Синтез та антимікобактеріальні властивості бензиліденгідразидів 1-r-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот

Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Синтез та антимікобактеріальні властивості бензиліденгідразидів 1-r-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

бензиліденгідразид антимікобактеріальний протитуберкульозний кислота

Актуальність теми. На сьогодні туберкульоз став одним з найбільш розповсюджених та небезпечних інфекційних захворювань у світі, яке в Україні набуло катастрофічних розмірів епідемії. Особливе місце у хіміо-терапії цієї хвороби займають похідні гідразину. Найбільш відомий приклад - гідразид ізонікотинової кислоти. Під назвою ізоніазид цей препарат з успіхом використовується у медицині вже понад п'ятдесят років, однак і дотепер не втратив свого значення. Крім того, на основі ізоніазиду створені і продовжують створюватися нові аналоги з покращеними фармакологічними властивостями - це фтивазид, салюзид, метазид, а також вітчизняний препарат флуренізид. Гідразиновий фрагмент містять у своїй структурі рифампіцин і рифапентин, які є одними з найбільш ефективних сучасних протитуберкульозних напівсинтетичних антибіотиків. Висока активність по відношенню до збудників як туберкульозних, так і нетуберкульозних міко-бактеріозів неодноразово відмічалась у гідразидів і, особливо, бензиліден-гідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот. Зважаючи на це, актуальним є пошук потенційних антимікобактеріальних засобів серед структурних аналогів означених сполук, заміщених у бензиліденовій та у хіноліновій частині молекули.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України „Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв'язку „структура-активність”, створення нових лікарських препаратів” (номер державної реєстрації 0198 U 007011).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є пошук нових потенційних протитуберкульозних засобів у ряду заміщених бензиліден-гідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1. Розробити препаративний метод одержання і здійснити синтез заміщених бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбоно-вих кислот.

2. Встановити структуру та дослідити фізико-хімічні властивості синтезо-ваних сполук.

3. Провести мікробіологічний скринінг одержаних бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот для виявлення речовин з антимікобактеріальною активністю.

4. Запропонувати фізико-хімічні методи ідентифікації та кількісного визначення речовин, які представляють інтерес для подальшого досліджен-ня як потенційні протитуберкульозні засоби.

Об'єкт дослідження - заміщені бензиліденгідразиди 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот.

Предмет дослідження - способи одержання, фізико-хімічні та біологічні властивості бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот.

Методи дослідження - синтез складних ефірів та гідразидів заміщених 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот, вивчення хіміч-них властивостей та одержання на їх основі цільових бензиліденгідразидів з використанням різноманітних хімічних реакцій: гідразиноліз, бромування, амідування та ін.; аналіз структурних особливостей одержаних речовин за допомогою сучасних фізико-хімічних методів дослідження: спектроскопії ЯМР ¹Н, хроматомас-спектрометрії та рентгеноструктурного аналізу; вивчен-ня біологічних властивостей з використанням стандартних методик.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше здійснено синтез нової групи заміщених бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-ди-гідрохінолін-3-карбонових кислот. За допомогою рентгеноструктурного аналізу вивчені особливості просторової будови досліджуваної групи хіміч-них сполук. Зокрема, однозначно доведено, що в кристалі вони існують виключно в син-ізомерній формі.

Встановлено, що для 2-нітробензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот при відновленні цинковим пилом у льодяній оцтовій кислоті характерно розщеплення зв'язку N-N, яке призводить до утворення амідів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот, а у реакції з триетилфосфітом замість відновлювальної циклізації в індазоліл-2-аміди вони перетворюються у симетричні N,N'-ди-(1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідро-3-хіноліноїл)-гідразини.

Показано, що в реакції з гідразин-гідратом етилові ефіри 6-бром-заміщених 4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот утво-рюють відповідні гідразиди, тоді як ізомерні їм 3-бром-3-етоксикарбоніл-2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідрохіноліни в тих же умовах надзвичайно легко віднов-люються до відповідних 4-гідроксихінолонів-2. Експериментально підтверд-жено, що гідразин-гідрат при цьому окиснюється до дііміду.

