Визначення фармакологічних властивостей гідролізату колагена

Кафедра технології ресторанного і оздоровчого харчування

Annotation

There are problems around the world with the needs of the population in protein-rich foods, especially those of animal origin. Of great scientific interest is the secondary collagen-containing raw material, but in the food industry its use is limited due to its poor digestibility and digestion. Currently, the production of fish products is accompanied by the formation of a large amount of secondary protein-containing raw materials (bones, fins, skin, scales, viscera, etc.), which is from 30 to 70% by weight of raw materials. Unaccountedfor sources and practical experience can increase the potential of this raw material by 30%. The mostpromising and safe direction of collagen modification is biomodification with the breakdown of covalent bonds, which increases its biological value and the availability of the effectiveness of human food enzymes. Combining natural collagen biologically active substances in culinary products with other valuable nutrients (carbohydrates, vitamins, minerals, etc.) in order to achieve a synergistic ergogenic effect will significantly expand the range of culinary products, target audience and efficiency in food technology/

Key words: collagen hydrolyzate, pharmacological studies, digestibility.

Вступ

В останні роки поряд із традиційною фармакотерапією розвивається поліфармацевтика і біофармацевтика. Клінічна нутриціологія представляє одне з нових напрямків біофармацевтики. Широке поширення набули нутріцевтичні препарати, що містять гідролізат колагену, глюкозамін, хондроітін сульфат, гіа- луронову кислоту, вітамін С та інші речовини. Аналіз ряду харчових продуктів, що споживаються в більшості країн світу довели зростаюче явище та дефіцит білка тваринного походження в продуктах харчування. Наразі виробництво рибної продукції супроводжується утворенням великої кількості вторинної білоквміс- ної сировини (кістки, плавники, шкіра, луска, нутрощі тощо), що становить від 30 до 70% від маси вихідної сировини.

Постановка проблеми. Практичний інтерес для проектування кулінарної продукції та біологічно-активних добавок представляють дослідження процесу виділення біологічно-активних речовин (БАР) колагенової природи з даної сировини, перш за все, низькомолекулярних пептидів, що володіють підвищеною біологічною активністю. Подальше комбінування натуральних колагенових БАР у складі кулінарної продукції з іншими цінними поживними речовинами (вуглеводами, вітамінами, мінералами та ін.) з метою досягнення синергічного ергогенного ефекту дасть змогу істотно розширити асортимент кулінарної продукції, цільову аудиторію і ефективність застосування в харчових технологіях.

Наразі промислово оброблені гідробіонти являють собою джерело білка високої біологічної цінності, який за структурою нагадує тваринний. Рибні продукти відіграють важливу роль у раціональному харчуванні мільйонів людей у всьому світі. Тому створення продуктів харчування нового покоління на основі морських гідробіонтів, що володіють поліпшеними харчовою і біологічною цінністю, має велике значення для задоволення зростаючого попиту на якісну продукцію. Ці види продуктів харчування багаті основними компонентами і призначені для поповнення амінокислотного та біоенергетичного запасу організму. При використанні морських біоресурсів, основне завдання полягає в розробці нових технологій розділення органічних компонентів, які пов'язані з виробництвом нових видів рибних продуктів, які можуть відповідати специфічним біологічним медико-технологічним стандартам [1; 2].

Сьогодні завданнями лікування хворих на артрит і артроз є покращення рухливості суглобів і зниження болю. Рухливість суглобів визначається оптимальними розмірами колагенових фібрил і протеогліканів. Відомо, що в хрящах оновлення матриксу відбувається через рік [3]. Тому тривале і систематичне застосування комплексу з специфічних амінокислот і глікозаміногліканів в гідролізатах колагену типу II дає змогу відновити і зміцнити структуру тканин суглобів людини. Рекомендована доза споживання гідролізату колагену в день становить 10 г [4].

