Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

КОММЕДБІОПРОМ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

«Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі»

Шовковий Андрій Віталійович

Харків - 1999

Вступ

Актуальність дослідження. В останні роки велика увага приділяється створенню нових лікарських засобів на основі амінокислот, які поєднують у собі як пластичні, так і регуляторні функції і можуть проявляти різноманітну лікувальну дію на людський організм, а при тривалому застосуванні бути цінними профілактичними засобами.

Аналіз стану виробництва амінокислотних препаратів у країнах із розвинутою медичною промисловістю показує, що їх випуск із року в рік неухильно зростає. Так, за прогнозами на 1999 р, обсяг світового продажу амінокислотних препаратів повинен становити 5 - 6 млрд. дол. США.

В Україні виробництво препаратів на основі амінокислот, за виключенням таблеток “Аспаркам”, було практично відсутнім. Тому, починаючи з другої половини 80-х років, в ДНЦЛЗ розроблюються препарати як на основі індивідуальних амінокислот, так і препарати, діючими речовинами яких є нові, оригінальні субстанції. Це водорозчинні солі амінокислот і біологічно активних сполук (L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів). Як показали фармакологічні і клінічні дослідження одержаних сполук, вони є не тільки водорозчинними аналогами природних речовин (байкалін, есцин), але і мають значно ширший спектр біологічної дії, у порівнянні з вихідними продуктами.

У зв`язку з цим виникла необхідність розробки науково-технічної документації (НТД) на нові субстанції і препарати на їх основі, що неможливо зробити без доказу будови сполук, а також без застосування сучасних методів аналізу якості як субстанцій, так і готових лікарських форм.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Державного наукового центру лікарських засобів (№ держ. реєстрації 0288.0069232; 0189.0061283; 0193U041088).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - доказ будови нових біологічно активних сполук в ряду похідних амінокислот, розробка методик аналізу препаратів як на основі нових сполук, так і препаратів на основі суміші індивідуальних амінокислот і комбінованих амінокислотних препаратів, а також вивчення метрологічних характеристик розроблених методик.

У зв`язку з цим нами були поставлені такі завдання дослідження:

вивчення фізико-хімічних характеристик та біологічної дії амінокислот, флавоноїдів та тритерпенового глікозиду - есцину;

доказ будови нових водорозчинних солей: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів з використанням ІЧ-,УФ-спектроскопії, спектроскопії ПМР та ВЕРХ;

вибір ефективних методів аналізу препаратів, які створені на основі нових субстанцій;

розробка методик аналізу амінокислот і препаратів, діючими речовинами яких є суміші індивідуальних амінокислот;

вибір умов проведення аналізу препаратів, які є сумішшю амінокислот і інших діючих речовин;

вивчення метрологічних характеристик розроблених методик.

Наукова новизна одержаних результатів.

Доведена будова нових біологічно активних сполук: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів;

вибрані ефективні методи аналізу препаратів на основі вищенаведених субстанцій;

вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчена фракція флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської. Вивчена хроматографічна поведінка флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської;

розроблені методики аналізу індивідуальних амінокислот і препаратів на їх основі. Вивчена хроматографічна поведінка 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот;

науково обґрунтовані умови контролю препаратів, які містять суміші амінокислот та інших активних речовин;

вивчені метрологічні характеристики розроблених методик аналізу препаратів.

Практичне значення одержаних результатів.

Одержані 4 нові сполуки: L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів, які завдяки тому, що розчиняються у воді, значно перевищують за своєю біологічною дією байкалін, есцин, суміш флавонових глюкуронідів. На основі цих сполук, а також індивідуальних амінокислот розроблено 12 препаратів та 10 методик контролю якості препаратів, які введені у нормативно-технічну документацію:

ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат.

Проект ТФС 42У- L-гістидину байкалінат.

ТФС 42У-11/37-160-95 L-лізину есцинат.

Проект ТФС 42У- Розчин L-лізину байкалінату 20% для ін`єкцій.

Проект ТФС 42У- Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою.

ТФС 42У-11/37-1085-99 Розчин L-лізину есцинату 0,1% для ін`єкцій.

Проект ТФС 42У- Таблетки “СпермАмін”.

Проект ТФС 42У- Капсули “Октамін плюс”.

Проект ТФС 42У- Поліамін-У.

ТФС 42У-15/37-253-96 Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою.