На прикладі етилового ефіру 3-бром-2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідро-хінолін-3-карбонової кислоти вперше виявлена бромувальна здатність сполук, у яких, на відміну від відомих бромуючих реагентів, атом брому зв'язаний безпосередньо з вуглецем.

У результаті проведених досліджень одержано близько 90 неописаних у літературі сполук, їх структура підтверджена даними елементного аналізу, ЯМР- і хроматомас-спектрів, у деяких випадках - рентгеноструктурним аналізом та зустрічним синтезом.

Вивчені протитуберкульозні властивості всіх синтезованих речовин, що дозволило виявити в їх структурі фрагменти, які найбільш активно впливають на антимікобактеріальні властивості.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено препара-тивні методи синтезу заміщених бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот, які дозволяють одержувати цільові продукти з високими виходами та чистотою і можуть бути використані у подальшому цілеспрямованому синтезі нових біологічно активних речовин з високою протитуберкульозною дією. За результатами проведених мікро-біологічних випробовувань для поглибленого вивчення як перспективний протитуберкульозний препарат відібрано 3-хлорбензиліденгідразид 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти. Розроблені мето-дики ідентифікації та кількісного визначення субстанції цієї сполуки, які можуть бути використані в подальшому при підготовці аналітичної норма-тивної документації. Фрагменти роботи впроваджено у науковий та навчаль-но-методичний процеси ряду кафедр вищих навчальних закладів України.

Особистий внесок здобувача:

· систематизація літературних даних та експериментальна синтетична частина роботи виконані особисто автором;

· результати синтетичних, фізико-хімічних та біологічних досліджень оброблені, систематизовані та проаналізовані дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи представлено на Міжнародній конференції „Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2003); на II Всеукраїнській конференції молодих вчених з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2004); на III Міжнарод-ній медико-фармацевтичній конференції студентів і молодих вчених (Чернівці, 2006); на Міжнародному симпозіумі з передової науки в органічній хімії (Судак, 2006); на 7-му Міжнародному конгресі молодих вчених-медиків (Познань, 2007); на ХХІ Українській конференції з органічної хімії (Чернігів, 2007); на VI Всеукраїнській конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (Харків, 2008).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 7 статтях фахових видань затверджених ВАК України і 7 тезах доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, п'яти розділів, висновків та списку літературних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 132 сторінки. Робота ілюстрована 11 схемами, 9 рисунками і 28 таблицями. Перелік використаних літературних джерел містить 198 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Синтез та спектральні характеристики бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот (Розділ 2)

У процесі пошуку нових потенційних протитуберкульозних препаратів у ряду похідних гідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбо-нових кислот раніше було встановлено, що модифікація гідразидних груп у бензиліденгідразидні за рахунок простої у виконанні реакції з бензальдегідом приводить до значного підвищення активності. Враховуючи цю обставину, на першому етапі наших досліджень було вирішено замінити бензальдегід ваніліном, ефективність використання якого була переконливо підтверджена на прикладі створення фтивазиду. Цільові 4'-гідрокси-3'-метоксибензиліден-гідразиди (2) одержані взаємодією гідразидів відповідних хінолін-3-карбоно-вих кислот (1) з ваніліном у середовищі киплячого етанолу (Схема 1). Наступним кроком став синтез фторзаміщених бензиліденгідразидів (3), оскільки атоми фтору вже добре зарекомендували себе у фторхінолонах. У той же час є відомості про те, що на рівень антимікробної активності ефективно впливають й інші галогени. Зважаючи на цю обставину, досить цікавою видається заміна атомів фтору в бензиліденгідразидах (3) на хлор або бром, причому коло об'єктів дослідження нами свідомо було обмежене лише мета-заміщеними похідними 4 та 5, оскільки у випадку фторпохідних саме вони виявились найбільш активними.

