Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВґЯ УКРАЇНИ ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

УДК 615.917:547.866.869

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ МІАНСЕРИНУ ТА ТІАНЕПТИНУ

ГОНЧАРУК НАТАЛІЯ

ВІКТОРІВНА

Львів-2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі токсикологічної та аналітичної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, доцент Галькевич Ірина Йосипівна Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, завідувач кафедри токсикологічної та аналітичної хімії

Актуальність теми: Хвороба кінця техногенного ХХ сторіччя - депресія, схоже стане найпоширенішою хворобою ХХІ сторіччя, особливо в економічно розвинених країнах світу. Про це свідчить бурхливе зростання асортименту антидепресивних лікарських засобів на фармацевтичному ринку. Згідно з дослідженням ВООЗ більше 5% населення земної кулі (близько 200 млн.) страждають депресією і, на думку вчених, до 2020 року депресивні розлади займатимуть друге місце серед десяти основних захворювань, які призводять до інвалідності.

Гострі отруєння трициклічними антидепресантами були відмічені відразу після їх впровадження у клінічну практику. В даний час більше ѕ всіх побутових отруєнь лікарськими засобами (ЛЗ) викликані препаратами психотропної дії. Серед пацієнтів спеціалізованих центрів з лікування інтоксикацій 10-15% складають хворі з отруєннями трициклічними та чотирьохциклічними антидепресантами, зокрема міансерином та тіанептином. Не зважаючи на це, в хіміко-токсикологічному відношенні дані препарати практично не вивчені. Це й обумовило актуальність даної теми.

У літературних джерелах відсутні відомості про методики ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу, методи їх ідентифікації та кількісного визначення, придатних для цілей судово-хімічного аналізу. Відсутні дані про оптимальні умови екстракції даних препаратів з водних розчинів, їх розподіл в органах та біологічних рідинах організму, а також зберігання в біологічному матеріалі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом проблемної комісії „Фармація” АМН та МОЗ України є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (№ державної реєстрації 0101U009227, шифр теми 1Н1006000101).

Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження є розробка ефективних та експресних методів ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу та очищення їх від домішок; розробка методів ідентифікації та кількісного визначення цих препаратів, придатних для хіміко-токсикологічного аналізу, вивчення розподілу в органах тварин і термінів зберігання в біологічному матеріалі.

Для досягнення поставленої мети були поставлені наступні завдання:

? запропонувати чутливі та достатньо селективні реакції для ідентифікації міансерину та тіанептину, виділених із біологічного матеріалу;

? розробити чутливі методики виявлення досліджуваних речовин методом хроматографії в тонких шарах сорбенту (ТШХ) з використанням схем аналізу, що застосовують в ТШХ-скринінгу отрут, а також запропонувати склад оптимальних систем розчинників для ідентифікації міансерину та тіанептину в суміші з метаболітами;

? розробити умови ідентифікації міансерину та тіанептину, виділених із біологічного матеріалу, методами УФ- та флуоресцентної спектроскопії;

? розробити умови ідентифікації міансерину, тіанептину та їх метаболітів із застосуванням ПМР-спектроскопії, хромато-мас-спектрометрії та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ);

? розробити методики кількісного визначення міансерину та тіанептину, з використанням спектрометричних, фотометричних та хроматографічних методів аналізу;

? вивчити вплив природи органічних розчинників та рH середовища на екстракцію міансерину та тіанептину з водних розчинів;

? розробити ефективні методики очистки міансерину та тіанептину від домішок речовин білкової природи, жирів та інших сполук, що містяться у витяжках з біологічного матеріалу із застосуванням екстракції та хроматографії в тонкому шарі сорбенту;

? порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного та кислотного характеру - О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто;

? розробити ефективні методи ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу, а також запропонувати методики виділення цих препаратів з біологічних рідин організму (кров, сеча);

? дослідити і вивчити розподіл міансерину та тіанептину в органах тварин, які були отруєні даними препаратами та встановити терміни їх зберігання в біологічному матеріалі при гнитті.

Об'єкти дослідження: антидепресанти міансерин та тіанептин.

Предмет дослідження: хіміко-токсикологічний аналіз міансерину та тіанептину.

Методи дослідження. Для ідентифікації міансерину та тіанептину у водних розчинах та витяжках з біологічного матеріалу використовували кольорові та осадові реакції, методи ТШХ, ВЕРХ, УФ- та ПМР-спектроскопію та хромато-мас-спектрометрію. Для кількісного визначення досліджуваних препаратів використовували спектральні методи аналізу: УФ- спектрофотометрію, флуориметрію, екстракційну фотометрію та метод високоефективної рідинної хроматографії.