Нутріцевтикі на основі гідролізату колагену ефективно впливають як на ранній стадії хвороб суглобів, так і на їх профілактику. Хронічні хвороби розвиваються внаслідок дисплазії сполучної тканини і закладаються на ембріональній стадії розвитку і/або на етапах росту дітей і підлітків. Коктейль амінокислот колагену допомагає ослабленим дітям в зміцненні суглобної, кісткової та інших сполучних тканій [5; 6]. За рахунок застосування нутрицевтиків із гідролізатів колагену в комплексі з глікозаміногліканами, вітамінами і катіонами металів можна стимулювати в клітинах біосинтез макромолекул і структуру з'єднувальних тканин, порушених в результаті їх нездорового стану.

Мета дослідження - визначення фармакологічного впливу гідролізату колагену (ГК), отриманого з вторинної рибної сировини, на живі організми.

Виклад основного матеріалу

ГК було отримано з вторинної рибної сировини, а саме з луски коропа, шляхом двостадійної лужної обробки. Технологічна схема отримання ГК наведена на рис. 1 [7].

Стадія А (підготовча). Луску за допомогою стрічкового конвеєра, подають на промивання у ванну з мішалкою. Потім, сировину підсушують у сушильній шафі. Перед подальшою обробкою заморожену луску розморожують при температурі (0-4)°С протягом 3 годин.

Стадія Б. Підготовлену луску подають у ванну для знежирювання де обробляють розчином NaOH, при ГМ=1:3 та температурі (4±2)°С протягом 24 годин. Знежирену луску промивають у ванні проточною водою. Гідроліз луски здійснюють шляхом двократної обробки. Отриманий ГК промивають водою та заливають 2%-им розчином оптової кислоти, витримують 8 хвилин для повної нейтралізації лугу. Розчин декантують та отримують осад.

Стадія В. Отриманий осад промивають водою. Для нейтралізації лугу використовують 2% розчин оцтової кислоти. Готовий ГК висушують при температурі (70±5)°С до досягнення ним масової частки вологи (6,5-7,0) %. Далі, за допомогою стрічкового конвеєра подають отриманий сухий ГК на подрібнення у дробарку. Отриманий порошок подрібнюють та фасують.

ГК має білий колір, не має запаху та присмаку, що може дати можливість його використання в якості біологічно активної добавки до різних харчових продуктів.

Для визначення впливу отриманого ГК на організм людини провели фармакологічні дослідження на щурах. Дослідження проводилось на базі консалтингової лабораторії здорового харчування Одеського національного технологічного університету та лабораторії біохімічної фармакології ДП «Всеукраїнський державний науково-виробничий центр стандартизації, метрології, сертифікації та захисту прав споживачів» (ДП «Укрметртестстандарт») м. Одеса.

Ступінь перетравлюваності ГК оцінювали за інтенсивністю його гідролізу ферментами пепсином та трипсином в умовах in vitro (рис. 2). Аналіз кінетики процесу ферментативного гідролізу (рис. 2) показав, що гідроліз відбувається практично з постійною швидкістю. Так, за 8 годин інкубації, що порівняно з реальними умовами перетравлювання їжі в організмі людини, ГК перетравлюється на 66,4%.

Рис. 1. Технологічна схема виробництва ГК

фермент гідролізат колаген рибний біомодифікація

Рис. 2 Кінетика перетравлювання ГКу системі «пепсин-трипсин» (in vitro)

Фармакологічні дослідження проведено на 20 білих лабораторних щурах (самках) лінії Вістар, віком 2,5 місяці, середньою масою 152,6 г на початок експерименту. Тварини містилися у стандартних умовах віварію, корм отримували ad libitum. Експеримент проводили з дотриманням основних положень Конвенції Ради Європи щодо охорони хребетних тварин, що використовуються в експериментах та інших наукових цілях, від 18.03.1986 року, Директиви ЄС №609 від 24.11.1986 року, Наказ МОЗ України №66 від 13.02. Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження» від 21.02.2006 №3447-IV.

