Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

1. Понятие об эфирных маслах, классификация

2. Анализ эфирных масел и сырья, содержащего эфирные масла

2.1 Качественное определение эфирного масла в лекарственном растительном сырье

2.2 Исследование и стандартизация эфирных масел

2.2.1 Определение органолептических свойств

2.2.2 Определение физических констант

2.2.3 Определение химических констант

2.2.4 Определение посторонних примесей

2.3 Количественное определение эфирных масел в лекарственном растительном сырье

2.4 Анализ эфирного масла физико-химическими методами

Список литературы

1. Понятие об эфирных маслах, классификация

Эфирные масла - Olea aetherea - летучие жидкие смеси органических веществ, разнообразных по структуре, относящихся к различным классам соединений, преимущественно к терпеноидам, реже - к ароматическим и алифатическим.

Название "эфирные масла" было применено в конце XVII в., когда химический состав масел был неизвестен. Эфирными их называли потому, что они летучи, а маслами потому, что жирны на ощупь. Конечно, позднее было установлено, что в химическом отношении эфирные и жирные масла не имеют ничего общего. Жиры и жирные масла представляют собой сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и высокомолекулярных жирных кислот: олеиновой, пальмитиновой и стеариновой. В составе же эфирных масел глицерин отсутствует. Термин эфирные масла сохранился сих пор во всех странах.

На Земле существует около 3000 растений, из которых можно добывать эфирные масла. К эфирномасличным растениям относятся высшие растения, грибы, мхи, лишайники, водоросли. В современном представлении эфирные масла - летучие жидкие смеси органических веществ, вырабатываемые растениями и обусловливающие их запах.

Терпены это ненасыщенные углеводороды с числом углеродных атомов кратным пяти. Название "терпен" происходит от слова терпентин - скипидар, который представляет собой эфирное масло хвойных. Терпены можно рассматривать как производные основной разветвленной единицы - изопрена. Разветвленный конец молекулы называют "головой", а неразветвленный - "хвостом".



изопрен

Кислородсодержащие производные терпенов называют терпеноидами. Установлено, что в молекуле терпеноидов число атомов углерода и водорода кратно С ₅Н ₈, т.е. молекуле изопрена, связанных, как правило, голова к хвосту.

В зависимости от количества входящих в соединение углеродных атомов и частиц изопрена, терпеноиды классифицируются на следующие группы:

1. Изопрены или полутерпены (полутерпеноиды) (С ₅Н ₈);

2. Монотерпены или терпены (терпеноиды) (С ₁₀Н ₁₆);

3. Сесквитерпены (С ₁₅Н ₂₄) или полуторные терпеноиды;

4. Дитерпеноиды(С ₂₀Н ₃₂) - витамины группы К, хлорофилл;

5. Тритерпеноиды (С ₃₀Н ₄₈)- сапонины;

6. Тетратерпеноиды (С ₄₀Н ₆₄) входят в состав каратиноидов;

7. Политерпеноиды [(С ₁₀Н ₁₆)n]- каучук, гуттаперча.

Монотерпеноиды и сесквитерпены входят в состав летучих эфирных масел. Кроме этого довольно обычны "ароматические терпеноиды".

Классификация:

В зависимости от количества изопреновых звеньев

терпены делятся на:

1) полутерпены С ₅Н ₈;

2) монотерпены С ₁₀Н ₁₆;

3) сесквитерпены С ₁₅Н ₂₄.

Полутерпены, в основном, представлены кислотами и альдегидами:

изовалериановая кислота

Кислоты обычно входят в состав сложных эфиров, т.е. связаны с различными спиртами, например борнилизовалерианат - в эфирном масле валерианы.

Алифатические монотерпены входят в состав эфирных масел растений - роза, герань, цитрусовые, кориандр, лаванда.

Моноциклические монотерпены: ментол, его кетон - ментон (листья мяты перечной), цинеол (листья эвкалипта, шалфея), карвон (плоды тмин), лимонен (плоды лимона).

Бициклические монотерпены: камфара (камфорный лавр, камфорный базилик, виды полыни), борнеол (пихта), пинен (скипидар, сосна), туйон и туйол (трава полыни горькой, цветы пижма обыкновенной), сабинен (плоды можжевельника обыкновенного).

Сесквитерпены:

Ациклические сесквитерпены - фарнезен, фарнезол (в цветках липы):

Моноциклические сесквитерпены - бисаболен (в цветках ромашки аптечной, липы):

Бициклические сесквитерпены: тип кадинена - кадинен, тип селинена - б-селинен, в-селинен (корневища аира болотного), тип азулена - азулен (цветки ромашки аптечной, цветки тысячелистника обыкновенного), гвайазулен (цветки ромашки аптечной):



К типу селинена относятся сантонин (полынь обыкновенная) и тауремизин (полынь таврическая):

Ароматические соединения:

Тимол (трава чабреца, трава тимьяна), анетол (плоды аниса, плоды фенхеля), эвгенол (бутоны гвоздичного дерева, листья эвгенольной камелии).

Физико-химические свойства

Эфирные масла представляют собой прозрачные, бесцветные, реже различно окрашенные жидкости (например, коричное эфирное масло - темно-коричневое; тимианное - красноватое; эфирное масло тысячелистника и ромашки - ярко-синее; аира - желтоватое). Они обладают специфическим запахом и вкусом. Большинство эфирных масел легче воды, и лишь некоторые из них (эфирное масло гвоздики, корицы) имеют плотность более единицы. Под влиянием кислорода воздуха и света многие эфирные масла изменяются, постепенно окисляясь, меняют цвет (темнеют) и запах. Некоторые эфирные масла загустевают после отгонки или при хранении. Эфирные масла мало, очень мало или практически нерастворимы в воде, но при взбалтывании с водой придают ей запах и вкус. Они растворимы в жирных и минеральных маслах, спирте, эфире и других органических растворителях. Температура кипения эфирных масел колеблется от 140 до 260 °С; они оптически активны, имеют определенную температуру застывания и коэффициент рефракции. Реакция масел нейтральная или кислая, в зависимости от их состава.

