Применение метода жидкостной хроматографии в отраслях пищевой промышленности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Теоретические основы спектрального анализа

1.1 Сущность метода жидкостного хроматографического анализа

1.2 Устройство и схема работы жидкостного хроматогрофа

2. Описание спектрофотометрических методов анализа

2.1 Особенности отдельных методов анализа

2.2 Использование жидкостной хроматографии в анализе пищевой продукции

3. Анализ с использованием жидкостного хроматогрофа

3.1 Методика измерения и расчетные формулы

3.2 Определение содержания жирорастворимых витаминов

Заключение

Список используемой литературы

Приложение А

Введение

Жидкостная хроматография - это целая группа методов разделения, в которых происходит распределение соединений между подвижной жидкой фазой и стационарной фазой с большой удельной поверхностью, над которой перемещается жидкая фаза. Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Тема данной работы является актуальной, так как метод жидкостной хроматографии является одним из наиболее совершенных среди методов количественного анализа пищевой продукции. Метод осуществляется с помощью приборов, называемых хроматографами, в большинстве из которых реализуется проявительный вариант хроматографии. Хроматографы используют для анализа и для препаративного разделения смесей веществ.

Объект исследования - метод жидкостной хроматографии, применяемый в отраслях пищевой промышленности.

Целью работы является изучение применения метода жидкостной хроматографии.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- изучить теоретические основы Жидкостного хроматографического анализа;

- рассмотреть устройство и схему работы хроматографа;

- изучить особенности отдельных методов анализа и методику измерения, и расчетные формулы;

- провести анализ с использованием хроматографа.

Для выполнения работы использовалась информация, опубликованная в периодической печати, специальной литературе, информационные материалы отдельных сайтов системы Интернет.

1. Теоретические основы спектрального анализа

1.1 Сущность метода жидкостного хроматографического анализа

Жидкостная хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов. Жидкостная хроматография может быть осуществляется в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В некоторых случаях для идентификации веществ используется жидкостная хроматография в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ.

Жидкостная хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и других биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ от 10^-11 до -10^-9 г, что исключительно важно в биологических исследованиях. Химики, экологи, медики, криминалисты в настоящее время не могут обойтись без применения в своей работе хроматографических методов, используемых для ранней диагностики заболеваний, изучения метаболизма лекарств и пищевых продуктов. Анализ компонентов запахов, органических загрязнителей в атмосфере городов, допинговый контроль на спортивных олимпиадах, поиск психотропных веществ в организме человека - все это под силу хроматографии.

Основные достоинства жидкостного хроматографического анализа:

- экспрессность; высокая эффективность; возможность автоматизации и получение объективной информации;

- сочетание с другими физико-химическими методами;

- широкий интервал концентраций соединений;

- возможность изучения физико-химических свойств соединений;

- осуществление проведения качественного и количественного анализа;

- применение для контроля и автоматического регулирования технологических процессов.

Возможности использования инфракрасной спектроскопии для качественного обнаружения и определения структуры.

Жидкостная хроматография является важнейшим физико-химическим методом исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии; применяется как в аналитических, так и препаративных целях. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и других химических соединений., для изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов, для диагностики в медицине, анализа продуктов химического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, сточных вод, кинетики и селективности химических процессов. В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции. Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, в пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающей среды, в криминалистике.

Хотя жидкостная хроматография была открыта раньше газовой, она лишь во второй половине 20 века вступила в период исключительно интенсивного развития. В настоящее время по степени разработки теории хроматографического процесса и техники инструментального оформления, по эффективности и скорости разделения она вряд ли уступает методу газохроматографического разделения. Однако каждый из этих двух основных видов хроматографии имеет свою преимущественную область применения. Если газовая хроматография пригодна главным образом для анализа, разделения и исследования химических веществ с молекулярной массой 500 - 600, то жидкостная хроматография может быть использована для веществ с молекулярной массой от нескольких сот до нескольких миллионов, включая предельно сложные макромолекулы полимеров, белков и нуклеиновых кислот. Вместе с тем противопоставление различных хроматографических методов по своей сути лишено здравого смысла, так как хроматографические методы удачно дополняют друг друга, и к самой задаче конкретного исследования надо подходить по-иному, а именно, какой хроматографический метод позволяет решить ее с большей скоростью, информативностью и с меньшими затратами.