Схема 1

Серед лікарських засобів, придатних для лікування бактеріальних інфекцій, особливе місце займають препарати, які містять нітрогрупу - фурацилін, нітроксолін та інші. Звідси цікавими об'єктами досліджень як у фармакологічному, так і у хімічному плані є 2-нітробензиліденові похідні 6. Крім того, завдяки зручному для наступних перетворень орто-розміщенню нітро-груп, такі сполуки можуть стати основою в синтезі різних гетеро-циклічних продуктів. Вихідні 2-нітропохідні (6, Схема 2) одержані аналогічно іншим заміщеним бензиліденгідразидам. Гідразиди карбонових кислот, як відомо, відновлюються дещо важче похідних зі зв'язком -C=N. Ця властивість відкриває можливість селективного відновлення ацилгідразонів зі збереженням ацильної групи. Лише в окремих випадках спостерігається часткове розщеплення зв'язку N-N. Однак при відновленні ацилгідразонів 6 цинковим пилом у льодяній оцтовій кислоті цей процес стає основним і призводить до амідів 4-гідрокси-2-оксохінолін-3-карбонових кислот (7) .

Будова отриманих амідів 7 підтверджена зустрічним синтезом - амідуванням етилових ефірів 8, причому ця реакція, як виявилося, має свої специфічні особливості. Не дивлячись на високу реакційну здатність етилових ефірів 4-гідрокси-2-оксохінолін-3-карбонових кислот (8), з аміаком вони вступають у взаємодію набагато важче. Так, при насиченні газоподібним аміаком розчинів ефірів 8 в метанолі або етанолі аміди відповідних хінолін-3-карбонових кислот 7 утворюються несподівано з великими труднощами, а ось у пропанолі-2 зразу ж з введенням у реакційну суміш аміаку випадають білі осади, які після фільтрування і висушування несподівано виявилися вихідними ефірами. Здійснити амідування ефірів 8 вдалося після проведення синтезу в киплячому ДМФА.

Схема 2

Незвичайно 2-нітробензиліденгідразиди 6 поводять себе і в реакції з триетилфосфітом. Принаймні, відновлювальна циклізація в індазоліл-2-аміди 9 для них виявилася неможливою. Замість цього ацилгідразони 6 перетворюються в симетричні N,N'-ди-(1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідро-3-хіноліноїл)-гідразини (10).

Хімічна будова усіх синтезованих речовин підтверджена спектрами ЯМР ¹Н, а у випадку 3-хлорбензиліденгідразиду 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти (4, R = Et) додатково ще й рентгеноструктурним аналізом. Спектри усіх одержаних нами речовин в основному дуже схожі і їх інтерпретація ускладнень не викликає. Ідентифікувати вдається сигнали практично всіх окремих протонів, хоча в окремих випадках спостерігаються також і їх накладення. Одним з таких прикладів є орто-фторзаміщені похідні, сигнал Н-3' бензиліденового фрагмента яких зміщений в слабке поле за рахунок парамагнітного зсуву, зумовленого сусідством електронегативного атома фтору, і перекриває дублетний сигнал протона Н-5 хінолонового ядра.

В „аліфатичній” частині спектра розпізнати сигнали усіх складових частин N-алкільного ланцюжка вдається лише до N-бутильних похідних включно (Рис. 2). Починаючи з 1-N-амілзаміщених гідразонів інтерпретації піддаються тільки перші дві чи три метиленові та кінцева метильна групи. Резонансні частоти інших метиленових груп настільки близькі, що їх сигнали зливаються в один мультиплет, ідентифікація якого можлива тільки за загальною інтегральною інтенсивністю.

Добре відомий той факт, що при одержанні ацилгідразонів за рахунок утрудненого обертання навколо зв'язку C=N гідразонового фрагмента зазвичай утворюються ізомерні суміші. Аналіз таких сумішей зазвичай досить легко можна здійснити методом спектроскопії ЯМР. Однак, у випадку бензиліденгідразидів 2-6 очікуваного подвоєння сигналів протонів (при-наймні НС=N- та NH-груп) виявити так і не вдалося. Причиною означеного ефекту очевидно є досить висока швидкість син-анти-взаємоперетворень ацилгідразонів 2-6, внаслідок чого протонний обмін між геометричними ізомерами відбувається надто швидко.