2. Анализ эфирных масел и сырья содержащего эфирные масла

Эфирные масла, которые используют в медицинской практике, должны быть стандартизованы, т.е. должны отвечать требованиям НД. Общая статья "Olea aetherea" ГФ XI изд., вып. 1, стр. 287 регламентирует приемы и порядок выполнения анализа. Частные статьи на конкретные эфирные масла включены в ГФ Х изд. и в ГФ IX изд. Анализ эфирных масел предусматривает установление их подлинности и доброкачественности, обнаружения продуктов окисления и загрязнения масла (наличия примесей-фальсификаторов) и иных веществ (жиры, вазелин, спирт, органические кислоты), а также определение количества основных компонентов эфирного масла (фенолы, спирты, сложные эфиры, кислоты, лактоны), обуславливающие его фармакологическое действие.

Анализ эфирных масел
Определение органолептических свойств	Определение содержания посторонних примесей	Определение числовых показателей
цвет; прозрачность; запах; вкус	спирта;жирных и минеральных масел; воды	Физические константы: температура затвердевания; плотность; рефракция; угол вращения плоскости поляризации. Химические константы: кислотное число; эфирное число; эфирное число после ацетилирования

2.1 Качественное определение эфирного масла в лекарственном растительном сырье

В растениях эфирные масла локализуются в различных железках, вместилищах или специализированных клетках. Их можно видеть в микропрепаратах (поверхностных и поперечных срезах): они имеют вид капель, сильно преломляющих свет. Для окрашивания эфирных масел используют реактивы: судан III, шарлаховый красный и др.

Для обнаружения азуленов, находящихся в растительном сырье в виде бесцветных предшественников - проазуленов, используют реакции, основанные на способности этих соединений переходить в окрашенные соединения под действием сильных кислот. Отдельные компоненты эфирных масел идентифицируют с использованием различных методов хроматографии. эфирный терпен органолептика примесь

Результаты реакции наблюдают в микроскоп.

Препарат трубчатого цветка ромашки "аптечной" помещают в концентрированную фосфорную или серную кислоту и после слабого нагревания через 1-2 мин под микроскопом наблюдают окрашивание железок в синий цвет.

Сырье помещают в пробирку, добавляют 3-5 мл реактива ЕР и кратковременно нагревают на кипящей водяной бане. В присутствии прохамазулена или азуленов в цветках ромашки примерно через 30с появляется синее или сине-зеленое окрашивание раствора.

Другие компоненты ромашки дают продукты реакции, окрашенные в желтый, коричневый или красно-фиолетовый цвет, но они проявляются, как правило, лишь при отсутствии или низком содержании азуленов. Наличие азуленовых производных в цветках и траве тысячелистника обнаруживается по появлению синего окрашивания.

Состав реактива ЕР (по Шталю):

n - диметиламинобензальдегид - 0,25 г;

о - фосфорная кислота (конц.) - 5 г;

ледяная уксусная кислота - 45 г;

вода дистиллированная - 50 г;

2.2 Исследование и стандартизация эфирных масел

Наиболее надежные нормативы, которым должны соответствовать эфирные масла, являются стандарты ISO (Международная организация стандартов), стандарты ЕОЛ (Американская ассоциация эфирных масел), нормативы Государственной Фармакопеи Великобритании и Государственной Фармакопеи России, рекомендации по ограничению и запрещению применения некоторых масел, предложенные IFRA (Международная ароматическая ассоциация).

Для эфирных масел устанавливают подлинность и доброкачественность, основываясь на их физико-химических свойствах. С этой целью сначала проверяют органолептические показатели (цвет, запах, вкус), а затем физические и химические константы.

К физическим константам относится:

- плотность,

- угол вращения,

- показатель преломления,

- растворимость в этаноле.

Из химических констант основными являются

- кислотное число (КЧ),

- эфирное число (ЭЧ),

- эфирное число после ацетилирования (ЭЧ п.а.).

Данные показатели сравниваются с пределами указанными в ГФ XI изд. (ФС или ВФС) или ГОСТе.

2.2.1 Определение органолептических свойств

Органолептические показатели - это цвет, вкус и запах.

Цвет (и прозрачность) устанавливают, поместив 10 мл эфирного масла в цилиндр из прозрачного бесцветного стекла диаметром 2--3 cм, наблюдая в проходящем свете.

Запах определяют следующим образом: 0,1 мл (2 капли) эфирного масла наносят на полоску фильтровальной бумаги длиной около 12 см шириной 5 см так, чтобы масло не смачивало края бумаги, и сравнивают запах испытуемого образца через каждые 15 мин с запахом контрольного образца, нанесенного таким же образом на фильтровальную бумагу. В течение 1 ч запах должен быть одинаков с запахом контрольного образца.

Вкус устанавливают, прикладывая к языку полоску фильтровальной бумаги с нанесенной на нее каплей масла или смеси 1 г сахарной пудры с 1 каплей испытуемого масла.

2.2.2 Определение физических констант

Физические константы - это растворимость, температура затвердевания, плотность, показатель преломления, угол вращения плоскости поляризации.

Растворимость определяют в мерном цилиндре, в который наливают 1 мл масла и постепенно по 0.1 мл из бюретки приливают растворитель, указанный в частной нормативной документации. Тщательно взбалтывают. Отмечают полное растворение эфирного масла. Определение ведут при 20 °С.

Температуру затвердевания (кристаллизации) определяют в приборе Жукова.

Прибор Жукова представляет собой стеклянный плоскодонный двустенный сосуд или сосуд Дьюара с вакуумом между наружной и внутренней стенками.

Анализируемый продукт, нагретый на 10-20 С выше предполагаемой температуры плавления, наливают на 3Д высоты в подогретый прибор Жукова. В отверстие прибора вставляют термометр, укрепленный на плотно пригнанной пробке так, чтобы ртутный шарик находился в середине слоя испытуемого продукта. Когда температура будет на 3-4 С выше предполагаемой температуры застывания, начинают регистрацию температуры через каждые 30 с. Ход определения температуры затвердевания не отличается от описанного выше. Разреженный воздух между двойными стенками сосуда является плохим проводником тепла, поэтому расплавленный продукт охлаждается медленно и равномерно, что обеспечивает точность определения.