Для ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу використовували загальноприйняті методи О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто, а також розроблену методику ізолювання препаратів 30% розчином ацетатної кислоти.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичні хіміко-токсикологічні дослідження міансерину та тіанептину.

Запропоновано осадові та кольорові реакції для виявлення міансерину

та тіанептину, виділених із біологічного матеріалу. Розроблені умови ідентифікації досліджуваних препаратів у витяжках методами ТШХ, УФ- та ПМР-спектроскопії, ВЕРХ, хромато-мас-спектрометрії та флуориметрії. Методами ПМР-спектроскопії та хромато-мас-спектрометрії доведена будова основних метаболітів міансерину та тіанептину.

Запропоновано нові методики кількісного визначення міансерину та тіанептину, придатні для хіміко-токсикологічного, фармацевтичного та криміналістичного аналізу методами УФ-спектрофотометрії, екстракційної фотометрії, ВЕРХ, флуориметрії.

Вивчено умови екстракції міансерину та тіанептину з водних розчинів, на основі чого розроблена методика ізолювання їх з біологічного матеріалу.

Вперше проведено порівняльне вивчення загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного та кислого характеру стосовно міансерину та тіанептину. Запропоновано ефективну та експресну індивідуальну методику ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу 30% розчином ацетатної кислоти.

Запропоновано методики виділення досліджуваних сполук з біологічних рідин (крові, сечі).

Вперше вивчено розподіл міансерину та тіанептину в органах отруєних тварин, що дозволяє вибрати оптимальні об'єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу.

Вперше досліджено терміни зберігання міансерину та тіанептину в біологічному матеріалі при його гнитті.

На підставі виконаних досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного дослідження біологічного матеріалу на вміст у ньому міансерину та тіанептину.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень нами розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу на визначення міансерину та тіанептину у біологічному матеріалі. Запропоновані методики виявлення та кількісного визначення міансерину та тіанептину можна рекомендувати для впровадження в практичну роботу відділень судово-медичної експертизи при вирішенні питань щодо отруєння даними препаратами, в клінічних лабораторіях - з метою визначення їх в біологічних рідинах, а також у фармацевтичному аналізі.

Розробленні методики хіміко-токсикологічного дослідження міансерину та тіанептину впровадженні в практику лабораторій Державної інспекції з контролю якості ЛЗ в Тернопільській області, Тернопільського обласного бюро судово-медичної експертизи, Львівського обласного бюро судово-медичної експертизи (акти впровадження від 21.12. 2008 р., 01.07.2009 р., 21.03.2009 р.), а також у навчальний процес Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова, Івано-Франківського національного медичного університету та Національного фармацевтичного університету (акти впровадження від 23.01.2009 р., 15.10.2008 р., 04.02.2009 р., 01.10.2008 р.).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником сформована мета та задачі наукових досліджень та визначенні шляхи їх реалізації. Проаналізовано та узагальнено дані результатів власних експериментальних досліджень. Особисто проведено аналіз літературних даних, експериментальних досліджень, здійснено їх статистичну обробку та систематизовано одержані результати. Сформовано висновки роботи, запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на присутність міансерину та тіанептину.

Результати власних експериментальних досліджень висвітлено у наукових працях, опублікованих у співавторстві з науковим керівником.

Апробація результатів. Основні результати дисертаційної роботи викладені та обговорені на ІV Міжнародній науково-практичній конференції „Динаміка наукових досліджень 2005” (Дніпропетровськ, 2005), І Міжнародній науково-практичній конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики” (Запоріжжя, 2007), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2007), „ХІІ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених” (Тернопіль, 2008), Українській науково-практичної конференції „Проблеми синтезу біологічно активних речовин та створення на їх основі лікарських субстанцій” (Харків, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні проблеми судово-токсикологічної науки і практики” (Харків, 2009).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових робіт, з них 4 статті у наукових фахових виданнях, 7 тез доповідей та 1 інформаційний лист.

Структура та обсяг дисертації. Дана робота складається із вступу, огляду літератури, 4-х розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, списку літературних джерел та додатків. Загальний обсяг дисертації складає 156 сторінок. Робота ілюстрована 43 таблицями, 23 рисунками та 3 схемами. Перелік використаної літератури містить 140 джерел, з яких 77 іноземних.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступній частині дисертаційної роботи обґрунтовано актуальність даної теми, викладено мету та завдання, які необхідно виконати, подано наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів.

У першому розділі здійснено огляд літературних джерел, що стосується класифікації антидепресантів, описано фізико-хімічні і фармакологічні властивості міансерину та тіанептину, наведено їх токсичний вплив на людський організм. Проведено аналіз існуючих методів ідентифікації та кількісного визначення досліджуваних препаратів, способів виділення антидепресантів із біологічних об'єктів.