Рис. 3.Просторова будова молекули 3-хлорбензиліденгідразиду 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти 4 (R = Et).

У кристалічному ж стані, згідно з даними рентгеноструктурного аналізу (Рис. 3), проведеного для 3-хлорбензиліденгідразиду 4 (R = Et), сполуки даного ряду однозначно існують виключно у більш стійкій син-ізомерній формі, що в цілому характерно для гідразонів.

Синтез та хімічні перетворення похідних галогензаміщених хінолін-3-карбонових кислот (Розділ 3)

Численні структурно-біологічні дослідження, проведені науковцями за декілька останніх десятиліть, що минули з моменту появи на ринку перших фторхінолонових антибіотиків, однозначно довели позитивний вплив на силу антимікробної дії атомів галогенів у шостому положенні 4-оксо-1,4-дигідро-хінолінового циклу. Враховуючи цю обставину, видається перспективною аналогічна хімічна модифікація описаних вище мета-фторбензиліденгідра-зидів (3), які в дослідах in vitro продемонстрували високу антимікобакте-ріальну дію. Синтез галогензаміщених у бензольній частині хінолінового ядра мета-фторбензиліденгідразидів 13 здійснено за двостадійною схемою, яка передбачає попереднє виділення гідразидів хінолін-3-карбонових кислот 12, одержаних гідразинолізом вихідних етилових ефірів 11.

Схема 3

Перебіг реакцій у представленому на схемі 3 напрямку легко контро-люється спектрами ЯМР ¹Н. Разом з тим визначити природу галогену в хіно-лоновому кільці спектроскопія ЯМР ¹Н, на жаль, неможливо. Тому для дове-дення будови кінцевих бензиліденгідразидів 13 нами додатково використана хроматомас-спектрометрія, яка дозволяє окрім хроматографічної чистоти досліджуваних сполук підтвердити також і присутність в їх молекулах конкретно того чи іншого галогену. Відзначимо, що мас-спектри дозволяють вирішувати подібні завдання не тільки шляхом встановлення молекулярної маси досліджуваної речовини, а й мультиплетністю та інтенсивністю окремих піків у спектрі (Рис. 4), які проявляються у суворій залежності від розповсюдженого у природі ізотопного складу того чи іншого галогену.

Цікаво, що викликана електронним ударом первинна фрагментація молекулярних іонів бензиліденгідразидів 13 переважно відбувається не за зв'язком NN, як слід того було б чекати, тому що у похідних гідразину цей зв'язок зазвичай є самим слабким, а за гідразидним зв'язком CONHN.

Рис.4.Мас-спектри 3-фторбензиліденгідразидів 6-галогензаміщених 1Н-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот 13.

На відміну від 6-бромхінолонів 11 їх 3-бромзаміщені ізомери 14 в реакції з гідразин-гідратом ведуть себе зовсім інакше. Цікаво, що ні нуклеофільне заміщення галогену, ні гідразиноліз етоксикарбонільної групи, які приводили б відповідно до гідразинів 15 чи гідразидів 16, при цьому не відбуваються. Помічено, що реакція супроводжується інтенсивним виділен-ням газу, ймовірно, азоту, причому 3-бром-3-алкілхінолони 14 (R = Alk) поводять себе таким же чином. Згідно з даними спектроскопії ЯМР, а також рентгеноструктурного аналізу одного з одержаних продуктів доведено, що в процесі досліджуваної реакції 3-R-3-бром-2,4-діоксохіноліни 14 віднов-люються до відповідних 4-гідроксихінолонів-2 8 або 17.