Определение плотности эфирного масла

Определение плотности эфирного масла

1. Взвесьте сухой и чистый пикнометр с точностью 0,0002 г.

2. Заполните дистиллированной водой немного выше метки, закройте пробкой и выдержите в термостате при 20°С в течение 20 минут.

3. Доведите уровень воды до метки (с помощью свернутой в трубку

фильтровальной бумаги) и выдержите в термостате еще 10 мин.

4. Взвесьте пикнометр на аналитических весах с той же точностью

(предварительно вытрите его и подержите под стеклом аналитических

весов 10 минут).

5. Освободите пикнометр от воды, высушите (для этого пикнометр

промойте сначала спиртом, а затем эфиром), заполните исследуемой

жидкостью и проведите те же операции, что и с дистиллированной

водой.

6. Плотность рассчитайте по формуле:

m - масса пикнометра пустого,

m1 - масса пикнометра с дистиллированной водой,

m2 - масса пикнометра c эфирным маслом,

0,99703- плотность воды при 20°С,

0,0012-плотность воздуха при 20°С и атмосферном давлении 760 мм рт ст.

Показатель преломления - рефрактометром. Показателем преломления называют отношение скорости распространения света в вакууме к скорости распространения света в испытуемом веществе. Это абсолютный показатель преломления. На практике определяют так называемый относительный показатель преломления, т.е. отношение скорости распространения света в воздухе к скорости распространения света в испытуемом веществе. Показатель преломления зависит от температуры и длины волны света, при которой проводят определение. Рефрактометры тестируют по эталонным жидкостям, прилагаемым к приборам, или дистиллированной воде для которой n²⁰ _д = 1,3330.

Угол вращения плоскости поляризации определяют в поляриметре. Это величина отклонения плоскости поляризации от начального положения. Оптическое вращение - это способность вещества вращать плоскость поляризации при прохождении через него поляризованного света. В зависимости от природы оптически активного вещества вращение плоскости поляризации может иметь различное направление и величину. Если от наблюдателя, к которому направлен свет, проходящий через оптически активное вещество, плоскость поляризации вращается по часовой стрелке, то вещество называют правовращающим и перед его названием ставят знак "+", если же плоскость поляризации вращается против часовой стрелки, то вещество называют левовращающим и перед его названием ставят знак "-".

2.2.3Определение химических констант

Химические константы - это кислотное число, эфирное число, эфирное число после ацетилирования.

Кислотное число (к.ч.) - это количество мг едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных кислот, содержащихся в 1 г эфирного масла. Определяют методом алколиметрического прямого титрования.

изовалериановая кислота

Кислотное число (КЧ) вычисляют по формуле:

,

где V - объем (мл) раствора щелочи, использованного на титрование

m - навеска (грамм) эфирного масла.

Эфирное число (э.ч.) - это количество мг едкого кали, пошедшее на омыление сложных эфиров, содержащихся в 1 г эфирного масла. Определяют методом обратного ацидиметрического титрования.

геранилацетат избыток гераниол ацетат калия

(масло кориандра)

2 KOH + H₂SO₄ K₂SO₄ + 2 H₂O

Индикатор - фенолфталеин.

Эфирное число Х вычисляют по формуле:

где V - объем 0,5 н. КОН, пошедший на омыление эфиров, мл,

т - масса навески масла, г,

28,05 - масса КОН, мг, содержащегося в 1 мл его 0,5 н. спиртового раствора.

Эфирное число после ацетилирования обозначает массу гидрооксида калия, необходимого для омыления суммы сложных эфиров, содержащихся первоначально в 1г масла и образовавшихся при ацетилировании.

Например, в мятном масле более 4% сложных эфиров ментола с уксусной и валериановой кислотами и свыше 46% свободного ментола.

Уксусную кислоту отмывают водой. Далее в ацетилированном масле определяют эфирное число.

2 КОН + Н ₂SO₄ ----> К ₂SO₄ + 2 Н ₂O

Э.ч.п.а. - э.ч. = свободные спирты.

Процентное содержание сложных эфиров или связанных спиртов X₁ вычисляют по формуле:

,

где M - молекулярная масса эфира или спирта.

Содержание свободных спиртов Х ₂ (процентное содержание) находят по формуле:

где: ДЭ - разность между эфирным числом после ацетилирования и эфирным числом.

Общее содержание спиртов X₃ выражают суммой связанных и свободных спиртов: X₃=X₁+Х ₂

2.2.4 Определение посторонних примесей в эфирном масле

Примеси в эфирном масле различают посторонние (подмеси) и собственные - продукты окисления эфирного масла.

Примесь спирта, жирного масла и воды определяют специальными пробами.

Примесь терпентинного масла, воска, продуктов окисления и др. можно определить только по изменению органолептических и числовых показателей.

Проба на присутствие спирта (этанол)

1) 1-2 капли эфирного масла наносят на воду на часовом стекле. Наблюдают на черном фоне. Не должно быть заметного помутнения вокруг масла.

2) 1 мл масла в пробирке нагревают до кипения. Пробирка должна быть заткнута ватой с кристаллом фуксина. Пары спирта растворяют фуксин. Не должно быть фиолетово-розового окрашивания ваты.

- на жирные и минеральные масла - 1 мл эфирного масла взбалтывают в пробирке с 10 мл спирта; не должно быть помутнения и капель жирного масла.

- вода - определяют методом дистилляции.

- примесь восков, вазелина, жирных масел, высокомолекулярных терпенов, спирта снижает показатель преломления, угол вращения плоскости поляризации, плотность эфирного масла. При растворении в спирте (этаноле) углеводороды всплывут наверх, а жирное масло каплями опустится на дно.

- продукты окисления компонентов эфирного масла легче растворяются в спирте 70-96%, они увеличивают показатель плотности, показатель преломления, увеличивают кислотное число и уменьшают эфирное число и эфирное число после ацетилирования.