Тварин поділили на 3 групи: І - стандартний комбікорм віварію, 6 тварин; II - раціон, дефіцитний за білком та кальцієм, 7 тварин; ІІІ - раціон, дефіцитний за білком та кальцієм, + гідролізат колагену 2% від маси корму, 7 тварин. Склад раціону, дефіцитного по білку та кальцію: кукурудза - 68,9%, буряк - 20,7%, капуста - 10,4%.

Виведення з експерименту здійснювали на 34-й день під тіопенталовим наркозом шляхом розтину магістральних судин. Проводили:

- забір крові для проведення загального аналізу: вміст гемоглобіну, кількість лейкоцитів, кількість еритроцитів;

- збирали кров для отримання сироватки, в якій визначали активність каталази, аланінамінотрансферази, лужної фосфатази, вміст тригліцеридів та малонового діальдегіду;

— виділяли життєво важливі органи: серце, печінку, підшлункову залозу, нирки для визначення органного індексу (маса органу, мг/масу тіла, г);

- препарували стегнові кістки та перший поперековий хребець з боку крижів для визначення морфометричних показників (щільності, маси органічного та мінерального компонента).

У табл. 1 наведено результати зміни маси щурів, які перебували під наглядом.

Зданих табл. 1 видно, що при однаковій початковій масі тіла аліментарний дефіцит білка та кальцію у щурів 2-ої групи через 34 дні викликав відставання приросту маси тіла. Так, абсолютний приріст маси у другій групі тварин був у 2,6 рази нижче, ніж у щурів, які отримували стандартний раціон віварію (р<0,001). Відносний приріст маси також знизився в 2,5 рази у щурів із аліментарним дефіцитом білка та кальцію. Отримані дані підтверджують відоме положення про відставання зростання тварин при дефіциті білка в раціоні. Щоденне введення в низькобілковий та низькокальціє- вий раціон ГК не виявило позитивного впливу на приріст маси тіла шурів 3-ї групи, показники якого збереглися на рівні значень 2-ої групи. Можливо, це може бути пов'язане з недостатньою кількістю введеного ГК або нетривалістю експерименту.

Таблиця 1

Вплив раціону на масу тіла щурів

Примітка: р - достовірність відмінностей показників першої групи;

р1 - достовірність відмінностей від показників другої групи (за критерієм Стьюдента).

Результати розрахунку органного індексу життєво важливих органів щурів, які отримували дефіцитний за білком та кальцієм раціон протягом місяця, наведено у таблиці 2. Дефіцит необхідних нутрієнтів викликав достовірне зменшення органного індексу печінки (р<0,001), нирок (р<0,001), підшлункової (р<0,05), щурів 2-ої групи, що пов'язано, перш за все, з недостатнім надходженням незамінних амінокислот у раціоні зростаючих тварин. Органний індекс серця не зазнав істотних змін.

Введення в неповноцінний раціон ГК виявило позитивну дію на органний індекс органів щурів 3-ї групи. Так, цей показник достовірно підвищився для печінки (р1<0,001) та нирок (р1<0,001). При цьому нормалізація органного індексу зареєстрована тільки для підшлункової залози (р>0,8), показник печінки та нирок, незважаючи на достовірне збільшення, не досягнув значень у тварин, які отримували стандартний раціон віварію (р<0,01, табл. 2).

Таблиця 2

Вплив раціону, дефіцитного по кальцію та білку, та ГК на органний індекс органів щурів, мг/г

Примітка: р - достовірність відмінностей показників першої групи; р1 - достовірність відмінностей від показників другої групи (за критерієм Стьюдента).

Тривалий аліментарний дефіцит білка та кальцію у щурів другої групи не вплинув на рівень гемоглобіну та кількість еритроцитів у крові тварин. При цьому загальна кількість лейкоцитів у крові щурів другої групи знизилася на 25,3% (р<0,001). Оскільки однією з функцією лейкоцитів є участь у формуванні клітинного та гуморального імунітету, зменшення цього показника констатує про зниження імунологічної реактивності тварин з тривалим аліментарним дефіцитом білка і кальцію (табл. 3).