Проект ТФС 42У- Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою.

Проект ТФС 42У- Таблетки “Факовіт”.

Перелічені препарати впровадженні у виробництво на АТ “Фармацевтична фабрика Здоров`я”, АТ “Київмедпрепарат”, ВАТ “Луганський ХФЗ” та АТ “Галичфарм”. Випуск препарату “Поліамін-У” планується на ЗАТ “Біолек”.

Особистий внесок здобувача полягає в отриманні наукових результатів, які викладені у дисертації, плануванні експерименту, апробації розроблених методик контролю якості лікарських засобів та участі у розробці 12 НТД на препарати, одними із основних діючих речовин яких є амінокислоти.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені і обговорені на республіканській науково-практичній конференції “Наукові дослідження і проблеми виробництва лікарських засобів” (Харків,1995), на Всеукраїнській конференції по аналітичній хімії (Ужгород, 1998), на Міжнародній науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття: інновації та традиції” (С.-Петербург, 1999).

лікарський лізиновий флавоновий байкальський

1. Доказ будови i складу нових біологічно-активних сполук

З метою збільшення бiодоступностi природних сполук, таких як байкалiн, есцин, сумiш флавонових глюкуронідiв i розширення спектру iх фармакологiчноi дiї, були отриманi такi сполуки: L-лiзину байкалiнат, L- гiстидину байкалiнат i L-лiзину есцинат, суміш лiзинових солей флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської.

Для доказу будови сполук нами були вивчені ІЧ-, ПМР-, УФ-спектри, хроматографічна поведінка цих речовин, а також вихідних речовин - L-лiзину, L-гiстидину, байкалiну, есцину i сумiші флавонових глюкуронідів.

Характерною особливістю ІЧ-спектрів нових сполук є відсутність смуги поглинання карбоксильної групи глюкуронової кислоти, яка присутня в спектрах байкаліну, есцину та суміші флавонових глюкуронідів при ~ 1740 см-1, а також наявність двох інтенсивних смуг при 1615 та 1410 см-1, які належать асиметричним та симетричним валентним коливанням карбоксилат-іону глюкуронової кислоти. Треба відзначити, що дві останні смуги складні і включають як смуги карбоксилат-іону глюкуронової кислоти, так і карбоксилат-іону амінокислоти, яка створює внутрішню соль.

Те, що до складу речовин входять амінокислоти і біологічно активні сполуки, було доказано також методами ПМР, УФ-спектроскопії та ВЕРХ.

На основі проведених досліджень було встановлено, що одержані нами сполуки - солі i мають такі структурні формули:

Рис. 1 - L-лізину байкалінат

4-, -дiамiнокапронової кислоти-5,6,7-триоксифлавон-7-0--0-глюкуронiдат.

Рис. 2 - L-гістидину байкалінат

4--амiно--iмiдазолiлпропiонової кислоти-5,6,7-триоксифлавон-7-0--0-глюкуронiдат

Рис. 3 - L-лізину есцинат

4-, -дiамiнокапронової кислоти-28-(3-ацетокси-2-метилбутират)-есцигенiн, -4 -0--0-глюкопiронозин-глюкуронiдат.

2. Склад i хроматографічна поведінка флавонових глюкуронiдiв надземної частини шоломниці байкальської

Пiд час дослiджень фракції надземної частини шоломниці байкальської методом ВЕРХ, було встановлено, що до її складу входять 8 флавонових глюкуронiдiв, п`ять з яких удалося iдентифiкувати.

Хроматографування проводилось на колонцi, заповненiй сорбентом С 18, з використанням рухомої фази: метанол-кислота оцтова-вода із градієнтом метанолу від 30 до 60% об.

При порівнянні часу утримання речовин (табл. 1) встановлено, що із збільшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронідiв, їх час утримання зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдрокси-груп менший час утримання мають ті флавонові глюкуроніди, у яких ОН-групи знаходяться у В-колiфлавона.

Прикладом цьому можуть бути пари флавонових глюкуронідів: лютеолін-7-О--D-глюкуронід/скутелярін-7-О--D-глюкуронід и апігенін-7-О--D-глюкуронід/байкалеїн-7-О--D-глюкуронід.