Как и в газовой хроматографии, в современной жидкостной хроматографии применяют детекторы, позволяющие непрерывно фиксировать концентрацию определяемого вещества в потоке жидкости, вытекающей из колонки.

Единого универсального детектора для жидкостной хроматографии не существует. Поэтому в каждом конкретном случае следует подбирать наиболее подходящий детектор. Наибольшее распространение получили ультрафиолетовый, рефрактометрический, микроадсорбционный и транспортный пламенно-ионизационный детекторы.

Спектрометрические детекторы. Детекторы этого типа являются высокочувствительными селективными приборами, позволяющими определять в потоке жидкой фазы весьма малые концентрации веществ. Их показания мало зависят от колебаний температуры и других случайных изменений среды. Одна из важных особенностей спектрометрических детекторов заключается в прозрачности большинства применяющихся в жидкостно-адсорбционной хроматографии растворителей в рабочей области длин волн.

Чаще всего применяют поглощение в УФ, реже в ИК области. В УФ области применяют приборы, работающие в широком диапазоне - от 200 нм до видимой части спектра, либо на определенных длинах волн, чаще всего на 280 и 254 нм. В качестве источников излучения применяются ртутные лампы низкого давления - 254 нм, среднего давления - 280 нм и соответствующие фильтры.

Микроадсорбционные детекторы. В основе действия микроадсорбционных детекторов лежит выделение теплоты при адсорбции вещества на адсорбенте, которым заполнена ячейка детектора. Измеряется, однако, не теплота, а температура адсорбента, до которой он нагревается в результате адсорбции.

Микроадсорбционный детектор - достаточно высокочувствительный инструмент. Его чувствительность зависит прежде всего от теплоты адсорбции.

Микроадсорбционные детекторы являются универсальными, пригодными для детектирования как органических, так и неорганических веществ. Однако на них трудно получить достаточно четкие хроматограммы, особенно при неполном разделении компонентов смеси.

1.2 Устройство и схема работы жидкостного хроматогрофа

Хроматограф - прибор для разделения смеси веществ методом хроматографии.

Обычно хроматографы делят на две большие группы -- газовые и жидкостные, по типу используемого элюента. В газовых хроматографах элюентом выступает газ, как правило, инертный, в основном используются водород, гелий, азот и аргон. В жидкостной хроматографии носителем является жидкость, как правило, органические растворители, вода и водные растворы используются в особых видах хроматографии, например, в гель-фильтрующей).

Основными частями хроматографов являются: система для ввода исследуемой смеси веществ (пробы); хроматографическая колонка; детектирующее устройство (детектор); системы регистрации и термостатирования; для препаративных (в т. ч. производственных) хроматографов, кроме того, отборные приспособления и приёмники для разделённых компонентов.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы самой различной степени сложности -- от наиболее простых систем, собранных из минимально необходимого количества блоков, до комплектных хроматографов, снабженных мини-компьютерами, которые контролируют заданные рабочие параметры, формируют градиент подвижной фазы, управляют различными дополнительными устройствами (автоматический ввод 1-пробы, коллектор фракций и др.) и проводят обработку получаемых данных. Комплектные приборы с высокой степенью автоматизации обычно обеспечивают высокую производительность и точность результатов, что особенно важно в производственных условиях для контроля качества продукции. Однако самостоятельная сборка хроматографа из отдельных блоков дает возможность легко модифицировать прибор в зависимости от поставленной задачи и более эффективно использовать имеющееся оборудование.

Самыми распространенными жидкостными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей.

Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные), главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

На рисунке 1 изображена схема изократического хроматографа.