Схема 5

Одержані результати свідчать про те, що гідразин-гідрат в умовах даної реакції піддається окисненню. Однак цей процес для гідразинів може носити разноманітний характер. Один з можливих варіантів - проміжне утворення дііміду, який звичайно одержують “в момент виділення” та використовують як ефективний відновник олефінів. Враховуючи цю обставину, ми зробили спробу “спіймати” діімід (якщо він дійсно утворюється) за допомогою алілового ефіру фенілоцтової кислоти, однак успіху вона не мала. Не вдалося підтвердити можливе утворення дііміду і шляхом проведення синтезу в аліловому спирті при охолодженні до -20 ^оС - у продуктах реакції не знайдено навіть слідів відповідно пропілфенілацетату чи пропанолу. Разом з тим, додавання в реакційну суміш діетилового ефіру дозволило суттєво знизити інтенсивність перебігу реакції, і тільки тоді вдалося зафіксувати нестійкий діімід (18), який відновлює аліловий спирт (19) через циклічний проміжний комплекс (20) до пропанолу (21) і перетворюється в кінцевому результаті в газоподібний азот (22).

Схема 6

Ідентифікувати утворений пропанол (21) можна за допомогою спектроскопії ЯМР ¹Н (Рис. 5) або ж хроматомас-спектрометрично. Цікаво відмітити, що за відсутності в реакційній суміші інших здатних відновлюватися речовин, подвійний зв'язок С₃=С₄ 4-гідроксипохідних в даних умовах не зачіпається.

Оскільки у реакції з гідразин-гідратом складні ефіри 3-бромхінолін-3-карбонових кислот поводять себе подібно до багатьох N-галогенімідів і амідів, то можна припустити, що вони так само, як, наприклад, і N-бромсукцинімід, можуть проявляти бромувальні властивості, тим більше, що атоми брому в них знаходиться по сусідству з трьома карбонільними групами і значить зв'язок C-Br повинен розриватися дуже легко, незважаючи на те, що згідно з даними рентгеноструктурного аналізу однієї з таких сполук (Рис. 6) він має типову для таких зв'язків довжину.

Дійсно, хроматомас-спектрометричне дослідження продукту, отрима-ного нами в результаті реакції етилового ефіру 3-бром-2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-3-карбонової кислоти 14 (R = COOEt, R' = H) з цикло-гексеном (23) у середовищі безводного CCl₄ і в присутності каталітичної кількості пероксиду (Схема 7) показало, що він представляє собою суміш, основними компонентами якої є 3-бромциклогексен (24, 11%) і транс-1,2-дибромциклогексан (25, 78%).

Схема 7

Таким чином, проведений експеримент однозначно підтверджує бромувальну здатність 3-бром-2,4-діоксохінолінів. Звичайно ж, про препаративне значення даної реакції мова поки що не йде, оскільки багато її особливостей залишаються невивченими. Тим не менше, сам факт виявлення бромувальних властивостей органічними речовинами, у яких галоген зв'язаний не з азотом, а безпосередньо з вуглецем, представляє безперечний теоретичний інтерес.

3. Вивчення протитуберкульозних властивостей синтезованих сполук (Розділ 4)