- Окисление анетола в эфирном масле аниса и фенхеля до анисового альдегида и анисовой кислоты приводит к резкому снижению температуры затвердевания (анисовое масло не менее 15°С, фенхелевое масло - не менее 3°С).

- Продукты окисления эфирного масла изменяют органолептические показатели. Основные компоненты эфирного масла - это кислоты, сложные эфиры, спирты, фенолы и отдельные компоненты (цитраль, цинеол). Их количество находится в определенных пределах.

- О содержании кислот, эфиров и спиртов судят по химическим константам.

- Содержание фенолов (ГФ--Х 1, общая статья) определяют в объемных процентах по убыли объема эфирного масла, взятого для исследования после отделения от него фенолов (в форме растворимых в воде фенолятов при встряхивании эфирного масла с 5%-ным раствором NаОН).

Процентное содержание фенолов X₄ вычисляют по формуле:

где V - объем масла, не прореагировавшего с раствором NaOH, мл (температура масла при внесении в колбу и при отсчете должна быть одинакова).

Отдельные компоненты эфирных масел определяют по методикам частной нормативной документации на каждое конкретное эфирное масло.

Например, содержание альдегидов в лимонном масле (ГФ-Х 1, ст.342) определяют методом обратного титрования. Метод основан на способности цитраля реагировать с гипохлоридом гидроксиламина с образованием оксима, при этом отщепляется хлористый водород в количествах, эквивалентных цитралю:

+ МНОН-

Выделившийся хлористый водород титруют 0.5н спиртовым раствора гидроксида калия.

НС 1 + КОН -------> КСl + Н ₂O

2.2.5 Количественное определение эфирных масел в лекарственном растительном сырье

Рис. 1. Прибор для определения эфирного масла в растительном сырье методом 1. А-колба; Б-резиновая пробка; В-холодильник; Г-градуированный приемник.

Метод 1. Для определения эфирного масла используют прибор, изображенный на рис.1. Навеску измельченного сырья помещают в широкогорлую круглодонную или плоскодонную колбу А вместимостью 1000 мл, приливают 300 мл воды и закрывают резиновой пробкой Б с обратным шариковым холодильником В. В пробке снизу укрепляют металлические крючки, на которые при помощи тонкой проволоки подвешивают градуированный приемник Г так, чтобы конец холодильника находился над воронкообразным расширением приемника, не касаясь его. Приемник должен свободно помещаться в горле колбы, не касаясь стенок, и отстоять от уровня воды не менее чем на 50 мм. Цена деления градуированной части приемника 0,025 мл. Колбу с содержимым нагревают и кипятят в течение времени, указанного в соответствующей нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Объем масла в градуированной части приемника замеряют после окончания перегонки и охлаждения прибора до комнатной температуры. После 6--8 определений холодильник и градуированный приемник необходимо промыть последовательно ацетоном и водой. Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где V - объем эфирного масла в миллилитрах; m - масса сырья в граммах;W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Метод 2. Для определения эфирного масла используют прибор, изображенный на рис. 2. Прибор для определения эфирного масла состоит из круглодонной колбы А вместимостью 1000 мл, паропроводной изогнутой трубки Б, холодильника В, градуированной трубки приемника Г, оканчивающейся внизу спускным краном Д и сливной трубкой Е. В верхней части приемника имеется расширение Ж с боковой трубкой З, которая служит для внесения растворителя эфирного масла в дистиллят и сообщения внутренней части прибора с атмосферой. Колба и паропроводная трубка соединяются через нормальный шлиф. Градуированная трубка имеет цену деления 0,02 мл. Для заполнения прибора водой используется резиновая трубка И с внутренним диаметром 4,5--5 мм, длиной 450 мм и воронка К диаметром 30--40 мм. Перед каждым определением через прибор пропускают пар в течение 15--20 мин. После 6--8 определений прибор необходимо промыть последовательно ацетоном и водой.



Рис. 2. Прибор для определения содержания эфирного масла методом 2 и 3. А-круглодонная колба; Б-паропроводная изогнутая трубка; В-холодильник; Г-градуированная трубка; Д-спускной кран; Е-сливная трубка; Ж-расширение; З-боковая трубка; И-резиновая трубка; К-воронка.

Навеску измельченного сырья помещают в колбу, приливают 300 мл воды, колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой. Колбу с содержимым нагревают и кипятят с интенсивностью, при которой скорость стекания дистиллята составляет 60--65 капель в 1 мин в течение времени, указанного в соответствующей нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Через 5 мин после окончания перегонки открывают кран, постепенно спуская дистиллят так, чтобы эфирное масла заняло градуированную часть трубки приемника, и еще через 5 мин замеряют объем эфирного масла. Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где V - объем эфирного масла в миллилитрах; m - масса сырья в граммах;W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Метод 3. Для определения эфирного масла методом 3 используют прибор, изображенный на рис. 2. Навеску измельченного сырья помещают в колбу, приливают 300 мл воды, колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой. Затем через боковую трубку при помощи пипетки вливают в приемник около 0,5 мл декалина и точно замеряют его объем, опуская для этого уровень жидкости в градуированную часть трубки. Далее поступают, как описано в методе 2.

Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

;

где V-- объем раствора масла в декалине в миллилитрах; V₁ - объем декалина в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Метод 4. Для определения эфирного масла методом 4 используют прибор, изображенный на рис. 3.

Прибор состоит из круглодонной колбы с коротким горлом А вместимостью 1000 мл, паропроводной трубки Б, холодильника В, отстойника Г с термометром до 100°С Д, ртутный шарик которого находится на уровне отверстия холодильника, градуированной трубки Е с ценой деления 0,001 мл, спускного крана Ж и сливной трубки З. Для заполнения прибора водой используется резиновая трубка И с внутренним диаметром 4,5--5 мм, длиной 450 мм и воронка К диаметром 30--40 мм. Перед каждым определением через прибор пропускают пар в течение 15--20 мин. После 6--8 определений прибор последовательно промывают ацетоном и водой.