Щоденна добавка ГК до дефіцитного раціону ефективно запобігала зниженню загальної кількості лейкоцитів у крові щурів 3-ї групи (р1<0,002). Рівень цього показника у відсутності достовірних відмінностей від такого в інтактній групі тварин, отримували стандартний раціон віварію (p>0,3, табл. 3). У таблиці 4 наведено результати дослідження показників сироватки крові, які характеризують важливі фізіологічні процеси в організмі тварин. Як зазначено в табл. 4, тривале споживання раціону, дефіцитного по кальцію та білку, викликало достовірне збільшення рівня тригліцеридів у сироватці крові щурів другої групи на 35,8% (р<0,002).

Таблиця 3

Показники загального аналізу крові щурів, що отримували раціон, дефіцитний по кальцію та білку, та добавку ГК

Примітка: р - достовірність відмінностей від показника інтактної групи, р1 - достовірність відмінностей від показника групи 2 (за критерієм Стьюдента)

Оскільки білки, зокрема альбуміни, беруть участь у транспорті жирів, то накопичення останніх говорить про дефіцит ендогенних білків та нездатність їх здійснювати повноцінний транспорт жирів до тканин та органів тварин, що призводить до їх накопичення в крові в умовах аліментарної нестачі білка та кальцію.

Один із важливих «печінкових» маркерів - активність аланінамінотрансферази (АлАТ) знижується на 28,3% у сироватці крові щурів 2-ої групи, яка отримувала неповноцінний раціон (р<0,001). Отримані дані підтверджують відомий факт про зменшення активності АлАТ у сироватці крові осіб із аліментарною білковою недостатністю, що пояснюється зниженням інтенсивності процесів переамінування амінокислот у печінці. Введення в дефіцитний за білком і кальцієм раціон тварин гідролізату колагену запобігало певною мірою зниження рівня АлАТ, активність якої була вищою, ніж у 2-ій групі (р1<0,02), але не досягла нормальних значень (р<0,02, таблиця 4).

Таблиця 4

Деякі показники сироватки крові щурів, які отримували раціон, дефіцитний по кальцію та білку, та добавку гідролізату колагену

Примітка: р - достовірність відмінностей показників першої групи;

р1 - достовірність відмінностей від показників другої групи (за критерієм Стьюдента).

Активність лужної фосфатази в сироватці крові щурів другої групи, навпаки, зросла на 67,9% (р<0,002). Збільшення активності лужної фосфатази, зазвичай, сприймається як ознака механічної жовтяниці, атрофії гепатоцитів чи активацією остеогенезу. У дослідженні таке підвищення активності ферменту може бути пов'язане з атрофією печінкових клітин внаслідок аліментарного дефіциту білка, а також не виключено компенсаторну активацію процесу кісткоутворення в умовах тривалої нестачі кальцію та білка в раціоні. Добавка гідролізату колагену до неповноцінного раціону тварин 3-ї групи сприяла зниженню активності сироваткової лужної фосфатази до нормального рівня (р>0,2 та р1<0,02, табл. 4).

Неповноцінний раціон викликав збій в антиоксидантно-прооксидантної системи тварин другої групи. Так, у сироватці крові щурів після тривалого аліментарного дефіциту білка та кальцію зареєстровано достовірне збільшення каталази на 26,8% (р<0,05) та рівня малонового діальдегіду (МДА) - на 22,8% (р<0,05, табл. 4). Оскільки МДА є продуктом перекисного окиснення ліпідів, можна зробити висновок, що неповноцінний раціон викликає інтенсифікацію цього процесу або оксидативний стрес. Підвищення активності одного з основних антиоксидантних ферментів каталази пояснюється компенсаторним підвищенням антиоксидантного захисту за умов інтенсифікації перекисного окиснення ліпідів. Введення в неповноцінний раціон гідролізату колагену ще більшою мірою підвищило активність каталази (р1<0,05) і не вплинуло на вміст МДА (р1>0,7) у сироватці крові щурів 3-ї групи (табл. 4). Це свідчить про те, що для нормалізації антиоксидантно-про- оксидантного статусу в умовах аліментарного дефіциту білка та кальцію необхідно введення до раціону додаткових компонентів, можливо антиоксидантів.