Мікробіологічний скринінг синтезованих сполук проведено по відношенню до Mycobacterium tuberculosis радіометричним методом. Перший рівень досліджень - первинний мікробіологічний скринінг - всі речовини проходять тест у початковій концентрації 12,5 мкг/мл (останнім часом вона знижена до 6,25 мкг/мл) на штамах Mycobacterium tuberculosis H37Rv АТСС 27294. Речовини, які в концентрації 12,5 мкг/мл або 6,25 мкг/мл затримують ріст мікобактерій туберкульозу не менше, ніж на 90%, згідно з прийнятими в TAACF критеріями, переводяться на другий етап, на якому проводиться визначення дійсної мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) та цитоток-сичності. За результатами першого рівня досліджень з 77 досліджених речовин тільки 42 переведено на другий рівень. Після визначення дійсної МІК перспективними, як правило, вважаються зразки, МІК яких складає ? 1 мкг/мл. Інколи в цю групу потрапляють також речовини, МІК яких дещо перевищує 1 мкг/мл. Це стосується, перш за все, нових і мало вивчених класів хімічних сполук. Аналіз даних мікробіологічних випробовувань свідчить про високу активність 4'-гідрокси-3'-метокси- (2) та 3-бром-(хлор)-бензиліденгідразидів (4, 5) - МІК майже всіх речовин складає менше 1 мкг/мл. Серед незаміщених у хіноліновій частині молекули фторпохідних (3) виявлена тільки одна сполука, МІК якої складає 0,2 мкг/мл. Що стосується 3-фторбензиліден-гідразидів галогензаміщених хінолін-3-карбонових кислот (13), то виявилось, що МІК всіх речовин, які пройшли перший етап випробувань, складає більше 1 мкг/мл. Цікаво відмітити, що 6-фторзаміщений продукт 13 (R = 6-F), всупереч сподіванням, виявився взагалі неактивним. На підставі проведених мікробіологічних досліджень зроблено висновок про недоцільність галогенування бензольної частини хінолінового ядра, оскільки така модифікація значно посилює не тільки протитуберкульозну активність, а й цитотоксичність (IC₅₀). Для зручності результати представляються у вигляді індексу селективності (SI), що визначається як відношення цитотоксичності до МІК. Задовільними зазвичай вважаються речовини, SI яких становить не менше 10. Тест на цитотоксичність успішно пройшли не всі сполуки. За сукупністю проведених досліджень першого та другого рівнів скринінгу відібрано найбільш перспективні сполуки - це 3-хлорбензиліденгідразид 1-етил- (4, R = Et) і 3-бромбензиліденгідразиди 1-етил- (5, R = Et) і 1-бутил- (5, R = Bu) 4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот.

Антимікобактеріальні властивості сполук, які пройшли перший етап мікробіологічного скринінгу, вивчені також і по відношенню до комплексу Mycobacterium avium. Однак проведені на п'ятьох ізольованих клінічних штамах Mycobacterium avium дослідження показали їх низьку ефективність по відношенню до цих мікроорганізмів. Третій рівень досліджень протитуберкульозної активності нових сполук складається з декількох етапів. Передусім визначається ефективність речовин по відношенню до мікобактерій туберкульозу, розміщених внутрішньо-клітинно (у макрофагах). Результати досліджень представляються у вигляді ЕС₉₀ і ЕС₉₉ - концентрації речовини, що випробовується, які викликають гальмування росту мікобактерій у макрофагах відповідно на 90 і 99%. Експериментальні дані (Табл. 1) демонструють виражений інгібуючий вплив відібраних бензиліденгідразидів 4 та 5 на ріст внутрішньоклітинних мікобактерій.

Таблиця 1. Протитуберкульозна активність найбільш активних 3-галогенбензиліденгідразидів на моделі заражених туберкульозом макрофагів

Як відомо, характерною особливістю мікобактерій туберкульозу є їх мінливість (поліморфізм). Виходячи з цього, третій рівень мікробіологічного скринінгу за програмою TAACF передбачає обов'язкове підтвердження протитуберкульозних властивостей відібраних сполук, але вже на двох штамах: повторно на Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294 і додатково на Mycobacterium tuberculosis Erdman ATCC 35801. Також визначається МІК на штамах, стійких до одного з відомих лікарських препаратів. Результати даного тестування (Табл. 2) свідчать про високу антимікобактеріальну активність відібраних сполук.

Таблиця 2. МІК найбільш активних 3-галогенбензиліденгідразидів по відношенню до різних штамів Mycobacterium tuberculosis

Заключним етапом третього рівня досліджень є визначення мінімальної бактерицидної концентрації (МБК). Проведені дослідження показали, що МБК 3-хлор-(бром)-бензиліденгідразидів у більшості випадків дорівнює МІК, тобто дію на мікобактерії туберкульозу цих сполук можна кваліфікувати як бактерицидну.

