомогою однієї молекули комплексу розщеплюється більше, ніж одна молекула субстрату;

розраховані кінетичні параметри kobs (константа швидкості гідролізу псевдопершого порядку), КМ (константа Міхаеліса) та kcat (число оборотів) свідчать про високу ефективність комплексів як каталізаторів в даних реакціях;

8. Запропоновано механізми кооперативної дії металоцентрів у реакціях гідролізу, які каталізують цинкові гідролази. Показано, що він більш достовірно відображає взаємодію субстрату з активним центром, ніж раніше запропоновані в літературних джерелах моделі.

9. Встановлено, що 3-, 5-заміщені піразолвмісні ліганди є ефективними інгібіторами цинквмісного ензиму лужної фосфатази: їх введення суттєво уповільнює реакцію гідролізу моно(п-нітрофеніл)фосфату (МNPP) у присутності лужної фосфатази, що може бути пов'язане з блокуванням біядерного фрагменту активного центру ферменту координованими атомами нітрогену піразолу та бокових замісників гетероциклу.



СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сatena-Poly[[[trans-diaquabis(pyridine-kN)cobalt(II)]-м-(4-{N'-[1-(3-acetyl-4-methyl-1H-pyrazol-5-yl)ethylidene]-hydrazino}benzoato-k3O:N,N')-[bis-(pyridine-kN) cobalt(III)]-м-(4-{N'-[1-(3-acetyl-4-methyl-1H-pyrazol-5-yl)ethylidene]hydrazino}benzoato- k3N,N':O)]-perchlorate 3.66-hydrate] / L. Penkova, M.P. Azarkh, M. Haukka, F. Meyer, I.O. Fritsky // Acta Cryst. - 2008. - Vol. E64, № 2. - P. m432-m433. (Особистий внесок: синтез описаної речовини, інтерпретація даних РСтА).

2. Efficient Syntheses of Some Versatile 3,5-Bifunctional Pyrazole Building Blocks / A. Sachse, L. Penkova, G. Noлl, S. Dechert, O.A. Varzatskii, I.O. Fritsky, F. Meyer // Synthesis. - 2008. - № 5. - P. 800-806. (Особистий внесок: синтез частини описаних речовин, систематизація та формулювання висновків з частини літературних даних, що стосується синтезу піразолпохідних з замісниками у 3-,4- і 5- положеннях гетероциклу).

3. Інгібіювання ферментативної активності лужної фосфатази бінуклеативними піразолвмісними лігандами / Л. Пенкова, В. Павленко, О. Присяжна, І. Фрицький // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія хімічна. - 2008. - № 46. - С. 19-21. (Особистий внесок: постановка задачі дослідження, синтез описаних сполук та інтерпретація спектральних даних, формулювання висновків).

4. Пенкова Л.В. Порівняння можливостей прямого та електросинтезу на прикладі взаємодії нікелю з карбоновими кислотами у неводних розчинах: матеріали Четвертої всеукраїнської конференції студентів та аспірантів «Сучасні проблеми хімії», (Київ, 20-21 травня 2004 р.) - К.: ВПЦ КНУ, 2004. - 192 с.

5. Пенкова Л.В., Павленко В.А., Фрицкий И.О. Синтез и исследование новых оксимсодержащих пиразолатных лигандов: материалы XIІ Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2005», (Москва, 12-15 квітня 2005 г., Т. 1) - М.: ООО «Книжный дом «Университет», 2005. - 219 с.

6. Penkova L.V., Fritsky I.O., Pavlenko V.O. Haukka M. Binuclear Complexes Based on bis(Amide) Derivative of 8-Hydroxyquinoline as Models of Bimetallic Active Sites of Metaloenzymes: materials of XV-th Conference "Physical Methods in Coordination and Supramolecular Chemistry" and the XVII-th Reading in memory of Academician A. Ablov, September 27 - October 1, Chiєinгu (Moldova), 2006. - 126 p.

7. Пенкова Л.В., Назарковский М.А., Фрицкий И.О. Получение и свойства координационных соединений на основе дигидразон 3,5-диацетил-4-метил-1H-пиразола: материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2007», (Москва, 11-14 апреля 2007 г.) - М.: ООО «Книжный дом «Университет», 2007. - 579 c.

8. Penkova L., Pavlenko V.A., Meyer F., Fritsky I.O. Organophosphorus Pesticides by Zinc(II) Binuclear Pyrazole-Based complexes: materials of 13th International Conference on Biological Inorganic Chemistry, (Vienna, Austria, July 15 - 20, 2007) - Vienna: Springer, 2007. - 250 p.

9. Пенкова Л.В., Павленко В.А., Фрицкий И.О., Присяжная Е.В. Строение, спектральные и криомагнетохимические свойства биядерных комплексов марганца(III) на основе 4-метил-1Н-пиразол-3-гидроксиимино-5-карбоновой кислоты: материалы XXІІI Международной Чугаевской конференции по координационной химии, (Одесса, 4-7 сентября 2007 г.) - К.: ВПЦ КНУ, 2007. - 783 с.