Міансерин у хімічному відношенні представляє собою - 1,2,3,4,10,14b-гексагідро-2-метилдибензо-c, f-піразино-1, 2-а азепіну гідрохлорид.

Тіанептин - це 7-[(3-хлор-6,11-дигідро-6-метилдибензо[c,f]-[1,2]-тіазепін-11-іл) аміно] гептанової кислоти S,S-діоксид.

Другий розділ присвячений експериментальним дослідженням, що стосуються розробки чутливих та експресних методик ідентифікації міансерину та тіанептину, придатних для цілей хіміко-токсикологічного аналізу.

Ідентифікацію міансерину та тіанептину проводили хімічними (кольорові та осадові реакції) та фізико-хімічними методами (ТШХ, ВЕРХ та УФ-спектроскопія).

Для пошуку реакцій ідентифікації міансерину та тіанептину була вивчена їх взаємодія з деякими реагентами, що застосовуються в аналізі алкалоїдів та інших органічних речовин. Серед кольорових реакцій чутливими для виявлення міансерину є реакції з реактивами Манделіна та Маркі. Тіанептин не дає цих реакцій. Встановлено, що з більшістю реактивів групового осадження міансерин та тіанептин утворюють аморфні осади. Найчутливішими серед них для обох препаратів є реакції з реактивами Драгендорфа та 2% розчином феруму (III)хлориду.

Визначено хроматографічну поведінку міансерину та тіанептину в присутності речовин, які зустрічаються при комбінованих отруєннях, а саме: флуоксетином, трамадолом, амітриптіліном та меліпраміном. Хроматографічне розділення проводили на пластинках “Sorbfil” в системах розчинників, які часто застосовуються для ТШХ-скринінгу: етилацетат, хлороформ-метанол (9:1), хлороформ-ацетон (10:10) та етилацетат-метанол-25% аміак (17:2:1). Встановлено, що у перерахованих вище системах розчинників можна виявити міансерин та тіанептин у суміші з іншими антидепресантами та наркотичними речовинами.

Опрацьовано склад оптимальних систем розчинників для проведення підтверджуючих тестів методом ТШХ при дослідженні біологічного матеріалу на міансерин та тіанептин. Встановлено, що для виявлення міансерину оптимальними є системи розчинників метанол-ацетонітрил-25% розчин аміаку (30:10:5) та метанол-25% розчин аміаку (40:5), а для виявлення тіанептину - метанол-ацетон (10:10) і ацетон-етилацетат- ацетатна кислота (10:20:2). Роздільна здатність даних систем вивчалась на хроматографічних пластинках „Sorbfil”(СТХ-1А), „Silufol”(Silpearl, UV 254) та „Merck” (GF 60, UV 254). Плями досліджуваних препаратів доцільно проявляти на пластинках УФ-світлом (межа виявлення міансерину 0,5 мкг, а тіанептину 1,0 мкг), реактивом Манделіна (межа виявлення міансерину 0,2 мкг) та 0,1% розчином бромтимолового синього (межа виявлення тіанептину 0,3 мкг).

Для ідентифікації міансерину та тіанептину вивчено УФ-спектри світлопоглинання в етанолі, 0,1М розчині хлоридної кислоти, 0,1М розчині натрію гідроксиду, хлороформі та бензені.

Встановлено, що УФ-спектри міансерину характеризуються двома смугами поглинання та одним плечем в діапазоні довжин хвиль від 220 нм до 360 нм в усіх розчинниках. УФ-спектри тіанептину в 96% етанолі, 0,1 М розчині гідроксиду натрію та 0,1 М розчині хлоридної кислоти також характеризуються двома смугами світлопоглинання, а в хлороформі та бензені спостерігається по одній смузі поглинання. Положення максимумів поглинання та інтенсивність смуг поглинання значною мірою залежать від природи розчинника.

Нами опрацьовані умови ідентифікації міансерину та тіанептину в сумішах методом ВЕРХ (хроматограф Agilent 1200). Враховували ефективність та селективність різних типів колонок та умов проведення аналізу. Роздільну здатність двох препаратів визначали на колонках Zorbax GF-450 (9,4Ч250 mm); Ultron ES-OVM (4,6Ч150 mm); Eclips C18 (150Ч4,6 mm). Як рухомі фази апробовували суміші розчинників: ацетонітрил-вода (3:1); фосфатний буферний розчин pH 7,4; етанол-20 мМ дигідрогенфосфат калію (25:75) з pH 5,5, яке створювали додаванням розчину натрію гідроксиду; ацетонітрил-1% триетиламін (16:34) з pH 3,5, яке створювали додаванням розчину фосфатної кислоти; ацетонітрил-фосфатний буферний розчин (74:26) з pH 5,5. Детектування проводили при довжинах хвиль 210, 220, 240 та 260 нм. Встановлено, що чутливість методик залежить від природи та складу рухомої фази. Найоптимальнішими для розділення міансерину та тіанептину виявились рухомі фази ацетонітрил-1% розчин триетиламіну (16:34) з рН 3,5 та ацетонітрил-фосфатний буферний розчин (74:26), причому, в першій рухомій фазі чутливість методики була вищою.