Таким чином, за результатами проведеного мікробіологічного скринінгу серед синтезованих сполук виявлена одна речовина, а саме 3-хлорбензиліден-гідразид 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти (4, R = Et), яка показала високу протитуберкульозну активність на чутливих до лікарських препаратів штамах, а також на монорезистентних культурах. Досліджувана сполука має низьку цитотоксичність, здатна затримувати ріст мікобактерій у макрофагах, а також бактерицидно діє на туберкульозну паличку. Отож ця речовина заслуговує на подальше вивчення in vivo. У зв'язку з цим для даної сполуки нами розроблені методики ідентифікації (спектроскопія ЯМР ¹Н та хімічні методи) та кількісного визначення (метод алкаліметричного титрування в неводному середовищі), які можна буде використати при підготовці АНД.

ВИСНОВКИ

1. З метою виявлення нових біологічно активних речовин протитуберкульоз-ної дії вперше синтезовано ряд заміщених бензиліденгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот.

2. Встановлено, що при відновленні 2-нітробензиліденгідразидів цинковим пилом у льодяній оцтовій кислоті відбувається розщеплення зв'язку N-N, яке призводить до утворення амідів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохі-нолін-3-карбонових кислот. В реакції з триетилфосфітом ці сполуки замість відновлювальної циклізації в індазоліл-2-аміди перетворюються у симетричні N,N'-ди-(1R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідро-3-хіноліноїл)-гідра-зини.

3. Вивчено реакцію 3-бром-3-R-2,4-діоксохінолінів з гідразин-гідратом. Експериментально встановлено, що вони відновлюються до відповідних 3-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолінів на відміну від 6-галоген-заміщених похідних, які в цій реакції утворюють відповідні гідразиди.

4. Вперше виявлені бромувальні властивості етилових ефірів 3-бром-2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-3-карбонових кислот - органічних речо-вин, у яких галоген зв'язаний не з атомом азоту, а безпосередньо з вуглецем.

5. Хімічна будова синтезованих речовин підтверджена елементним аналізом, ЯМР ¹Н та хроматомас-спектрами, в окремих випадках зустрічним синте-зом. Для деяких речовин проведено рентгеноструктурне дослідження. У результаті виявлені особливості просторової будови нових ацилгідразонів і доведено, що в кристалі вони існують виключно у вигляді більш стійких син-ізомерів.

6. Всі синтезовані бензиліденгідразиди 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідро-хінолін-3-карбонових кислот піддані мікробіологічному скринінгу, що дало змогу виявити певні закономірності зв'язку „хімічна будова - антимікобактеріальна дія”.

7. Для подальшого біологічного вивчення як потенційний засіб протитуберкульозної дії запропоновано 3-хлорбензиліденгідразид 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти, який показав високу протитуберкульозну активність. Розроблені методики визначення тотожності і кількісного визначення цієї речовини, які можуть бути використані при підготовці аналітичної нормативної документації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Синтез та антимікобактеріальні властивості фторзаміщених бензи-ліденгідразидів 1R-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонових кислот / І.В. Українець, О.С. Прокопенко, Л.В. Сидоренко, О.В. Горохова // Вісник фармації. - 2004. - №3(39). - С. 3-8. (Особистий внесок - виконання експериментальних досліджень, узагальнення результатів та участь у написанні статті)

2. Синтез, строение и противотуберкулёзная активность 3-хлор-(бром)-бензилиденгидразидов 1R-2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновых кис-лот / И.В. Украинец, Л.В. Сидоренко, О.С. Прокопенко, В.Б Рыбаков, В.В. Чернышев // Журнал орган. та фармац. хімії. - 2004. - Т.2, вип.4(8). - С. 17-24. (Особистий внесок - виконання експерименту, обробка та аналіз даних біологічних досліджень та участь у написанні статті)

3. Украинец И.В. Этиловые эфиры 3-бромо-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-хинолин-3-карбоновых кислот как возможные бромирующие агенты / И.В. Украинец, Л.В. Сидоренко, О.С. Головченко // Химия гетероцикл. соедин. - 2007. - № 8. - С. 1189-1195. (Особистий внесок - виконання експери-ментальних досліджень, узагальнення результатів та участь у написанні статті)

