Экспрессные колориметрические методы определения тяжелых металлов: применение поли-т-олигонуклеотида в качестве рецепторной молекулы

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЭКСПРЕССНЫЕ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ: ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИ-Т-ОЛИГОНУКЛЕОТИДА В КАЧЕСТВЕ РЕЦЕПТОРНОЙ МОЛЕКУЛЫ

Берлина А.Н.

Жердев А.В.

Дзантиев Б.Б.

Институт биохимии им. А. Н. Баха,

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН

Москва, Россия

Аннотация

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами обуславливает необходимость разработки тест-систем для их определения. Данная работа включала синтез золотых наночастиц, их модификацию олигонуклеотидным рецептором - аптамером - с последовательностью из десяти тиминовых азотистых оснований (поли-Т) и проведение анализа образцов воды, содержащей известные концентрации различных ионов. Анализ основан на изменении цвета конъюгата золотых наночастиц при введении катионов металлов в достаточной концентрации в реакционную среду. В качестве способа регистрации выбрана колориметрия благодаря свойствам поверхностного плазмонного резонанса золотых наночастиц. Для данного аптамера показано взаимодействие с катионами ртути, охарактеризовано влияние на анализ других катионов. Преимуществами предложенного подхода, определяющими их практическую востребованность, являются экспрессность, простота проведения анализа и оценки получаемых результатов.

Ключевые слова: аптамер, золотые наночастицы, агрегация, гомогенный анализ, тяжелые металлы, детекция, колориметрия.

Abstract

Berlina A. N., Zherdev A. V., Dzantiev B. B., A.N. Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology of the Russian, Academy of Sciences, Moscow, Russia.

RAPID COLORIMETRIC METHODS FOR THE DETERMINATION OF HEAVY METALS: THE USE OF A POLY-T OLIGONUCLEOTIDE AS A RECEPTOR MOLECULE.

Pollution of the environment with heavy metals necessitates the development of test systems for their determination. This work included the synthesis of gold nanoparticles, their modification by oligonucleotide receptor (aptamer) with a sequence of ten thymine nitrogenous bases (poly-T) and analysis of water samples containing known concentrations of various ions. The analysis is based on the color change of the conjugate of gold nanoparticles after the introduction of metal cations in sufficient concentration into the reaction medium. Colorimetry was chosen as the registration method due to the surface plasmon resonance properties of gold nanoparticles. For this aptamer, the interaction with mercury cations is shown, and the effect on the analysis of other cations is characterized. The advantages of the proposed approach, which determine their practical relevance, are expressivity, ease of analysis and evaluation of the obtained results.

Key words: aptamer, gold nanoparticles, aggregation, homogeneous analysis, heavy metals, detection, colorimetry.

Введение

Тяжелые металлы являются причиной отравлений людей питьевой водой и пищей в экологически неблагоприятных регионах [1]. Для их контроля разработаны спектроскопические и хроматографические методы. Однако сложность пробоподготовки, а также стоимость оборудования и анализа не позволяют использовать эти методы для широких скрининговых обследований. Поэтому на протяжении последних лет активно развиваются альтернативные методы анализа, прежде всего основанные на изменении оптических свойств наночастиц, связанных с рецепторными молекулами [2]. В разрабатываемых аналитических системах используются как металлические (золотые, серебряные наночастицы, квантовые точки), так и неметаллические (графен, углеродные наноточки) нанореагенты. Значительный интерес представляет использование в анализе биорецепторных молекул для обеспечения высокой селективности. В ряде работ показана возможность применения в этом качестве аптамеров - олигонуклеотидов, селективно распознают целевой аналит (см. обзор [3]). Аптамеры успешно используются в колориметрических, флуоресцентных, электрохимических сенсорах для детекции тяжелых металлов. Их иммобилизация на подложку (наночастицы, нанопленки, поверхность электродов) позволяет осуществлять быструю детекцию катионов в разных видах проб. Однако значительная часть новых методических решений не включает изучение широкого круга соединений, которые могут влиять на селективность определения выбранных ионов (например, ртути), а концентрация сторонних ионов, выбранных для сравнения, выбирается в диапазоне 10-100 нг/мл, что зачастую не соответствует их содержанию в образцах природной воды. Такие методы дают ложноположительные результаты при тестировании проб, содержащих сторонние ионы. Для корректной оценки влияния сторонних компонентов на селективность определения катионов тяжелых металлов необходимо использовать гораздо более высокие концентрации ионов.