Рисунок 1 Схема изократического хроматографа 1 - резервуар; 2 - прецизионный насос; 3 - автосамплер; 4 - разделительные элементы; 5 - детектор; 6 - аналоговый регистратор; 7 - сливная емкость; 8 - in-line фильтр; 9 - входной фильтр

Подвижная фаза из емкости через входной фильтр подается прецизионным насосом высокого давления в систему ввода образца - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр, образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор и удаляется в сливную емкость. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Рисунок 2 Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления 1 - резервуары; 2 - прецизионный насос высокого давления; 3 - ручной инжектор; 4 - разделительные элементы; 5 - детектор; 6 - аналоговый регистратор; 7 - сливная емкость; 8 - in-line фильтр; 9 - входной фильтр; 10 - программатор градиента

Подвижная фаза из емкостей через входные фильтры и программатор градиента подается прецизионным насосом высокого давления в систему ввода образца - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр, образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор и удаляется в сливную емкость. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных -интегратор или компьютер. В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

На рисунке 3 изображена схема изократического хроматографа градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Рисунок 3 Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления 1 - резервуары; 2 - прецизионный насос высокого давления; 3 - ручной инжектор; 4 - предколонка, разделительная колонка; 5 - детектор; 6 - аналоговый регистратор; 7 - сливная емкость; 8 - in-line фильтр; 9 - входной фильтр; 10 - динамический смеситель потока; 11- прецизионный насос

Подвижная фаза из емкостей через входные фильтры подается прецизионными насосами высокого давления через статический или динамический смеситель потока в систему ввода образца - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр, образец с током подвижной фазы поступает в элемент разделения - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор и удаляется в сливную емкость. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

жидкостный хроматографический спектрофотометрический хроматография

2. Описание спектрофотометрических методов анализа

2.1 Особенности отдельных методов анализа

Жидкостная хроматография разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита.

В основу одной из разновидностей ЖХ - ион-парной (ИПХ) положены принципы классической экстракции ионных веществ из водной в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляется противоион, способный вступать в селективное комплексообразование с анализируемыми компонентами с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.

При выборе условий разделения необходимо учитывать молекулярную массу компонентов образца, их полярность и природу сопутствующих соединений. Если молекулярная масса превышает 2000 у.е., то обычно обращаются к методу эксклюзионной, или гель-хроматографии. Во всех остальных случаях решение задачи разделения многокомпонентной смеси возможно в принципе осуществить методами адсорбционной или распределительной ЖХ в нормально- или обращенно-фазовом варианте (ОФ). Нормально-фазовый режим предпочтителен, если анализируемые вещества содержат различные функциональные группы. При этом имеют значение количество функциональных групп, способность анализируемых соединений к образованию водородных связей, строение (например, цис-трансизомерия). Если вещества обладают слабым сродством к подвижной фазе, то используют активные слои сорбента и слабо полярные растворители. К ОФ-хроматографии прибегают при разделении гомологов, сильно полярных веществ, анализ которых на полярных сорбентах неэффективен, а также соединений, сродство которых к полярной неподвижной фазе незначительно.

По оценкам авторитетных специалистов, 70% хроматографических анализов проводят методом ОФ ВЭЖХ; разработаны и внедрены сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми алкильными радикалами. Чаще всего применяют сорбенты с С8- и С18-группами, стабильные в водных растворах в интервале рН 2-8. Этим объясняется их эффективное использование при анализе биологических объектов. Методом ОФ ВЭЖХ осуществляется определение важнейших нейромедиаторов (от лат. mediator - посредник; медиаторы передают информацию в живом организме, меняя ионную проницаемость наружных клеточных мембран) в плазме крови, спинномозговой жидкости, что имеет большое значение для диагностики различных заболеваний мозга (паркинсонизм, эпилепсия, шизофрения, болезнь Альцгеймера). Времена выхода компонентов, отсчитываемые от момента ввода пробы до регистрации вершины хроматографического пика, или, иначе, объемы подвижной фазы, затраченные на перенос через колонку каждого компонента, дают качественную характеристику анализируемых веществ (рис. 3). Сопоставление площадей (или высот) хроматографических пиков позволяет выполнять количественные определения.

Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая.