Рис. 3. Прибор для определения содержания эфирного масла методом 4. А-круглодонная колба с коротким горлом, Б-паропроводная трубка, В-холодильник, Г-отстойник, Д-термометр, Е-градуированная трубка, Ж-спускной кран, З-сливная трубка, И-резиновая трубка, К-воронка.

Навеску измельченного сырья помещают в колбу, прибавляют необходимое количество воды. Колбу соединяют с паропроводной трубкой и заполняют водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой, до тех пор, пока в нижней воронкообразной части отстойника не наберется слой воды высотой 8--12 мм. Во время перегонки этот уровень воды должен оставаться без изменения. Колбу с содержимым нагревают и кипятят в течение времени, указанного в нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Во время перегонки температура в отстойнике не должна превышать 25°С. Через 5 мин после окончания перегонки открывают кран, постепенно спуская дистиллят так, чтобы эфирное масло заняло градуированную часть трубки. Еще через 5 мин замеряют объем эфирного масла. Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

;

где V - объем эфирного масла в миллилитрах,

m - масса сырья в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах

2.2.6 Анализ эфирного масла физико-химическими методами

Если анализ эфирного масла ведут в научных целях, то сумму компонентов эфирного масла исследуют подробно. Для этого проводят разделение масла на группы соединений. Например, с помощью вакуумной разгонки при различных интервалах температур. Чаще используют метод (А.Либерти и Д.Карони) сочетающий химическое разделение масла на фракции (кислоты, фенолы, моносесквитерпеноиды и их кислородсодержащие производные) с последующа физико-химическим анализом этих фракций. Преимущество метода в том, что он менее трудоемок и масло не подвергается излишнему термическому воздействию.

Фракции эфирных масел исследуют с помощью различных хроматографических и спектрометрических методов, в том числе электронная спектроскопия, ИК-спектроскопия и ЯМР-спектроскопия.

Хроматографический анализ эфирных масел

Хроматография - эффективный аналитический способ разделения компонентов эфирных масел и установления в них количественных отношений. Является наиболее информативным при исследовании и установлении качества эфирных масел.

Для проведения хроматографии с помощью микрошприца отбирают небольшой объем (0.04-0.06 мкл) эфирного масла и вводят при температуре 230-250⁰С в испаритель хроматографа. После испарения пары эфирного масла поступают в виде смеси с газом-носителем в узкую кварцевую капиллярную трубку длиной 30 метров и внутренним диаметром 0.25 мм. Под действием постоянно протекающего через эту трубку газа-носителя (обычно гелий, водород или азот) эфирное масло в виде пара движется по трубке. Одновременно, для улучшения фазовых и гидродинамических условий движения пробы температуру кварцевой трубки повышают от 50⁰С до 220⁰С со скоростью 3-4 градуса/мин.

Внутренняя поверхность трубки (которая называется колонка) покрыта очень тонким слоем (0.2-0.5 микрон) нейтральной жидкости полимерной природы ("жидкая фаза", имеющая свое коммерческое название, например, SE-30 или Carbowax 20M, отражающее хроматографические свойства фазы). Такая хроматография называется газо-жидкостной, так как разделение анализируемой пробы на компоненты происходит на границе текущего через колонку газа-носителя и жидким слоем фазы (жидкости, покрывающим внутреннюю поверхность трубки).

Компоненты эфирного масла имеют различное адсорбционное сродство к жидкой фазе, из-за чего скорость продвижения вдоль колонки веществ, составляющих эфирное масло, отличается друг от друга. В результате компоненты выходят из колонки последовательно в виде "сгустков" фракций отдельных веществ. Обычное время анализа эфирного масла не более 30-40 мин. В современных хроматографических методиках отдельное вещество может выходить из колонки в течение 3-7 секунд. Таким образом, за время анализа можно обнаружить до сотни веществ. Эти вещества различными методами детектируются.

Основным методом обнаружения веществ, выходящих из колонки является ионизационно-пламенное детектирование. С этой целью выходной конец колонки вставляется в детектор, представляющий собой тонкое сопло с непрерывно горящим пламенем водорода. Поступающие из колонки в пламя вещества ионизируются под действием высокой температуры и обнаруживаются высокочувствительным амперметром по появлению этих ионов. Количество ионов пропорционально количеству вещества в пламени.

В результате проведения хроматографического анализа получают хроматограмму, то есть графическое изображение состава эфирного масла в виде пиков. Каждый пик соответствует одному веществу с определенным временем выхода. Размеры пика указывают на количество вещества в пробе. Количественные соотношения (обычно в виде процентного отношения) рассчитываются автоматически с помощью компьютера. В современных хроматографах процесс разделения всех веществ пробы проходит с высокой степенью воспроизводимости как с точки зрения времени выхода, так и процентного соотношения отдельных компонентов.

На хроматограмме лавандина, полученной разделением на колонке HP-5 (малополярная метилсиликоновая фаза), пики с временем выхода 7.64 мин и 11.08 мин соответствуют главным компонентам - линалоолу и линалилацетату, содержание которых составляет 29% и 23%. Пик 8.44 мин - камфора, содержание которой 9%, 9.21 мин - борнеол (5%).

Хроматограмма эфирного масла лавандина.

Так как время выхода различных компонентов эфирных масел отличается друг от друга, естественным способом их идентификации является использование этого времени, как постоянной для каждого вещества. Использование этого метода имеет существенное ограничение, так как время выхода сильно зависит от условий хроматографирования (главным образом, давления газа-носителя и температуры колонки) и поэтому используется очень редко в строго постоянных условиях работы хроматографической системы, с эфирными маслами, состав которых известен. Полученные результаты верны обычно только в пределах одной лаборатории и даже прибора.