Выбор селективной молекулы, использованной в настоящей работе для определения ионов ртути, основывается на специфическом взаимодействии T-Hg-T [4]. Отмечалось, что нуклеотидные последовательности, содержащие несколько тиминов, наиболее специфичные по отношению к катионам ртути [5], тогда как оптимальные аптамеры для детекции ионов свинца - как правило, гуанин-обогащенные последовательности [6]. Ранее в нашей работе [7] аптамер с высоким содержанием одновременно гуанина и тимина был использован для определения катионов свинца и ртути в водных средах. Задачей данного исследования была оценка возможности использования поли-Т аптамера для определения ионов ртути и других катионов.

Материалы и методы.

Материалы.

В работе были использованы: водные растворы ионов Hg²⁺, Pb²⁺, As³⁺, Ag⁺, Sb³⁺, Sr⁺, Sn⁴⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Mo²⁺ производства ООО «Центр стандартных образцов и высокочистых веществ», соли MgSO4, NH4VO3, CsCl, U2SO4, Na3VO4, CrCh, Bi(OH)2NO3, Na2WO4, (CH3COO)2Ni, CaCh, La(NO3)3 химической чистоты, золотохлористоводородная кислота, трис основание производства Sigma-Aldrich (США), бычий сывороточный альбумин производства Boval Biosolutions (США). Олигонуклеотид с последовательностью HS-(CH2)6- ТТТТТТТТТТ (поли-Т, концентрация 88,8 pM) синтезирован фирмой Sintol (Россия). Все остальные реагенты - фирмы Химмед (Россия). Деионизированная вода (сопротивление 18.5 MQ * cm при 22 °C) получена на установке Simplicity производства Millipore (США). Для проведения гомогенного анализа использовались 96-луночные полистироловые планшеты для проведения ИФА фирмы Costar (США). Для проведения экспериментов были приготовлены водные растворы ионов в диапазоне концентраций 0,5 - 1000 нг/мл, а также контрольный препарат, не содержавший исследуемых ионов. золотые наночастицы аптамер ион

Методы.

Синтез золотых наночастиц (ЗНЧ).

ЗНЧ были получены восстановлением золотохлористоводородной кислоты с использованием цитрата натрия. 200 мкл 5% раствора HAuCh были добавлены к 97,5 мл бидистиллированной воды, а раствор доведен до кипения. В реакционную смесь вносили 1,5 мл 1% раствора цитрата натрия, оставляли кипеть в течение 25 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Препарат ЗНЧ хранили при 4-6°C.

Конъюгирование аптамеров с ЗНЧ.

ЗНЧ доводили до рН 8,2 (9,0) с помощью 100 мМ NaOH. В эппендорфы объемом 5 мл добавляли 3 мл препарата ЗНЧ. Аптамер в необходимом объеме переносили в эппендорф на 500 мкл и доводили до 90 °С, выдерживали 5 мин, затем сразу же помещали в морозильную камеру на -20°С на 30 сек. После этого аптамер вносили в эппендорфы с ЗНЧ и оставляли смеси на 24 часа на шейкере IntelliMixer (Латвия), режим F2, 74 rpm.

Проведение взаимодействия модифицированных аптамером ЗНЧ и исследуемых ионов.

Анализ проводился при комнатной температуре. 100 мкл растворов анализируемых ионов вносили в лунки микропланшета. Затем 5 мкл конъюгата ЗНЧ с оптической плотностью при 525 нм, равной 2,0, вносили в лунки, перемешивали реакционную смесь и измеряли оптическую плотность при 620 нм. Минимальную концентрацию ионов, приводящую к изменению цвета раствора от розового до фиолетово-голубого, считали соответствующей пределу обнаружения.

Просвечивающая электронная микроскопия.

Препараты наносили в количестве 7 мкл на 300-меш сеточки для микроскопии, покрытые поливинилформоварной пленкой. Электронный микроскоп JEM CX-100 (Jeol, Япония) использовался при напряжении 80 кВ. Полученные изображения обрабатывали в программе Image Tool (США).