Таблиця 1 - Порівняльна таблиця будови флавонових глюкуронідів, які входять до складу фракції, отриманої з надземної частини шоломниці байкальської

Подальші дослідження показали, що головними компонентами суміші є скутелярін-7-О--D-глюкуронід, апігенін-7- О--D-глюкуронід та хрізин-7-О--D-глюкуронід (табл. 2).

Таблиця 2 - Кількісний склад фракції флавонових глюкуронідів, отриманої з надземної частини шоломниці байкальської

З таблиці видно, що склад окремих компонентів у сумiшi, до i пiсля одержання солі, залишається практично незмінним (різниця-2,5%), що не перевищує відносне стандартне відхилення при кількісному визначенні методом ВЕРХ.

Дослідження складу суміші тритерпенових глікозидів - есцину.

Дослідження есцину 4-х серій, методом ВЕРХ, показали, що до складу речовини входять 14 тритерпенових глікозидів.

Встановлено, що на поданій хроматограмі -есцину - основному компоненту речовини есцин, належать піки 5,6,7,8. Належність -есцину чотирьох піків пояснюється тим, що речовина є сумішшю полігідроксітритерпенових глікозидів, етерифікованих різними карбоновими кислотами.

Аналогічні результати спостерігались і при дослідженні методом ВЕРХ водорозчинної солі есцину - L-лізину есцинату.

Аналіз есцину показав, що склад -есцину від серії до серії змінюється в незначній мірі: від 76,35% до 79,29% і у середньому складає 77,39%.

На основі відносного стандартного відхилення результатів () проведена більш глибока оцінка коливання складу речовини есцин (табл. 3).

Таблиця 3 - Результати статистичної обробки хроматограм есцину різних серій

Результати обліку показали, що для характерних -есцину піків відносні стандартні відхилення результатів знаходяться в інтервалі 3,4-11,6%. Для суми піків 5,6,7,8 ця величина становить 2,85%, тоді як для інших піків ці показники коливаються в інтервалі 20,2 - 626%.

Розробка методів аналізу препаратів на основі амінокислот.

Препарати на основі амінокислот, для яких нами були розроблені методи аналізу, можна розділити на 3 групи:

Препарати, діючими речовинами яких є нові біологічно активні сполуки.

Препарати, діючими речовинами яких є індивідуальні амінокислоти і їх суміші.

Препарати, діючими речовинами яких є суміші амінокислот з іншими біологічно активними сполуками.

Аналіз препаратів, які відносяться до першої групи, проводився з використанням методів ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопії.

Розроблений метод ТШХ дозволив проконтролювати із однієї хроматограми такі показники якості препаратів на основі байкаліну, як “Ідентичність” і “Сторонні домішки“. Хроматографування проводилось на пластинках Силуфол УФ-366 із використанням хроматографічної системи спирт н-бутиловий-кислота оцтова-вода (2:1:1). Достовірність одержаних результатів була підтверджена методом ВЕРХ на колонці, заповненій сорбентом С18, з рухомою фазою метанол - оцтова кислота - вода і зміною складу метанолу від 50 до 70% об. Як показали наступні дослідження, розроблена методика ВЕРХ може використовуватись і для контролю препаратів за показником “Кількісний склад”. Підтвердженням цьому є співвідношення результатів, одержаних під час використання метода ВЕРХ і метода УФ-спектроскопії, які свідчать про рівнозначність обох методів.

Аналіз препаратів, умовно віднесених до другої групи, проводився з використанням метода ВЕРХ. Однією з основних проблем при розділенні амінокислот цим методом є велика різниця в їх полярності і низькі коефіцієнти поглинання в УФ-області спектру. Тому на практиці їх обробляють модифіційними реагентами. Це дозволяє отримувати гідрофобні похідні амінокислот, які, по-перше, значно легше розділити методом зворотньо-фазової хроматографії і, по-друге, отримати сполуки, які мають більш вищій коефіцієнт екстинкції, що дозволяє проводити аналіз у більш довгохвильових областях спектру.

Кінетика реакції утворення 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот.

Порівняння різних модифікаторів амінокислот показало, що для серійного аналізу амінокислотних препаратів найбільш вдало використовувати 2,4-дінітро-1-фторбензол. Однак одним із основних недоліків цього реагенту є тривалість проходження реакції дериватизації. Одержання ДНФ-похідних амінокислот займало 14 год.