У щурів, які отримували неповноцінний раціон, щільність усіх досліджуваних кісток була достовірно нижчою за показники в інтактній групі - на 3,59% для стегнових кісток (p<0,01) та на 5,06% для поперекових хребців (p<0,001) (табл. 5 і 6). При цьому маса і об'єм всіх досліджуваних кісток у щурів цієї групи були нижче, ніж у щурів інтактної групи: на 13,9 і 10,5% відповідно для стегнових кісток і на 17,1 і 12,5% для хребців, хоча і не достовірно (табл. 5 та 6).

Добавка гідролізату колагену до дефіцитного раціону в третій групі достовірно підвищила щільність всіх кісток у щурів цієї групи порівняно з показниками у 2-ій групі (p1<0,001) та в інтактній групі (p<0,01): на 7,44 та 3,59% відповідно для стегнових кісток і на 9,42 і 3,88% - для поперекових хребців (табл. 5 і 6).

Таблиця 5

Морфометричні параметри стану стегнових кісток щурів

Примітка: р - достовірність відмінностей показників першої групи; р1 - достовірність відмінностей від показників другої групи (за критерієм Стьюдента).

Таблиця 6

Морфометричні параметри стану поперекових хребців

Примітка: р - достовірність відмінностей показників першої групи;

р1 - достовірність відмінностей від показників другої групи (за критерієм Стьюдента).

Добавка гідролізату також сприяла збільшенню маси та об'єму кісток у цій групі, при цьому дані показники чисельно перевищували аналогічні значення в інтактній групі: за масою - на 5,1 та 5,85% для стегнових кісток та хребців, за об'ємом - на 1,70 і 2,27%, відповідно. Збільшення маси та обсягу кісток при додаванні гідролізату порівняно з показниками у 2-ій групі було достовірним (p1<0,01) і склало за масою - 22,0 та 28,2% для стегнових кісток та хребців, за обсягом - 13,6 та 17%.

Аналіз компонентного складу кісток показав, що хребці мають менший ступінь мінералізації (в 1,12 рази) порівняно з стегновими кістками при подібному вмісті органіки для всіх груп щурів. Зниження щільності всіх досліджуваних кісток у групі на неповноцінному раціоні порівняно з показниками в інтактній групі поєднується з достовірним зниженням вмісту мінерального компонента (р<0,01): на 9,80% у стегнових кістках та на 24,14% у хребцях за практично однаковий зміст органіки. Додавання гідролізату колагену сприяло достовірному збільшенню вмісту мінерального компонента, показники якого значно перевищили значення аналогічних показників в інтактній групі (p<0,001) та групі на неповноцінному раціоні (p1<,01): на 10,1 та 22,1% для стегнових кісток на 10,7 і 45,9% для хребців (табл. 5 і 6).

Тривале споживання щурами раціону, дефіцитного по білку і кальцію викликало: виражене зниження темпу зростання маси тіла щурів, зменшення маси печінки, підшлункової залози та нирок, зниження загальної кількості лейкоцитів, підвищення рівня тригліцеридів, активності лужної фосфатази, каталази та рівня малонового діальдегіду на тлі зниження активності АлАТ у сироватці крові, зниження щільності кісток рахунок зменшення частки мінерального компонента.

Введення в неповноцінний раціон гідролізату колагену 2% маси корму деякою мірою гальмувало зниження маси печінки, підшлункової залози та нирок тварин, запобігало зменшенню загальної кількості лейкоцитів, нормалізувало активність лужної фосфатази, дещо знижувало рівень тригліцеридів та підвищувало активність АлАТ та не вплинуло на активність каталази та рівень МДА у сироватці крові, збільшення маси та обсягу кісток, а також щільності кісток за рахунок підвищення вмісту мінерального компонента.