Более универсальным методом использования времени как хроматографической постоянной являются индексы удерживания Ковача (Kovach's retention index). Эти индексы рассчитываются по данным времени удерживания неизвестных веществ и веществ-стандартов, для которых индексы удерживания приняты постоянными. В качестве таких стандартов выбраны нормальные алканы. Например, индекс удерживания декана (алкана с 10 атомами углерода) принят как 1000, ундекана (11 атомов углерода) - 1100 и так далее. Если теперь взять неизвестное вещество и прохроматографировать в присутствии декана и ундекана, то в случае, если это неизвестное вещество выйдет по времени между этими стандартами, то его индекс удерживания будет располагаться между 1000 и 1100. Для более точных (но упрощенных) расчетов измеряют разность времен удерживания (ДT=T₂-T₁) и разность индексов удерживания двух стандартных алканов (ДRI=RI₂-RI₁), а также время удерживания неизвестного вещества (T) и вычисляют его индекс удерживания (RI) по формуле:

RI=RI₁+ДRI/ДT_*(T-T₁)

Индекс удерживания является характеристикой определенного вещества в условиях хроматографирования на определенной жидкой фазе. Полученные индексы удерживания имеют универсальный характер и не зависят от динамических условий хроматографирования. Если говорить более точно, условия хроматографирования (температурные градиенты в процессе анализа, природа газа-носителя) слегка изменяют значение индексов удерживания. Но эти отклонения составляют не более 0.5 единиц для неполярных фаз и не более 5-8 - для полярных фаз.

Результаты хроматографического анализа представляют в виде таблицы веществ, составляющих эфирное масло с указанием индекса удерживания для каждого вещества и процентного содержания каждого компонента.

Конечно, когда разделяемые вещества имеют близкие индексы удерживания, условия хроматографирования могут привести к наложению пиков, что хорошо заметно при работе на высокоразрешающих капиллярных колонках. Тогда возникает необходимость коррекции условий анализа. Например, на неполярной фазе SE-30 (колонка HP-1) при применении газа-носителя азота происходит неполное разделение пиков пара-цимена, 1,8-цинеола и цис-в-оцимена. Использование водорода дает полное разделение этих веществ. При этом применение азота на неполярной фазе удобно для разделения триплета нерол, нераль и цитронеллол, тогда как применение водорода приводит к почти полному наложению этих пиков. Впрочем, всех этих затруднений можно избежать при анализе эфирных масел на колонке типа HP-5.

Различные режимы программирования температуры в ходе анализа также влияет на индексы удерживания. Некоторые вещества имеют "плавающие" индексы удерживания. Это происходит в случае, если проба содержит большое количество растворителя. В зависимости от величины пробы растворитель в большей или меньше степени как бы "притягивает" некоторые вещества, изменяя их индекс удерживания. Например, этилацетат в присутствии большого количества этилового спирта уменьшает свой индекс удерживания (до 10 единиц) и может совмещаться с бутанол-2 (при анализе компонентов коньячного спирта).

Применение хроматографии для распознавания фальсифицированных эфирных масел

Для решения вопроса о натуральности эфирного масла проводят его хроматографический анализ и сравнивают полученную хроматограмму с хроматограммой заведомо натурального образца эфирного масла, опубликованных в специальных изданиях (метод "fingerprint analysis") или полученной анализом заведомо аутентичного образца эфирного масла. Отдельные компоненты эфирных масел обладают оптической активностью, то есть способностью вращать плоскость поляризации луча света. Синтетические вещества, которые иногда добавляют в эфирные масла, не имеют такой активности. Хроматографические методы на специальных хиральных колонках позволяют разделить оптические изомеры и установить факт фальсификации.

Разработка конкретных методических подходов, которые можно использовать при исследовании эфирных масел на натуральность представляет большую трудность. Каждое эфирное масло можно фальсифицировать различными методами. В любом случае на первом этапе необходимо получить хроматограммы эфирного масла на капиллярных колонках. При этом наиболее рационально использовать колонки с длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25мм и слоем жидкой фазы 0.25 микрон.

Наиболее часто используют неполярную колонку с рабочей жидкой фазой на основе полиметилсилоксана (силиконовые эластомеры SE-30 или аналогичные OV-1, OV-101, DB-1, DB-5, HP-1, HP-5). Именно на этих колонках получено для эфирных масел наибольшее количество результатов (хроматограмм и индексов удерживания компонентов). Очень хорошие результаты для экспертной работы дает колонка типа HP-5 (или DB-5).

Значительно реже применяют высокополярные колонки на основе полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (Carbowax 20M, Supelcowax10, FFAP, INNOWAX). Их используют лишь как вспомогательные в случае неоднозначной идентификации пиков на колонках с неполярной фазой. Дело в том, что при использовании хромато-масс-спектрометрии не всегда удается отличить достоверно спирты и их сложные эфиры, а также сесквитерпеновые углеводороды и некоторые их кислородные производные. Применение различных колонок дает возможность по изменению индексов удерживания одних и тех же веществ при анализе определиться с точной идентификацией.

Режим анализа на обоих колонках одинаковый. Температура испарителя и детектора 230-250⁰, температура термостата программируют от 50⁰С со скоростью 3⁰/мин до 220⁰ и далее изотерма 10 минут. Газ-носитель водород или гелий - все газы с чистотой 99.999. Полярные колонки дают нестабильные результаты при работе с газами с повышенным (более 0.001%) содержанием кислорода и паров воды. Скорость расхода газа через колонку приблизительно 1 мл/мин, что соответствует входному давлению для гелия 0.75 атм. Величина пробы 0.02 - 0.06 мкл при сбросе 1/50. Такой режим позволяет выявить в составе эфирного масла все компоненты с содержанием выше 0.01%, что вполне достаточно для экспертной работы.

Относительно приборной базы можно сказать, что для работы вполне достаточны обычные хроматографы практически любой конструкции (как старые, так и новые) с пламенно-ионизационным детектором. Наиболее важным при этом является правильно сконструированная система ввода пробы - самплер (иногда ее надо переделывать в хроматографах старой конструкции) и грамотное подсоединение колонки к детектору и самплеру. Но это уже вопрос очень специальный и здесь не рассматривается.