Тому для оптимізації одержання ДНФ-похідних амінокислот нами були проведені дослідження з кінетики утворення похідних амінокислот. Дослідження проводились на основі L-триптофану.

Схема реакції утворення ДНФ-похідної триптофану представлена на рис. 3.

Рис. 3. Схема реакції утворення 2,4-дінітрофенілтриптофану

При дослідженні кінетики реакції дериватизації, проведеної при кімнатній температурі, були одержані результати, співставленні з приведеними в літературі. Для збільшення швидкості реакції її проводили при температурі 40 0С. Це сприяло досягненню скорочення часу реакції до 20 хвилин.

На основі проведеного експерименту була запропонована загальна методика отримання 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот.

Ця методика була використана при розробці НТД на препарати “Октамін плюс”, який містить 8 амінокислот і “Поліамін-У”, який містить 13 амінокислот.

Метрологічні характеристики, які характеризують запропоновану методику, були розглянуті на прикладі найменш подільної пари амінокислот ізолейцину і лейцину (табл. 4).

Таблиця 4 - Метрологічні характеристики, розраховані для амінокислот ізолейцину та лейцину

Хроматограма, одержана при розділенні 13 амінокислот препарату “Поліамін-У”.

При порівнянні часу утримання 2,4-ДНФ-похідних амінокислот, представлених у табл. 5, було помічено, що час утримання похідних амінокислот зростає із збільшенням ланцюжка амінокислот.

Таблиця 5 - Час утримання ДНФ-похідних амінокислот

Треба зазначити, що з ряду дещо випадають лізин і метіонин, можливо це пов`язано з наявністю в їх ланцюжку додаткового атому азоту (лізин) і сірки (метіонин).

Дещо іншу картину представляють багатокомпонентні амінокислотні препарати, які умовно відносяться до третьої групи препаратів і, як вже говорилось, є сумішшю амінокислот і іншіх активних речовин. Якщо контроль активних речовин у препараті Таблетки Аспалінат вдалося провести з використанням методів УФ-спектроскопії (L-лізину байкалінат, по байкаліну), неводного титрування (калій аспарагінат, іони калію) і комплексометричного титрування (магній аспарагінат, іони магнію), то контроль активних речовин препаратів Байкамін і Факовіт без використання методу ВЕРХ неможливий.

Визначення складу препарату Факовіт, один різновид таблеток якого містить гліцин, глутамінову кислоту і піридоксин, а другий - цистеїн і аскорбінову кислоту, проводили при довжині хвилі 210 нм на рідинному хроматографі Міліхром. Вибір довжини хвилі 210 нм обгрунтовано тим, що амінокислоти мають значне поглинання в інтервалі 200-220 нм. і це дає можливість отримувати необхідні результати без використання дериватизаційного реагенту, реакція якого з іншими компонентами препаратів маловивчена і тому важко контрольована.

Активні речовини, які входять до складу препарату, завдяки своїм фізико-хімічним властивостям, мають достатньо різний час утримання. Це дозволило провести розділення цих речовин в ізократичному режимі з використанням колонки, заповненої сорбентом С8.

Розділення активних речовин препарату “Байкамін” у ізократичному режимі проводилось на рідинному хроматографі фірми Waters, на заповненій сорбентом С18 колонці, при довжині хвилі 210 нм. Результати хроматографування представлені у вигляді хроматограми на рис.8.

Висновки

Вивчені фізико-хімічні властивості і встановлена будова та склад нових сполук у ряду похідних амінокислот, які мають широкий спектр біологічної дії:

4-,-дiамiнокапронової кислоти-5,6,7-триоксифлавон-7-0--0-глюкуронiдат (L-лізину байкалінат);

4--амiно--iмiдазолiлпропiонової кислоти-5,6,7-триокси-флавон-7-0 --0 - глюкуронiдат (L-гістидину байкалінат);

4-, -дiамiнокапронової кислоти-28-(3-ацетокси-2-метилбутират)-есцигенiн, -4-0--0-глюкопiронозин) - глюкуронiдат (L-лізину есцинат);

Суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів.

Вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчений якісний i кiлькiсний склад флавонових глюкуронiдiв надземної частини шоломниці байкальської та їх хроматографічна поведінка. Показано, що основними сполуками суміші є скутелярін-7-О--D-глюкуронід (25,8%), апігенін-7-О--D-глюкуронід (17,2%) і хрізин-7-О--D-глюкуронід (36,9%). Встановлено, що iз збiльшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронiдiв, час утримання речовин зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдроксигруп менший час утримання мають ті флавонові глюкуронiди, у яких гідрокси- група знаходиться у В-колiфлавону.