АНОТАЦІЯ

Пенкова Л. В. Біядерні комплекси 3d-металів з піразолатними лігандами у моделюванні гідролітичних металоферментів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.01 - неорганічна хімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена синтезу нових лігандів хелатно-місткового типу на основі 1Н-піразолу з електроноакцепторними групами, дослідженню їх комплексоутворення з йонами 3d-металів, встановленню складу та визначенню констант утворення комплексів. Розроблено методики синтезу біоміметичних моделей металоензимів, за якими синтезовано 11 нових координаційних сполук. Методом рентгеноструктурного аналізу встановлено будову 10 нових сполук. Визначено взаємозв'язок між будовою та магнітною поведінкою одержаних комплексів.

Одержано каталізатори реакцій гідролізу біологічно важливих субстратів пестицидів на основі поліядерних комплексів. Встановлено кінетичні параметри реакції гідролізу параоксону та 2-(оксипропіл)-п-нітрофеніл фосфату в присутності синтезованих цинквмісних модельних систем.

Вперше досліджено процеси інгібіювання фосфатазної активності лужної фосфатази піразолвмісними лігандами.

Ключові слова: моделювання металоферментів, каталіз, інгібіювання, піразол, рентгеноструктурний аналіз, магнітні властивості.



АННОТАЦИЯ

Пенкова Л. В. Биядерные комплексы 3d-металлов с пиразолатными лигандами в моделировании гидролитических металлоферментов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.01 - неорганическая химия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

Диссертационная работа посвящена синтезу новых лигандов хелатно-мостикового типа на основе 1Н-пиразола, проведению исследований комплексообразования 3d-металлов с полученными лигандами, определению состава и определению констант образования комплексов. Разработаны методики синтеза биомиметических моделей металлоэнзимов, по которым синтезировано 11 новых координационных соединений. Методом рентгеноструктурного анализа исследовано строение 10 новых соединений. Исследованы магнетохимические свойства и установлены взаимосвязи между строением и магнитным поведением полученных комплексов.

Найдены кинетические параметры реакции гидролиза параоксона и 2-(оксипропил)-п-нитрофенил фосфата в присутствии синтезированных комплексов.

Впервые исследовано процессы ингибирования фосфатазной активности щелочной фосфатазы пиразолсодержащими лигандами.

Ключевые слова: моделирование металлоферментов, катализ, ингибирование, пиразол, рентгеноструктурный анализ, магнитные свойства.



SUMMARY

Penkova L.V. 3d-Metal Dinuclear Complexes with Pyrazole-Based Ligands in the Hydrolytic Metalloenzyme Modelling. - Manuscript.

Thesis for candidate's degree by speciality 02.00.01 - inorganic chemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2008.

The thesis concerns the synthesis 3d-metal di- and trinuclear complexes with pyrazole-based symmetric and asymmetric ligands, their characterization and study of their catalytic properties, inhibition and magnetic behavior.

A series of dizinc(II) dicopper(II), dinickel(II) and dimanganese(III) complexes based on pyrazolate ligands 3-[N-hydroxyethanimidoyl]-4-methyl-1H-pyrazole-5-carboxylic acid (PzOxCA), (4-Methyl-1H-pyrazole-3,5-diyl)diethanone dihydrazone (PzDHn), (4-methyl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(methylmethanone) dioxime (PzDOx), (4-phenyl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(phenylmethanone) dioxime (PhPzDOx) and 1H-pyrazole-3,5-dicarboxylic acid (PzDCA) has been synthesized and examined as functional models of phosphoesterases, focusing on correlations between hydrolytic activity and molecular parameters of the bimetallic core.

Speciation of the various dizinc, dicopper, dinickel and dimanganese complexes in solution has been performed potentiometrically and spectrophotometrically, and the structures of 10 complexes in the solid state have been determined by X-ray crystallography.

The hydrolysis of two phosphoesters, the 2-hydroxypropyl-p-nitrophenyl phosphate (HPNP) (as an RNA model) and the pesticide paraoxon-ethyl (POE) promoted by the dinuclear phosphoesterase model complexes has been studied in DMSO/buffered water (1:1) at 50?C as a function of complex concentration, substrate concentration and pH. Significant differences in hydrolytic activity of [Zn2(PzOxCA-2Н)2]0, [Zn2(PzDHn-Н)2]2+, [Zn2(PzDOx-H)2]2+, [Zn2(PzDCA-3Н)2]2- are observed and can be attributed to molecular peculiarities. The metal array and the complex framework seem to provide a sufficient number of coordination sites for both activating the substrate and generation of the nucleophile, where the phosphate esters are preferentially bound in a bidentate bridging fashion (in case of HPNP) and in a monodentate fashion (in case of POE).

Three complexes [Cu2(PzOxCA-2Н)2(DМSО)(Н2О)]·Н2О, [Cu2(PzOxCA-2Н)2 (DМSО)2]·Н2О and [Cu3(PzOxCA-3Н)2(Py)5] have been isolated. The former feature a bis(pyrazolato)-bridged dicopper core, whereas in the latter adjacent copper ions are spanned by a pyrazolate and an oximate. The presence of different species in solution depending on the pH has been demonstrated by EPR. Alterations in the protonation state are accompanied with changes in nuclearity, which cause pronounced changes in color, magnetic and EPR properties.

Magnetic susceptibility measurements in the temperature range 1,7-300 K have revealed antiferromagnetic exchange coupling between copper(II), nickel(II) and manganese(III) ions in all complexes.

Keywords: metalloenzyme modelling, catalysis, inhibition, pyrazole, X-ray structure analysis, magnetic properties.

Размещено на Allbest.ru