Полученные хроматограммы дают исчерпывающую информацию о составе эфирных масел и представляют собой подробную "карту" распределения всех компонентов эфирного масла, изучение которых методом сравнения с типовыми или эталонными хроматограммами может помочь в установлении подлинности и натуральности эфирного масла. При этом особое значение для установления натуральности часто имеют компоненты, содержащиеся в очень небольшом количестве, а также сесквитерпеновые терпеноиды, состав и количество которых хорошо отражает видовую принадлежность эфирного масла.

Ниже сопоставлены две хроматограммы, полученные в результате анализа натурального (вверху) и фальсифицированного эфирного масла дистиллированного лимона.

В натуральном масле число компонентов значительно больше, содержание лимонена (пик 10.11) составляет 63%. Присутствуют сложные эфиры - нерилацетат и геранилацетат (пики 24.36 и 25.17). В области сесквитерпеновых углеводородов в натуральном эфирном масле присутствуют характерные для лимона компоненты: в-кариофиллен (пик 26.50), транс-б-бергамотен (пик 27.23) и в-бисаболен (пик 30.20).

Фальсифицированное масло содержит 93% лимонена (пик 10.13). Это значительно выше показателя, характерного для натурального лимонного масла (58-72%). Обычно для создания такого лимонного масла используют детерпенизированное лимонное масло с небольшой добавкой синтетического или природного цитраля (пики 18.98 и 20.30). Практически отсутствуют сесквитерпены и сложные эфиры - нерилацетат и геранилацетат, характерные для натурального масла. Добавлены нехарактерные для натурального лимонного масла линалоол и линалилацетат (пики 12.86 и 19.68).

Хроматограмма натурального (вверху) и фальсифицированного (внизу) эфирного масла лимона.

При установлении подлинности эфирного масла необходим здравый смысл и интуиция, а также длительный опыт работы в области хроматографирования эфирных масел различных типов, сортов и происхождения. Это позволяет различать эфирные масла при рассмотрении хроматограммы так же легко, как мы узнаем знакомого человека по его внешнему виду.

Основная проблема хроматографии - идентификация отдельных пиков, то есть расшифровка состава эфирного масла на основании данных, полученных в результате хроматографирования. Обычная хроматография с пламенным детектором имеет ограниченные возможности идентификации и ее используют для анализа эфирных масел, для которых качественный состав и последовательность выхода компонентов известна. Для экспертной работы, которая связана с выявлением неизвестных примесей в эфирных маслах, необходимо применять масс-спектрометрический детектор. Это делает возможным проводить идентификацию компонентов эфирного масла автоматически, в ходе выполнения аналитического цикла. Такие хроматографы, сочетающие обычный хроматограф (GC) и масс-спектрометрический детектор (MSD) получили название хромато-масс-спектрометра (ХМС, GCMS - gas-chromatography-mass-spectrometry). Обычная стоимость хроматографа с пламенным детектором - 10,000-50,000$ (чаще всего цена зависит от производителя), стоимость хромато-масс-спектрометра 110,000-200,000$.

При идентификации компонентов методом MS выходящие из колонки вещества не попадают в горящее пламя водорода, а направляются в вакуумную камеру, где попадает в поток электронов, имеющих стандартную энергию (70 эв). Эти электроны разбивают молекулу вещества на заряженные осколки (ионы), состав, заряд и количество которых в стандартных условиях для каждого вещества является постоянным. Графическое изображение каждого вещества после электронного удара в виде набора его фрагментов в координатах "молекулярная масса иона - количество ионов" называется масс-спектром. Информация о веществах, их структуре и соответствующих им масс-спектрах хранится в виде баз данных в компьютерах, обслуживающих работу GCMS. В процессе хроматографического разделения по мере выхода веществ из колонки происходит непрерывная их бомбардировка электронами, получение масс-спектра, сравнение его с базой данных и выдача результатов. Наибольшая по объему библиотека масс-спектров находится в базе данных NIST05 (175000 структур) и Wiley (около 300000 веществ).

Масс-хроматограмма эфирного масла, декларированного как нероли.

1 6.927 0.399% б-пинен; 2 8.259 0.239% сабинен; 3 8.361 1.275% в-пинен; 4 8.901 0.537% мирцен; 5 10.184 0.249% пара-цимен; 6 10.356 7.669% лимонен; 7 11.149 0.304% оцимен; 8 11.564 0.850% г-терпинен; 9 13.591 30.701% линалоол; 11 15.392 0.620% цис-в-терпинеол; 12 16.250 0.233% транс-в-терпинеол; 13 17.476 4.988% б-терпинеол; 14 17.742 1.464% г-терпинеол; 16 20.361 26.146% линалилацетат; 19 22.025 0.223% индол; 20 23.959 0.892% метилантранилат; 21 25.782 0.657% геранилацетат; 22 31.897 3.279% цис-неролидол; 23 33.083 4.840% транс-неролидол; 24 40.388 2.886% бензилбензоат; 25 43.968 9.213% бензилсалицилат;

Результаты GCMS представляют собой ряд предложений по идентификации в виде альтернативных формул веществ и степень сходства их масс-спектра с масс-спектром, полученным в ходе хроматографического разделения. Задача исследователя - отобрать из них наиболее приемлемый вариант. На рисунке показан масс-спектр неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин. Ниже показан рисунок масс-спектра вещества, наиболее близкого по масс-спектру с неизвестным веществом. Степень сходства составляет 92%. Таким образом, для неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин принят транс-3,7,11-триметил-1,6,10-додекатриен-3-ол, который имеет тривиальное название транс-неролидол.

Масс-спектр одного из компонентов с временем выхода 33.08 мин на хроматограмме эфирного масла нероли.

Масс-спектр и формула вещества, предложенного для компонента с временем выхода 33.08 мин.

При установлении химического состава методом хромато-масс-спектрометрии пользуются законами биогенетической взаимосвязи компонентов в эфирных маслах. Например, если в эфирном масле идентифицирован линалилацетат и не найден линалоол, то это не является правильным выбором. Аналогично, если идентифицирован нерол, а отсутствует гераниол (эти два вещества всегда присутствуют вместе), то такая идентификация сомнительна. Часто тимол сопровождает карвакрол, пара-цимен и г-терпинен, пинокамфон - изопинокамфон, ментон - изоментон. Взаимосвязи компонентов в эфирных маслах обусловлены существующими в растениях достаточно однообразными биохимическими процессами, которые связывают все компоненты эфирных масел в единый биологический цикл. Знание таких процессов позволяет избежать ошибок при идентификации.