В основе этого варианта ЖХ лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам. В эксклюзионной (от англ. exclusion - исключение; устаревшее название - ситовая) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, а неподвижная - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля). Если молекулам анализируемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Молекулы или ионы, размеры которых находятся между максимальным и минимальным диаметром пор геля, разделяются на отдельные зоны. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа.

Особенно интенсивное развитие эксклюзионная хроматография получила в последние два десятилетия, чему способствовало внедрение в химическую и биохимическую практику сефадексов - декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином. На различных типах сефадексов можно фракционировать химические вещества с различными молекулярными массами, поэтому их широко используют для выделения и очистки биополимеров, пептидов, олиго- и полисахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток (лимфоцитов, эритроцитов), в промышленном производстве различных белковых препаратов, в частности ферментов и гормонов. Были не только выделены и исследованы ранее неизученные белки, но и получена информация, заставившая пересмотреть некоторые традиционные представления. Так, при гель-фильтрации образцов плазмы крови животных и человека оказалось, что ростовые вещества выходят из колонки в основном не тогда, когда их ожидают согласно молекулярной массе (6-8 тыс. дальтон), а значительно раньше, то есть в одной фракции с высокомолекулярными белками. Выяснилось, что крупные пептиды, подобно низкомолекулярным веществам, могут циркулировать в крови в комплексе с белком-носителем. Это явление имеет важное физиологическое значение, и нарушение по каким-либо причинам биосинтеза белка-носителя приводит к серьезным патологиям. Сообщалось еще об одном интересном явлении, связанном с белковыми гормонами и обнаруженном в режиме эксклюзионной хроматографии. Установлено, что мономер гормона соматотропина (гормон роста), белка с молекулярной массой 21 тыс. дальтон, через несколько минут после его введения человеку или животному перераспределяется в крови по белковым фракциям с молекулярной массой вплоть до 100 тыс. дальтон. Причиной могут быть связывание его с каким-либо транспортным белком или собственная агрегация. Для другого гормона - кортикотропина, регулирующего функции надпочечников, перераспределение по фракциям сопровождается изменением биологической активности. Все это удалось выяснить благодаря гель-хроматографии.

Особое место в жидкостной хроматографии занимает так называемая аффинная, или биоспецифическая, хроматография (от англ. affinity - сродство). Аффинная хроматография (АХ) основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Научные основы метода заложены в 1951 году в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности АХ были получены еще в 1910 году. Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы. В основе АХ лежит уникальное свойство биологически активных соединений узнавать строго определенные вещества, в процессе которого реализуется так называемый принцип молекулярного распознавания. Фермент узнает свой субстрат, антиген - антитело, гормон - рецептор. Как правило, каждый фермент катализирует определенный тип реакции. Возникновение соответствующего комплекса фермент - субстрат обусловлено строгим соответствием структур обоих участников комплексообразования.

Процесс разделения веществ с использованием АХ включает несколько самостоятельных этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем, ковалентно связанным с каким-либо биологически активным веществом (называемым аффинантом, или лигандом). В качестве носителей в АХ получили широкое распространение гранулированные гели агарозы и полиакриламида (биогель Р), полистирольные смолы с химически активными группами, целлюлоза и ее производные и т.д. Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ, к одному из которых иммобилизованный лиганд обладает биологическим сродством. Выбирая из смеси требуемое соединение, аффинант образует с ним комплекс. Остальные компоненты пройдут через колонку, не задерживаясь [4]. Специфически адсорбированный фермент может быть освобожден из комплекса изменением природы элюента, рН или ионной силы. На рис. 4 представлены основные этапы аффиной хроматографии. Лигандами могут служить самые различные соединения: белки, пептиды, аминокислоты, витамины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и многие другие вещества.