Нами опрацьовані оптимальні умови виявлення міансерину та тіанептину в присутності їх основних метаболітів методом ВЕРХ на колонці Eclips C18, довжиною 150 мм, діаметром 4,6 мм, з розміром частинок сорбенту 5 мкм. При аналізі користувалися мобільною фазою ацетонітрил- 1% розчин триетиламіну (16:34) з pH 3,5, створене додаванням розчину фосфатної кислоти. Швидкість рухомої фази 1 мл/хв., температура термостату колонки 25°С, об'єм проби 20 мкл. Детектування проводили при довжині хвилі 214 нм з використанням УФ-детектора. Ідентифікацію проводили методом внутрішнього стандарту. В цих умовах встановлені основні параметри міансерину та тіанептину - час (t) та об'єм (V) утримування (абсолютні та відносні), розраховано селективність (б), коефіцієнт ємності (К) та ступінь розділення піків (RS) досліджуваних речовин.

Межа виявлення міансерину методом ВЕРХ становить 0,5 мкг/мл, а тіанептину - 0,2 мкг/мл.

Результати розробки методів кількісного визначення міансерину та тіанептину представлені у третьому розділі. Опрацьовано та запропоновано умови кількісного визначення міансерину та тіанептину методами УФ-спектрометрії, екстракційної-фотометрії, флуореметрії та ВЕРХ.

Екстракційно-фотометричне визначення міансерину ґрунтується на утворенні йонного асоціату з метиловим оранжевим при рН 2,8, а тіанептину - з метиленовим синім при рН 7,8, які добре екстрагуються хлороформом. Для підвищення чутливості методики кількісного визначення міансерину, його йонний асоціат з метиловим оранжевим розкладали 0,1М розчином хлоридної кислоти. Забарвлені розчини міансерину підпорядковуються основному закону світлопоглинання від 5 мкг до 100 мкг, а тіанептину від 5 мкг до 80 мкг в 15 мл кінцевого об'єму. Відносна похибка кількісного визначення міансерину за градуювальним графіком становить 1,48%, тіанептину - 1,57%. Після обробки даних методом лінійного регресійного аналізу, одержали лінійні залежності у всьому діапазоні концентрацій, виражені рівняннями: Y = 0,0107·Х (для міансерину) і Y = 0,0138·Х (для тіанептину), де Y - оптична густина, Х - вміст препарату в пробі (мкг). При використанні рівнянь регресії відносна похибка визначення міансерину та тіанептину в серійних розчинах відповідно становить 1,81% і 1,68%.

Для кількісного визначення міансерину та тіанептину методом УФ-спектрофотометрії розраховані питомі та молярні показники вбирання даних сполук в 96% етанолі та хлороформі (табл. 1).

Таблиця 1 Величини питомих та молярних показників вбирання міансерину та тіанептину

Результати кількісного визначення досліджуваних препаратів у двох розчинниках є достовірними, оскільки вони вкладаються в межі довірчих інтервалів. Відносна невизначеність середнього результату в хлороформових розчинах становить 2,24% (для міансерину) і 2,17% (для тіанептину), а в етанольних розчинах 1,98% (для міансерину) та 1,89% (для тіанептину).

Запропоновано методики кількісного визначення міансерину та тіанептину методом ВЕРХ на колонці Eclips C18. Умови хроматографування аналогічні, як і при ідентифікації досліджуваних сполук. Побудова градуювальних графіків проводилась методом внутрішнього стандарту. При визначенні міансерину як внутрішній стандарт використовували розчин тіанептину (8 мкг/мл), а при визначенні тіанептину - розчин міансерину (20 мкг/мл). Розчини препаратів та внутрішніх стандартів готували в рухомій фазі. Лінійна залежність градуювального графіку при визначенні міансерину спостерігалась в межах від 0,5 мкг/мл до 20 мкг/мл, а тіанептину від 0,2 мкг/мл до 15 мкг/мл. Відносна похибка кількісного визначення міансерину у розчинах методом ВЕРХ складає 0,57%, а тіанептину - 0,72%.