После идентификации всех компонентов данные анализируют и сопоставляют с данными, полученными для образца натурального нероли. При этом сразу можно обратить внимание, что в составе исследованного эфирного масла нероли находятся компоненты, которые в натуральных эфирных маслах встречаются очень редко и в небольшом количестве - это в-терпинеол (цис- и транс-изомеры) и г-терпинеол. Эти терпинеолы обычно сопутствуют синтетическому б-терпинеолу. Они также содержатся в эфирных маслах, которые подвергли редистилляции. Кроме того, неролидол в нашем образце содержится в виде двух изомеров (цис- и транс-неролидола) в то время как в природных продуктах содержится только транс-изомер. Среди посторонних для нероли примесей можно обнаружить также бензилбензоат и бензилсалицилат, но при этом отсутствует типичный для нероли фарнезол. При наличии геранилацетата отсутствует нерилацетат (они всегда в природных продуктах сопутствуют друг другу). Уже эти данные указывают на искусственное происхождение проанализированного образца эфирного масла. Известно, что в лучшем случае для приготовления искусственного нероли используют эфирное масло петигрейн-парагвай. В данном случае мы имеем типичный случай подобной фальсификации. Такую искусственную смесь синтетических добавок (терпинеолы, бензилбензоат, бензилсалицилат, индол, метилантранилат, линалилацетат) и натурального петигрейн-парагвай очень часто предлагают как хороший заменитель натурального нероли.

Хроматограмма натурального стандартного эфирного масла нероли (Тунис)

1. a-пинен 1%; 2. сабинен 1%; 3. b-пинен 6-10%; 4. мирцен 2%; 5. a-терпинен 0.1%; 6. лимонен 10-15%; 7. Цис-b-оцимен 1%; 8. транс-b-оцимен 7%; 9. г-терпинен 0.2%; 10. терпинолен 0.4%; 11. линалоол 30-45%; 12. терпинен-4-ол 0.5%; 13 a-терпинеол 2-4%; 14. нерол 1-2%; 15. гераниол 2-3%; 16. линалилацетат 2-12%; 17. метилантранилат 0.1-0.3%; 18. нерилацетат 2%; 19. геранилацетат 4%; 20. b-кариофиллен 0.5%; 21. b-фарнезен 0.2%; 22. гермакрен D 0.2%; 23. бициклогермакрен 0.3%; 24. неролидол 1-2%; 25. фарнезол 1-2%.

Частая ошибка идентификации - ложные пики, образующие как артефакты при анализе эфирных масел (остатки от предыдущей пробы, примеси в растворителях, продукты разложения жидкой фазы в колонках). Такие "находки" следует ждать всегда. По крайней мере, надо хорошо представлять возможный химический состав хроматографируемого объекта и упредить появление возможных "фантомов".

Кроме того, каждый компонент, идентифицированный с помощью хромато-масс-спектрометра, должен быть сверен со своим индексом удерживания и лишь на основании такой всесторонней оценки делается вывод об окончательной идентификации.

Иногда для получения вспомогательной информации (для уточнения идентификации) проводят хромато-ольфактометрию профиля компонентов эфирных масел. Для этого в процессе хроматографического анализа выходной конец хроматографической колонки обнюхивают. Выходящие последовательно компоненты эфирного масла оцениваются экспертами качественно. Наиболее интересные вещества идентифицируются для возможности дальнейшего их синтеза и использования для создания парфюмерных композиций. Этим методом, удается четко и наглядно представить себе вклад отдельных составляющих эфирного масла в его аромат. Так было установлено, что в состав эфирного масла розы входят на уровне миллионных долей органические сульфиды, гнилостный запах которых иногда удается почувствовать в некоторых образцах эфирного масла розы. Не следует думать, что "плохой" запах - это плохо. Среди компонентов эфирных масел многих цветочных растений (жасмин, например) содержатся производные индола, имеющие в чистом виде запах человеческих экскрементов. Но при содержании на уровне 0.01% они имеют запах очень похожий на запах жасмина.

Список литературы

1. Государственная Фармакопея СССР XI изд. В 2-х выпусках - М.: Медицина, 1990. - Выпуск 2 - 400 с.

2. Баева, В.М. Методическое пособие к практическим занятиям по теме: "Лекарственное растительное сырье, содержащее полисахариды" / Под ред. И.Н. Самылиной - Москва: Изд-во ООО Издательский дом "Русский врач", 1999. - 75 с.

3. Биохимические методы анализа растений / Под ред. М.Н. Запрометова. - М.: Инлитиздат, 1960. - 384 с.

4. Биохимия растений / Под ред. В.Л. Кретовича. - М.: Мир, 1968. - 668 с.

5. Государственный реестр лекарственных средств, разрешенных для применения в медицинской практике и к промышленному производству. М., 1998.

6. Долгова, А.А. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии / Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. - М.: Медицина, 1977. - 256 с.

7. Ермакова, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермакова. -Л., 1972. - 364 с.

8. Жданов, Ю.А. Практикум по химии углеводов / Жданов Ю.А., Дорофеенко Г.Н. - Росвузиздат, 1963. - 169 с.

9. Количественное определение иридоидов / Л.В. Федосеева, Д.М. Попова // Фармация. - 1997. - № 4. - С. 18-21.

10. Кретович, В.Л. Биохимия растений / В.Л. Кретович. - М.: Высшая школа, 1985. - 503 с.

11. Кузнецова, Г.А. Природные кумарины и фурокумарины / Г.А Кузнецова - Л.: Наука, 1975. - 295 с.

12. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: Учебное пособие / Под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. - СПб.: СпецЛит, 2004. - 765 с.

13. Лекарственные растения государственной фармакопеи / Под ред. И.А. Самылиной, В.А. Северцева. - М.: "АНМИ", 1999. - 488 с.