Иммобилизации лиганда на поверхности носителя обычно предшествует стадия его активации, то есть формирование реакционноспособных групп, взаимодействующих с лигандами. Непосредственное ковалентное связывание осуществляется редко, особенно если молекулы лиганда небольшие по размеру, что вызвано стерическими препятствиями из-за близкого расположения химически активных групп носителя. Для того чтобы погасить этот неблагоприятный эффект, связывание молекулы лиганда с поверхностью осуществляют через удлиняющий мостик, представляющий собой алифатическую цепочку из 2-10 атомов углерода. Активные группы носителя, оставшиеся несвязанными, блокируют соответствующими химическими агентами. Наиболее распространенный способ активации носителей, содержащих поверхностные гидроксильные группы, - обработка бромцианом в щелочной среде (рН ~ 11).

Образующиеся в результате имидокарбонатные группы легко присоединяют белки, пептиды и аминокислоты в качестве лигандов по их концевой свободной a-аминогруппе.

Оптически активные соединения играют исключительно важную роль во многих биологических процессах, их исследование имеет принципиальное значение для контроля оптической чистоты производимых пищевых продуктов, разделения рацематов. Эти соединения интересуют химиков с того момента, как выяснилась уникальная способность природы создавать подобные объекты.

2.2 Использование жидкостной хроматографии в анализе пищевой продукции

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии.

Источники и причины загрязнений пищевых продуктов могут быть самыми различными. В пищу попадают загрязнения из окружающей среды (преимущественно из воды, почвы), за счет природных загрязнителей (микотоксинов), при нарушении режима хранения пищевых продуктов, за счет всевозможных добавок (консерванты, антиокислители, красители, искусственные подслащи-вающие средства, ароматизаторы, горчащие веще-ства, эмульгаторы и др). Для ускорения роста и увеличения привеса ско-та в корма добавляют антибиотики, сульфаниламиды, гормоны и др. На эти так называемые ветеринарные лекарственные соединения устанавливают определенные нормы, которые часто нарушаются.

Загрязнения или нежелательные вредные соединения попадают в пищевые продукты также из упаковочных материалов, после термообработки или радиационного воздействия на пищевые продукты. Токсичные вещества попадают в пищевые продукты и напитки при нарушении технологии их получения или обработки (например, нитрозоамины в пиве). Большое распространение получила фальсификация пищевых продуктов и напитков, в частности растительных и сливочных масел, вин, коньяков, минеральной воды и других напитков.

На основе ионной хроматографии разработана методика определения бромата в питьевой озонированной воде (бромат -- потенциальный анцероген при 0,05 мкг/л); методика официально утверждена ИСО 15061:2001. Для оценки экологического состояния морских вод предложено ионохроматическое определение соотношения иодида к иодату.

Приведенные примеры показывают уникальные возможности жидкостного хроматографа в контроле загрязнений окружающей среды, пищевых продуктов и в клинических анализах.

Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

3. Анализ с использованием жидкостного хроматогрофа

3.1 Методика измерения и расчетные формулы

С помощью хроматографического метода анализа можно определить количественное содержание жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (б-токоферола и его сложноэфирных форм) и D₃ (холекальциферола) в продуктах детского питания.

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Массовая концентрация анализируемой i-го компонента (витамина А (ретинола), витамина Е (б-токоферола) и витамина D₃ (холекальциферола)) в параллельных пробах, введенных в хроматограф (C_i1) и (C_i2), автоматически рассчитывается системой сбора и обработки хроматографической информации. Диапазоны измерений массовой доли витаминов представлены в таблице 1.

Талица 1

Диапазоны измерений массовой доли витаминов

Наименование объекта	Диапазон измерений массовой доли, мг/кг	Показатель точности (границы относительной погрешности), ±д, %, при Р=0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадрати- ческое отклонение повторяемости), уr, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадрати-ческое отклонение воспроизводимости), уR, %	Предел повторяемости, r, %, P=0,95, n=2
Витамин А	от 0,2 до 9,0 вкл.	20	6	9	17
	св. 9,0 до 50,0 вкл.	17	5	8	14
	св. 50,0 до 5000 вкл.	14	3,5	6	10
Витамин Е	от 25,0 до 240,0 вкл.	32	10	15	28
	св. 240,0 до1500 вкл.	20	5	8	14
Витамин D3	от 0,5 до 50,0 вкл.	28	9	14	25
	св. 50,0 до 100 вкл.	14	4,5	7	12