Розроблено оптимальні умови виявлення та кількісного визначення міансерину та тіанептину методом флуоресцентної спектрометрії. Вимірювання проводилися на флуоресцентному спектрофотометрі MPF-4 (Hitachi). Спектри флуоресценції одержані при наступних умовах сканування: ширина щілини монохроматорів 5 нм та швидкість сканування 30 нм/хв. При цьому встановлено, що у водних розчинах лзб міансерину відповідає 265 нм, а максимум флуоресценції лежить при довжинах хвиль 427-434 нм, для тіанептину лзб=248 нм, а максимум флуоресценції спостерігається при 359-361 нм. Характер спектрів флуоресценції міансерину та тіанептину.

Встановлено, що в присутності натрію сульфіту інтенсивність флуоресценції міансерину значно зростає, а інтенсивність флуоресценції тіанептину зменшується. Тому кількісне визначення міансерину цим методом рекомендовано проводити в присутності 0,1М розчину натрію сульфіту. Додавання до розчинів міансерину та тіанептину “важкого атома” (калію йодиду) послаблює інтенсивність їх флуоресценції.

Лінійна залежність градуювального графіку для кількісного визначення міансерину методом флуоресцентної спектрометрії знаходиться в межах концентрацій від 0,1 мкг/мл до 1 мкг/мл, а тіанептину від 0,5 мкг/мл до 10 мкг/мл. Відносна похибка кількісного визначення міансерину методом флуоресцентної спектрометрії становить 0,82%, а тіанептину 0,74%.

Четвертий розділ присвячений вивченню умов екстракції міансерину та тіанептину з водних розчинів. Визначали вплив рН середовища, природи органічного розчинника та електроліту на ступінь однократної екстракції досліджуваних сполук.

Встановлено, що максимальні кількості міансерину екстрагуються з лужного середовища при pH 8-10 хлороформом (93,6-98,1%) та бензеном (72,9-78,2%). При pH 10-11 діетиловим етером екстрагується до 56,9%, а толуеном до 40,2% препарату. Менші кількості міансерину екстрагуються 1,2-дихлоретаном (до 37,6% ) при pH 8-9.

Тіанептин екстрагується вказаними органічними розчинниками як з кислого, так і з нейтрального середовища. Область максимальної екстракції спостерігається при pH 5-6. Оптимальними розчинниками для екстракції тіанептину є хлороформ та 1,2-дихлоретан. При рН 5-6 хлороформом екстрагується до 95,2%, а 1,2-дихлоретаном до 88,3% тіанептину. Менші кількості тіанептину екстрагуються діетиловим етером (72,1-76,9%) та

бензеном (70,3-72,7%). Найменше значення ступеня однократної екстракції тіанептину спостерігається при використанні толуену (до 45,2%).

У судово-хімічному аналізі за допомогою електролітів проводиться осадження білкових домішок при виділенні речовин із біологічного матеріалу. З метою розробки оптимальних умов виділення, нами проводилось вивчення впливу електролітів на ступінь екстракції міансерину та тіанептину. Встановлено, що додавання до водних розчинів міансерину електролітів, зумовлює підвищення ступеня однократної екстракції досліджуваного препарату як з кислого, так і з лужного середовищ.

Ступінь однократної екстракції тіанептину всіма органічними розчинниками в присутності електролітів (5%, 25% натрію хлориду і 5%, 25%, 50% амонію сульфату) при pH 2 та pH 5 також незначно підвищуюється.

П'ятий розділ присвячено розробці методів виділення міансерину та тіанептину із біологічного матеріалу та рідин організму (крові, сечі), очистці витяжок від супутніх речовин, ідентифікації та кількісному визначенню виділених речовин та продуктів їх метаболізму у витяжках, вивченню розподілу цих препаратів в органах отруєних тварин та встановленню термінів зберігання у біологічних об'єктах при гнитті.

Досліджено ефективність методик ізолювання міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу методами, загальноприйнятими у хіміко-токсикологічному аналізі. Встановлено, що при ізолюванні цих сполук підкисленим спиртом (метод Стаса-Отто), виділяється до 30% міансерину та до 13% тіанептину, при ізолюванні водою, підкисленою сульфатною кислотою (метод В.П. Крамаренка), виділяється до 16% міансерину та до 25% тіанептину, а при ізолюванні водою, підкисленою оксалатною кислотою (метод О.О. Васильєвої), виділяється до 19% міансерину та до 40% тіанептину. міансерин тіанептин хроматографія ізолювання

Одержані результати свідчать про задовільну, але недостатньо високу ефективність виділення, тому нами запропоновано методику ізолювання досліджуваних сполук із біологічного матеріалу 30% розчином ацетатної кислоти. При цьому встановлено, що для виділення міансерину та тіанептину достатнє трьохкратне настоювання біологічного матеріалу з ізолюючою рідиною по 1 годині. Екстракцію досліджуваних речовин проводили хлороформом при рН 5-6 для тіанептину та рН 8-9 для міансерину. Даною методикою виділяється до 60% міансерину та до 53% тіанептину з модельних проб печінки.