Висновок

Отримані дані показали, що гідролізат колагену, отриманий шляхом лужної обробки вторинної рибної сировини, перетравлюється на 66,4%, що дає змогу рекомендувати його в якості БАР. Отримані дані фармакологічного дослідження довело, що гідролізат колагену в раціоні частково компенсував дефіцит білка в раціоні, сприяючи розвитку внутрішніх органів щурів і, відновлюючи транспорт тригліцеридів, виявив імуностимулюючу і гепатотропну дію, а також виражений остеотропний ефект на тлі тривалого вживання щурів раціону, дефіцитного на білок. Добавка даного компонента до неповноцінного корму сприяла посиленню синтезу кісткової тканини, що виявилося збільшення маси і об'єму кісток, і значно підвищила рівень мінералізації кісток, за рахунок чого збільшилася щільність кісток. При цьому вплив гідролізату колагену на стан поперекових хребців був більш вираженим порівняно з аналогічним ефектом у стегнових кістках.

Список використаної літератури

1. Normy fiziologicheskikh potrebnostey v energii i pishchevykh veshchestvakh dlya razlichnykh grupp naseleniya Rossiyskoy Federatsii [Norms of physiological requirements in energy and nutrients for different population groups in the Russian Federation]. Moscow, 2008. 41 p.

2. Zhong C., Sun Z., Zhou Z., et al. Chemical characterization and nutritional analysis of protein isolates from Caragana korshinskii Kom. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, vol. 62, pp. 3217-3222.

3. Багратишвили В.Н., Соболь Э.Н., Шехтер А.Б. Лазерная инженерия хрящей. Москва: ФИЗМАТЛИТ, 2006. 488 c.

4. Moskowitz R.W. Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease. Seminars in Arthritis and Rheumatism. 2000. Vol. 30. P. 87-99. Lopez H.L.

5. Osteoarthritis supplement nutritional interventions to prevent and treat osteoarthritis. Part II: Focus on vicronutrients and supportive nutraceuticals. The American Academy of Physical Medicine and Rehabilitation. 2012, Vol. 4. рр. 155-168.

6. Кадурина Т.И., Горбунова В.Н. Дисплазия соединительной ткани: Руководство для врачей. Санкт-Петербург: ЭЛБИ, 2009. 704 c.

7. Спосіб одержання колагенового препарату: пат. 79357 Україна: МПК (2006.01) A23J 1/04 №79357; заявл. 13.08.2012; опубл. 25.04.2013, Бюл. №8.

References

1. Normy fiziologicheskikh potrebnostey v energii i pishchevykh veshchestvakh dlya razlichnykh grupp naseleniya Rossiyskoy Federatsii [Norms of physiological requirements in energy and nutrients for different population groups in the Russian Federation]. Moscow, 2008. 41 p.

2. Zhong, C., Sun Z., Zhou Z., et al. (2014) Chemical characterization and nutritional analysis of protein isolates from Caragana korshinskii Kom. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 62, pp. 3217-3222.

3. Bagratishvili, V.N., Sobol' E.N., Shekhter A.B. (2006) Lazernaya inzheneriya hryashchej. M.: FIZmAtLiT. pp. 488.

4. Moskowitz R.W. (2000) Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease. Seminars in Arthritis and Rheumatism, vol. 30, рр. 87-99.

5. Lopez H.L. (2012) Osteoarthritis supplement nutritional interventions to prevent and treat osteoarthritis. Part II: Focus on vicronutrients and supportive nutraceuticals. Amer. Acad. Physic. Med. Rehab, vol. 4, рр. 155-168.

6. Kadurina T.I., Gorbunova V.N. (2009) Displaziya soedinitel'noj tkani. Rukovodstvo dlya vrachej. SPb.: ELBI, pр. 704.

7. Sposib oderzhannya kolagenovogo preparatu. PAT. 79357. Ukraina MPK (2006.01) A23J 1/04. №79357; zayavl. 13.08.2012; opubl. 25.04.2013, Byul. №8.

Размещено на allbest.ru