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (для витамина А - 0,0200 мг/дм³, для витамина Е - 0,1500 г/дм³, для витамина D₃ - 0,0150 г/дм³), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют спиртом изопропиловым. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации i-го компонента в пробах, введенных в хроматограф (C_i1 и C_i2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле:

С_iср = ( С_i1 + С_i2 ) / 2 (1)

Массовую долю i-го компонента в анализируемой пробе _{Xi пр}, [мг/кг] рассчитывают по формуле:

Xi =	Cicp · V1 · V3 · K2	(2)
	K1 · mпр · V2

где:С_iср - среднее значение массовой концентрации i-го компонента в пробе, введенной в хроматограф [г/дм³];

m_пр - масса пробы продукта, [г];

V₁ - объём гидролизата [см³];

V₂ - объём гидролизата, взятого на анализ, до разбавления водой (V₂ = 8 см³);

V₃ - объём элюата;

K₁ - коэффициент, учитывающей выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы (см. таблицу);

K₂ - коэффициент различия процедур подготовки к анализу градуировочных растворов и проб, рассчитанный по формуле:

K2	=	Vгр1	·	Vгр3	(3)
		V1		V3

где:Vгр1 - объем гидролизата градуировочных растворов [см³];

Vгр3 - объем элюата при ТФЭ градуировочных растворов.

После сокращений расчётная формула принимает вид:

Xi =	Cicp · Vгр1 · Vгр3	(4)
	K1 · mпр · V2

Коэффициент K₁, учитывающий выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы для различных видов продуктов (эмпирические данные) представлен в таблице 2.

Талица 2

Значение коэффициента K₁ для различных видов продуктов

Коэффициент K1	Мука, хлеб, макаронные изделия	Премиксы, БАД, детское питание	Масложировая продукция
Витамин А	0,90	0,98	0,90
Витамин Е	0,70	0,98	0,65
Витамин D3	0,90	0,98	0,80

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли i-го компонента в двух параллельных пробах.

3.2 Определение содержания жирорастворимых витаминов

Витамимны -- группа низкомолекулярных органических соединений относительно простого строения и разнообразной химической природы. Это сборная по химической природе группа органических веществ, объединённая по признаку абсолютной необходимости их для гетеротрофного организма в качестве составной части пищи. Автотрофные организмы также нуждаются в витаминах, получая их либо путем синтеза, либо из окружающей среды. Так, витамины входят в состав питательных сред для выращивания организмов фитопланктона. Витамины содержатся в пище (или в окружающей среде) в очень малых количествах, и поэтому относятся к микронутриентам.

Данный методика устанавливает метод измерения массовой доли жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (б-токоферола и его сложноэфирных форм) и D₃ (холекальциферола) в продуктах детского питания методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для определения содержания жиросодержащих витаминов была подготовлена проба к анализу. В качестве примера используются, два образца детского питания: детская молочная смесь «Малютка» от 0 до 6 месяцев и детская молочная смесь «Малютка» от 6 до 12 месяцев.

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

- щелочной гидролиз пробы продукта и извлечение из пробы витаминов;

- очистка гидролизата и концентрирование витаминов из пробы методом твердофазной экстракции;

- подготовка пробы для ввода в жидкостный хроматограф.

Рисунок 4 Блок-схема процедуры пробоподготовки

Величина навески зависит от большего или меньшего содержания витаминов. Поэтому берут до 50 г сухого продукта.

Для хроматографического определения жирорастворимых витаминов A, E и D₃ необходимо использовать градиентную ЖХ-систему с спектрофотометрическим детектором, позволяющим изменение длины волны источника света в процессе анализа, и термостатом колонок.

Данный метод основан на осветлении пробы ферментативным гидролизом или растворами Карреза; экстракции патулина из пробы этилацетатом; очистке органического экстракта водным раствором карбоната натрия (при необходимости - дополнительной очистке экстракта методом твердофазной экстракции) и определении витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с фотометрическим спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы A, E и D₃; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

В данном методе используется следующее оборудование:

- хроматограф жидкостный с спектрофотометрическим детектором;

- термостат колонок;

- персональный компьютер с установленным программным обеспечением.