Показано, що тритерпеновий глікозид есцин є комплексом із 14 сполук, які представляють собою поліоксітритерпенові глікозиди, етеріфіковані різноманітними карбоновими кислотами, до того ж так званому “-есцину” належать 4 піка. Встановлено, що місткість “-есцину” в різних серіях субстанції залишається практично постійною і становить 77,39%, тоді як місткість інших компонентів коливається в широких межах.

Вивчена кінетика реакції утворення 2,4-дiнiтрофенiлпохiдних амінокислот. З метою оптимізації реакції одержання ДНФ-похідних запропоновано проводити її при температурі 400С, що дозволило скоротити час реакції в 40 раз. Вивчена також хроматографічна поведінка тринадцяти 2,4-дінiтро-фенiлпохiдних амінокислот та показано, що час утримання їх зростає із збільшенням вуглеводневого ланцюжка.

Вибрано оптимальні умови хроматографічного розділення та розроблені хроматографічні методики (методи ТШХ і ВЕРХ) контролю якості нових біологічно активних сполук.

Розроблена методика кiлькiсного визначення 2,4-дінiтрофенiлпохiдних амінокислот, яка придатна для аналізу лікарських препаратів, що представляють собою суміші індивідуальних амінокислот. Розроблені також методики контролю якості препаратів, що представляють собою суміш амінокислот з лікарськими препаратами різних класів органічних сполук.

Проведена обробка метрологічних характеристик запропонованих методик кiлькiсного визначення діючих речовин у препаратах.

Всі розроблені методики аналізу запроваджені в нормативно-технічну документацію на лікарські препарати:

ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат; проект ТФС 42У- . L-гістидину байкалінат; ТФС 42У-11/37-160-95. L-лізину есцинат; проект ТФС 42У. Розчин L-лізину байкалінату 20% для ін`єкцій; проект ТФС 42У-. Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою; ТФС 42У-11/37-1085-99. Розчин L-лізину есцинату 0,1% для ін`єкцій; проект ТФС 42У. Таблетки “Сперм-Амін”; проект ТФС 42У-. Капсули “Октамін плюс”; проект ТФС 42У- . Поліамін-У; ТФС 42У-15/37-253-96. Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У. Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У-. Таблетки “Факовіт”.

Література

Применение метода ВЭЖХ для определения аминокислотного состава препарата Октамин плюс / Шовковый А.В, Зинченко А.А., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. - 1998. - № 6. - С. 54-57.

К выбору методов определения нового биологически активного соединения - L-лизина байкалината - в субстанции и некоторых лекарственных формах / Шовковый А.В., Черныш Л.Я., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. - 1999. - № 2.- С. 32-35.

Использование метода ВЭЖХ для анализа флавоновых глюкуронидов в надземной части шлемника байкальского / Шовковый А.В., Шеин А.Т., Попова Т.П. и др. // Провизор. - 1999. - № 10. - С. 36-38.

Шовковый А.В., Шеин А.Т. Исследование состава биологически активного природного вещества эсцин. // Провизор. - 1999. - № 12. - С. 42-43.

Шовковий А.В., Лапкіна Ю.І., Ковальов І.П. Кількісне визначення L-лізину есцинату у субстанції та ін`єкційній лікарській формі // Фармацевтичний журнал. - 1999. - № 4. - С. 74-77.

Анализ препаратов на основе аминокислот и флавоноидов / Лапкина Ю.И., Черныш Л.Я. // Научные достижения и проблемы производства лекарственных средств: Тез. докл. респ. научно-практич. конф. Харьков, 1995. - С. 262-264.

Високоефективна рідинна хроматографія амінокислот / Шовковий А.В., Зінченко О.А., Шеін А.Т., Ковальов І.П. // Всеукр. конф. з аналітичної хімії: Тез. доп. - Ужгород, 1998. - С. 64.

Шовковый А.В. Применение метода ВЭЖХ в анализе комбинированного препарата “Таблетки Байкамин” // Фармация ХХI века: инновации и традиции: Тез. докл. научно-практич. конф. - С.-Петербург, 1999. - С. 115.

Размещено на Allbest.ru