Для виділення міансерину та тіанептину із біологічних рідин організму (сеча, кров), запропонована аналогічна методика. При цьому із модельних проб крові виділяється до 66% міансерину та до 59% тіанептину, а із сечі виділяється до 91% міансерину та до 83% тіанептину.

Для виявлення міансерину та тіанептину у витяжках із біологічного матеріалу та біологічних рідин використовували кольорові та осадові реакції, методи ТШХ і УФ-спектроскопії.

При дослідженні витяжок із органів отруєних тварин методом ТШХ у підтверджуючих системах розчинників на міансерин метанол-ацетонітрил-25% розчин аміаку (30:10:5), метанол-25% розчин аміаку (40:5), а також у підтверджуючих системах на тіанептин метанол-ацетон (10:10) та ацетон-етилацетат-ацетатна кислота (10:20:2) на хроматографічних пластинках спостерігалось ще по одній додатковій зоні локалізації, які відповідали основним метаболітам міансерину та тіанептину. При опроміненні пластинок УФ-світлом, плями міансерину та його основного метаболіту давали голубу флуоресценцію, а тіанептин і його метаболіт жовту флуоресценцію. При проявленні реактивом Манделіна плями міансерину та його метаболіту забарвлювались у фіолетовий колір, а при проявленні 1% розчином бромтимолового синього, тіанептин та його метаболіт були забарвленні у жовтий колір.

Метод УФ-спектроскопії можна використовувати для ідентифікації міансерину та тіанептину у витяжках із промивних вод шлунку або в об'єктах, відібраних з місця події. Для виявлення міансерину та тіанептину, виділеного із органів чи біологічних рідин, даний метод рекомендовано застосовувати, після розділення з метаболітами на пластинках методом ТШХ.

Методи ПМР- та флуоресцентної спектроскопії, ВЕРХ та хромато-мас-спектрометрії використовували для ідентифікації досліджуваних речовин та їх метаболітів у витяжках після додаткової очистки методом ТШХ на пластинках із силікагелем “Silpearl”. При дослідженні проб, що містили міансерин, для розділення застосовували систему розчинників: метанол-ацетонітрил-25% розчин аміаку (30:10:5), а при дослідженні на тіанептин - ацетон-етилацетат-льодова ацетатна кислота (10:20:2). Елюювання досліджуваних сполук і їх метаболітів із сорбенту проводили хлороформом.

З метою ідентифікації можливих метаболітів вивчено ПМР-спектри міансерину і тіанептину та виділених і очищених метаболітів. ПМР-спекти знімали на приладі “Varian VXR-400”. Обґрунтування та ідентифікацію можливих метаболітів міансерину та тіанептину проведено in silico методом за допомогою програми Pallas 3.0 з паралельним використанням ПМР-спектроскопії. Так, для міансерину зазначений програмний пакет прогнозує 9 метаболітів, а для тіанептину 10 метаболітів. Порівняння спектральної картини чистого міансерину та метаболіту, дозволяє трактувати проходження реакції деметилювання та ідентифікацію сполуки М-7, а саме 1,2,3,4,10,14b-гексагідродибензо[c,f]-піразино[1,2-a]азепіну. Порівняння спектральної картини чистого тіанептину та метаболіту дозволяє трактувати утворення гідрокситіанептину.

Паралельно досліджували тіанептин, міансерин та їх основні метаболіти, виділені із органів отруєних тварин, методом хромато-мас-спектрометрії. Дослідження проводились на приладі Agilent 1100 LC/MSD SL, колонка Rapid Resolution HT Cartige 4,6Ч30 mm, 1,8 micron, Zorbax SB-C18 з діодно-матричним детектором G1315B, та мас-селективним детектором G1956B.

При одержанні мас-спектрів, отриманих після розділення міансерину і тіанептину із основними продуктами їх біотрансформації, метаболіт міансерину ідентифіковано нами як деметилміансерин (масове число міансерину 265,2 та 266,3, а метаболіту - 250,2). Аналогічно, для тіанептину (масове число 437,1 та 439,1) його метаболіт ідентифіковано як гідроксотіанептин (масове число 453,1).

При дослідженні витяжок із органів отруєних тварин методом ВЕРХ на хроматограмах поряд з піками досліджуваних компонентів виписуються піки основних продуктів метаболізму міансерину та тіанептину. Час утримування міансерину 3,37 хв., а метаболіту, ідентифікованого як деметилміансерин - 2,52 хв. На хроматограмі тіанептину поряд з піком досліджуваного препарату (час утримування 4,33 хв) виписується також пік його метаболіту, ідентифікованого як гідроксотіанептин (час утримування 6,25 хв).