Условия использования метода жидкостной хроматографии:

- градиентный режим разделения;

- подвижная фаза: ацетонитрил (элюент А) - дихлорметан (элюент В);

- программа градиентного элюирования:

- начало A=100% B=0%;

- градиент A=90% B=10% за 8 мин;

- градиент A=70% B=30% за 2 мин;

- изократика A=70% B=30% 10 мин;

- градиент A=100% B=0% за 3 мин;

- изократика A=100% B=0%;

- колонка;

- защитная колонка;

- скорость потока: 1,0 см³/мин;

- объем петлевого дозатора: 20 мкл;

- температура: комнатная;

- детектирование: спектрофотометрическое при смене длины волны источника света во время анализа

- 0 мин - длина волны 436 нм,

- 10 мин - длина волны 280 нм,

- 27 мин - длина волны 436 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы или чувствительности детектора.

Сбор, обработку и вывод данных осуществляют с помощью персонального компьютера с операционной системой «Windows XP», на котором установлена программа сбора и обработки хроматографических данных для «Windows XP».

Хроматограмма анализа детской молочной смеси «Малютка» от 0 до 6 месяцев представлена на рисунке 5

Рисунок 5 Смесь жирорастворимых витаминов в образце № 1

Хроматограмма анализа детской молочной смеси «Малютка» от 6 до 12 месяцев представлена на рисунке 6

Рисунок 5 Смесь жирорастворимых витаминов образце № 2

Из представленных хроматограмм видно, что содержание жирорастворимых витаминов в детской молочной смеси «Малютка» от 6 до 12 месяцев больше, чем содержание жирорастворимых витаминов в детской молочной смеси «Малютка» от 0 до 6.

Заключение

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и других химических веществ; изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов; диагностики в медицине; анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод; изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов.

Жидкостная хроматография - это целая группа методов разделения, в которых происходит распределение соединений между подвижной жидкой фазой и стационарной фазой с большой удельной поверхностью, над которой перемещается жидкая фаза. Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Жидкостная хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов. Жидкостная хроматография может быть осуществляется в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В некоторых случаях для идентификации веществ используется жидкостная хроматография в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ. Основные достоинства жидкостного хроматографического анализа:

- экспрессность; высокая эффективность; возможность автоматизации и получение объективной информации;

- сочетание с другими физико-химическими методами;

- широкий интервал концентраций соединений;

- возможность изучения физико-химических свойств соединений;

- осуществление проведения качественного и количественного анализа;

- применение для контроля и автоматического регулирования технологических процессов.

С помощью хроматографического метода анализа можно определить количественное содержание жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (б-токоферола и его сложноэфирных форм) и D₃ (холекальциферола) в продуктах питания,в том числе детского.

Список используемой литературы

1 Васильев В.П. Аналитическая химия, В 2 кн. Кн. 2 Физико-химические методы анализа: Учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. 4-е изд., стереотип. М.: Дрофа, 2004. 384 с.

2 Москвин Л.Н., Царицына Л.Г. Методы разделения и концентрирования в аналитической химии. Л.: Химия, 1991. 256 с.

3 Гуревич А.Л. Хроматографический анализ М.: Дрофа, 2007. 263 с.

4 Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшии Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. 269 с.

5 Киселев А.В., Яшин Я.И. Адсорбциоииая газовая и жидкостная хроматография. М.: Химия, 1979. 287 с.

6 Луговик Б.А. Жидкостная хроматография под высоким давлением анализ М.: Дрофа, 20011. 364 с.

7 Перри С, Амос Р., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии / Пер. с англ. М.: Мир, 1974. 260 с.

8 http://bibliofond.ru/view.aspx?id=43468.

9 http://ru.wikipedia.org/wiki/Бумажная_хроматография

Приложение А

Жидкостный хроматограф LC1000 HPLC

Размещено на Allbest.ru