4. Реакція 1-R-3-бром-3-алкіл (карбетокси)-2,4-діоксохінолінів з гідразин-гідратом / І.В.Українець, О.С. Прокопенко, Л.В. Сидоренко, О.В. Горохова // Фармац. журн. - 2004. - №3. - С. 70-77. (Особистий внесок - виконання синтезу, аналіз та обробка результатів та участь у написанні статті)

5. Украинец И.В. Синтез, химические и биологические свойства 2-нитробензилиденгидразидов 1-R-4-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновых кислот / И.В. Украинец, Л.В. Сидоренко, О.С. Головченко // Химия гетероцикл. соедин. - 2007. - № 11. - С. 1687-1692. (Особистий внесок - виконання експериментальних досліджень, узагальнення ре-зультатів та участь у написанні статті)

6. 3-Фторбензиліденгідразиди галоген заміщених 4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот та їх протитуберкульозні властивості / А.О. Ткач, О.С. Головченко, І.В. Українець, Л.О. Петрушкова // Журнал орган. та фармац. хімії. - 2007. - Т. 5, вип.4(20). - С. 36-40. (Особистий внесок - виконання експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення біологічних досліджень та участь у написанні статті)

7. Синтез та протитуберкульозна активність 4'-гідрокси-3'-метоксибензилі-денгідразидів 1-R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кис-лот / Л.В. Сидоренко, О.С. Головченко, І.В. Українець, Т.В. Алєксєєва // Вісник фармації. - 2008. - №. 2(54). - С. 3-6. (Особистий внесок - виконання синтезу, узагальнення отриманих результатів та участь у написанні статті)

8. Прокопенко О.С. Реакція етилових ефірів 1R-3-бром-2,4-діоксохінолін-3-карбонових кислот з гідразин-гідратом / О.С. Прокопенко // II Всеукраїнська конференція молодих вчених з актуальних питань хімії : тез. доп., 7-12 черв. 2004р. - Дніпропетровськ, 2004. - С. 55.

9. Synthesis and anti-tuberculosis activity 3'-alkoxy-4'-hydroxybenzilidenhydrazides of 1H-2-oxo-4-hydroxyquinolin-3-carboxylic acids / P.O. Bezuglyi, O.S. Prokopenko, O.V. Gorochova, S.V. Taran // International conference chemistry of nitrogen containing heterocycles CHN-2003 : abstracts, Sept. 30 - Oct. 3, 2003. - Kharkiv, 2003. - Р. 44.

10. Прокопенко О.С. 3-хлор-(бром)-бензилиденгидразиды 1-R-4-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидрохинолин-3-карбоновых кислот - потенциальные противо-туберкулезные средства / О.С. Прокопенко, И.В. Украинец, Т.В. Алексеева // International symposium on advanced science in organic chemistry : abstracts, June 26-30, 2006.- Sudak, 2006. - C. 172.

11. Прокопенко О.С. Фторзаміщені бензиліденгідразиди 1R-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот / О.С. Прокопенко // III Міжнародна медико-фармацевтична конференція студентів і молодих вчених, 3-5 квіт. 2006р. - Чернівці, 2006. - С. 173.

12. Golovchenko O.S. Synthesis and antimycobacterial properties of 1-R-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxylic acids 2-nitrobenzylidene-hydrazides / O.S. Golovchenko, I.V. Ukrainets // 7^th International congress of young medical scientists : abstract book, 20-22 May, 2007.- Poznan, 2007. - Р. 194.

13. Сидоренко Л.В. Строение этиловых эфиров 3-бромо-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-3-карбоновых кислот / Л.В. Сидоренко, О.С. Головченко, И.В. Украинец // ХХІ Українська конференція з органічної хімії : тез. доп., 1-5 жовт. 2007р.- Чернігів, 2007. - С. 301.

14. Головченко О.С. Синтез та протитуберкульозна дія 3-фторбензиліден-гідразидів галогензаміщених 4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонових кислот / О.С. Головченко // VI Всеукраїнська конференція молодих вчених, студентів та аспірантів з актуальних питань хімії : тез. доп., 3-6 черв. 2008р.- Харків, 2008. - С. 53.

Размещено на Allbest.ru