Кількість препаратів в пробах, одержаних при виділенні із модельних зразків біологічного матеріалу, визначали методами екстракційної фотометрії та ВЕРХ, а кількість цих сполук, отриманих при виділенні із органів отруєних тварин - методами флуоресцентної спектрометрії та ВЕРХ.

Таблиця 2 Результати виділення міансерину та тіанептину із модельних зразків біологічного матеріалу

Встановлено, що при дослідженні витяжок з модельних проб печінки, сечі та крові, одержані дані корелюють із результатами кількісного визначення міансерину та тіанептину двома методами аналізу (табл. 3). Аналогічне корелювання результатів, спостерігалося при визначенні кількісного вмісту міансерину та тіанептину, виділених із органів отруєних тварин. Вивчено розподіл міансерину та тіанептину в органах отруєних тварин (щурів) через 24 год після внутрішньошлункового введення. Проведені дослідження показали, що найбільші кількості міансерину накопичуються в крові, печінці, сечі, нирках та шлунку. Тіанептин в найбільших кількостях знаходиться в крові, шлунку, сечі і нирках. Саме ці органи рекомендовано направляти на хіміко-токсикологічне дослідження при летальних отруєннях міансерином та тіанептином.

Встановлено терміни зберігання міансерину та тіанептину в біологічному матеріалі при його гнитті. Через 50 днів запропонованим нами методом, можна виділити біля 34% міансерину і до 13% тіанептину. Встановлено, що через 100 діб виявляються невеликі кількості міансерину 1,7% і зовсім не виявляється тіанептин. При більш тривалому зберіганні біологічного матеріалу міансерин не виявляли.

На основі проведених досліджень запропонована схема хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на міансерин та тіанептин (схема 1).

ВИСНОВКИ

1. На основі комплексних систематичних досліджень вперше запропоновано та обґрунтовано схему виконання цілеспрямованого хіміко-токсикологічного дослідження біологічного матеріалу на наявність міансерину та тіанептину, що включає методики ізолювання із біологічного матеріалу, ефективні способи очистки виділених сполук, чутливі та експресні методики ідентифікації та кількісного визначення.

2. Запропоновано чутливі методики виявлення міансерину та тіанептину за допомогою осадових та кольорових реакцій, методами ТШХ, ВЕРХ, УФ- та флуоресцентної спектроскопії, які придатні для виявлення досліджуваних сполук виділених із біологічного матеріалу.

3. Розроблено чутливі та репродуктивні методики кількісного визначення міансерину та тіанептину у водних розчинах та у витяжках з біологічного матеріалу методами екстракційної-фотоколориметрії, УФ-спектрофотометрії, флуориметрії та ВЕРХ. Встановлено, що методики кількісного визначення міансерину та тіанептину не навантажені систематичною похибкою, а одержані результати є достовірними.

4. Вивчені умови екстракції міансерину та тіанептину з водних розчинів в залежності від природи органічного розчинника і рН середовища. Встановлено, що міансерин добре екстрагується з лужного середовища при рН 8-9, а тіанептин із слабокислого середовища - при рН 5-6. Оптимальним розчинником для їх екстракції є хлороформ. Ступінь одноразової екстракції міансерину хлороформом становить 98%, а тіанептину - 95%.

5. Вперше проведена порівняльна оцінка методів виділення міансерину та тіанептину із біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами, і встановлено, що даними методами виділяються незначні кількості досліджуваних препаратів.

6. Розроблено ефективні методики виділення міансерину та тіанептину з біологічного матеріалу та біологічних рідин (крові та сечі), що ґрунтуються на ізолюванні цих препаратів 30% розчином ацетатної кислоти. Розробленою методикою можна виділити до 60% міансерину і до 53% тіанептину з біологічного матеріалу (печінка). З крові цим методом виділяється до 66% міансерину і до 59% тіанептину. З сечі даним методом виділяється до 91% міансерину і до 83% тіанептину.

8. Ідентифіковано основні метаболіти міансерину та тіанептину, виділені із органів отруєних тварин (щурів), за допомогою ПМР-спектроскопії, хромато-мас-спектрометрії, ТШХ та ВЕРХ.

9. Вивчено розподіл міансерину та тіанептину в органах отруєних тварин. Встановлено, що через 1 добу при пероральному введені найбільша кількість міансерину виявляється в шлунку, печінці, нирках, крові та сечі, а тіанептину - в нирках, шлунку із вмістом, крові та сечі.

10. Встановлено терміни зберігання міансерину та тіанептину в біологічному матеріалі при його гнитті. Через 90 діб можна виділити до 12,6% міансерину та 2,6% тіанептину. При більш тривалому зберіганні трупного матеріалу препарати не виявляються.

11. Розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на виявлення міансерину та тіанептину. Внесено доповнення до загальноприйнятої схеми ТШХ-скринінгу невідомої отрути в біологічних об'єктах.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гончарук Н.В. Міансерин і тіанептин - антидепресанти нового покоління / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді IV Міжнародної науково-практичної конференції „Динаміка наукових досліджень 2005.”- Дніпропетровськ, 2005. - С. 28-29. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

2. Гончарук. Н.В. Застосування методу хроматографії в тонкому шарі сорбенту для ідентифікації тіанептину/ Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Фармацевтичний часопис. - 2007.- № 3. - С. 37-38. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

3. Гончарук Н.В. Дослідження умов екстракції тіанептину органічними розчинниками / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю „Досягнення в галузі аналітичної, судово-медичної, клінічної токсикології та наркології.”-Запоріжжя, 2007. - С. 278-279. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

4. Гончарук Н.В. Екстракційно-фотометричне визначення міансерину / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Медична хімія .-2008. -Т.10 - № 1- С.118-120. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

5. Гончарук. Н.В. Порівняльна оцінка методів виділення тіанептину з біологічного матеріалу / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Фармацевтичний часопис. - 2008.- №3. - С. 46-49. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

6. Гончарук. Н.В. Екстракція тіанептину з водних розчинів та його аналіз у біологічних рідинах організму / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2008.- № 1-3. - С. 96-99. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

7. Гончарук Н.В. Умови екстракції міансерину органічними розчинниками / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді ХII Міжнародного медичного конгресу студентів та молодих вчених. - Тернопіль, 2008. - С. 214-215. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

8. Гончарук Н.В. Розробка методів аналізу міансерину / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Фармацевтичний журнал. - 2008. - № 6. - С. 58-61. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

9. Гончарук Н.В. Вивчення термінів зберігання міансерину у біологічному матеріалі / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді 3-ї науково-практичної конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів.” - Тернопіль, 2009. - С. 41-42. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

10. Гончарук Н.В. Виділення тіанептину із біологічного матеріалу / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді ХIIІ Міжнародного конгресу студентів та молодих вчених. - Тернопіль, 2009. - С. 212. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

11. Гончарук Н.В. Методи виділення міансерину із біологічного матеріалу / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Тези доповіді Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю „Сучасні проблеми судово-токсикологічної науки і практики.”- Харків, 2009. - С. 73-75. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

12. Гончарук Н.В. Судово-хімічне дослідження міансерину / Н.В. Гончарук, І.Й. Галькевич // Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоровґя № 79-2009. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та узагальнення результатів, підготовка матеріалів).

АНОТАЦІЇ

Гончарук Н. В. Хіміко-токсикологічне дослідження міансерину та тіанептину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за фахом 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Міністерство охорони здоров'я України. Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, Львів, 2009.

Дисертаційна робота присвячена хіміко-токсикологічному дослідженню препаратів групи трициклічних та чотирициклічних антидепресантів - міансерину та тіанептину.

У даній роботі наведені результати виявлення міансерину та тіанептину за допомогою осадових, кольорових реакцій, методами УФ-, ПМР-, хромато-мас-спектроскопії, ТШХ та ВЕРХ. Для кількісного визначення досліджуваних препаратів розроблено і запропоновано експресні та чутливі методики УФ-спектрофотометрії, екстракційної фотометрії, флуоресцентної спектрометрії та ВЕРХ, які придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу. Вивчено умови екстракції міансерину та тіанептину з водних розчинів 1,2-дихлоретаном, діетиловим етером, бензеном хлороформом та толуеном у залежності від рH середовища і наявності електролітів. Порівняно ефективність загальних методів ізолювання міансерину та тіанептину із біологічного матеріалу. Запропоновано ефективні методики ізолювання досліджуваних сполук та їх метаболітів з біологічного матеріалу 30% розчином ацетатної кислоти, а також опрацьовані методики виділення міансерину та тіанептину з біологічних рідин. Вивчено розподіл досліджуваних сполук в органах отруєних тварин і терміни зберігання в трупному матеріалі при його гнилісному розкладанні.

На основі проведених досліджень запропонована схема хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на наявність міансерину та тіанептину та їх метаболітів.

Ключові слова: міансерин, тіанептин, хроматографія в тонких шарах сорбенту, спектроскопія, хромато-мас-спектрометрія, високоефективна рідинна хроматографія, екстракція, виділення, біологічний матеріал, хіміко-токсикологічний аналіз.

Keywords: mianserine, tianeptine, thin layer chromatography, spectrometry, chromato-mass-spectroscopy, high-performance liquid chromatography, extraction, separation, biological material, chemical-toxicological analysis.

Размещено на Allbest.ru