Результаты и обсуждение

Синтезированы золотые наночастицы с использованием золотохлористоводородной кислоты в качестве прекурсора, а цитрата натрия - в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента. Полученные наночастицы конъюгировали с аптамером, состоявшим из десяти тиминовых азотистых оснований. Конъюгирование обеспечивало специфическое связывание тиоловой группы концевого углеводородного фрагмента модифицированного аптамера на поверхности частиц. Полученный препарат охарактеризован методом просвечивающей электронной микроскопии. Из рис. 1 видно, что частицы конъюгата имеют форму, близкую к сферической (коэффициент эллиптичности составляет 1,3), агрегаты отсутствуют. Среднее значение диаметра наночастиц, определенное данным методом, составило 28,4±3,5 нм.

Рис. 1. Электронная микрофотография золотых наночастиц, модифицированных аптамером

Далее проводили оценку влияния катионов на оптические свойства конъюгата. Помимо ртути, были охарактеризованы другие катионы, являющиеся частыми спутниками ртути в водных пробах Pb²⁺, As³⁺, Ag⁺, Sb³⁺, Sr⁺, Sn⁴+, Cu²⁺, Cd²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Mo²⁺, Ca²⁺ и другие катионы. При достижении определенной концентрации катиона, реагирующего с аптамером, цвет коллоидного раствора изменялся с розового на голубой. Если же катион не взаимодействовал с аптамером, то критического сближения частиц конъюгата не происходило и, соответственно, цвет реакционной смеси не менялся. Так, введение ртути приводило к изменению цвета реакционной среды, содержащей конъюгат ЗНЧ с поли-Т аптамером, при достижении концентрации 1 мкг/мл, а зависимость оптической плотности от концентрации катиона имела флокуляционную форму (рис. 2), как и в ранее проведенной работе [7] для гуанин- и тиминобогащенной последовательности. Несмотря на высокую чувствительность к катионам ртути, отмечено взаимодействие с рядом других катионов, например, As³⁺, Cr³⁺, Mn²⁺, Pb²⁺ если их концентрация была выше 0,3 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 1 и 1 мкг/мл соответственно.

Рис. 2. Зависимость оптической плотности конъюгата ЗНЧ с поли-Т аптамером от концентрации катионов ртути. Пунктирная линия разделяет точки до и после взаимодействия конъюгата ЗНЧ с поли-Т аптамером с катионами ртути (ниже - реакционная смесь розового цвета, выше - фиолетово-голубого)

Методом просвечивающей электронной микроскопии показано возникновение агрегатов или скоплений частиц при увеличении концентрации катионов (рис. 3).

Рис. 3. Электронные микрофотографии агрегатов ЗНЧ, модифицированных аптамером, после взаимодействия с катионами As³⁺ (А) и Cr³⁺ (Б)

Выводы

Результаты работы продемонстрировали перекрестную селективность поли-Т аптамера по отношению к катионам ртути и других тяжелых металлов. Таким образом, для детекции тяжелых металлов с использованием ДНК аптамеров в качестве рецепторных молекул необходим тщательный подбор последовательностей, позволяющих свести к минимуму перекрестные взаимодействия с другими ионами.

Литература

2. Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Progress in rapid optical assays for heavy metal ions based on the use of nanoparticles and receptor molecules // Microchimica Acta. 2019. No 186 (3). P. 172. URL: https://doi.org/10.1007/s00604-018-3168-9

3. Farzin L., Shamsipur M., Sheibani S. A review: Aptamer-based analytical strategies using the nanomaterials for environmental and human monitoring of toxic heavy metals // Talanta, 2017. No 174 (Supplement C). P. 619-627.

4. Tamura, Computational evaluation of the specific interaction between cation and mismatch base pair / H. Sugiyama, N. Adachi, S. Kawauchi [et al.] // Nucleic Acids Symposium Series. 2005. N 49 (1). P. 215-216.

5. Zhou W., Ding J., Liu J. 2-Aminopurine-modified DNA homopolymers for robust and sensitive detection of mercury and silver // Biosensors and Bioelectronics. 2017. No 87. P. 171 - 177.

6. Smirnov I., Shafer R.H. Lead is unusually effective in sequence-specific folding of DNA1 // Journal of Molecular Biology. 2000. No 296 (1). P. 1-5.

7. Rapid visual detection of lead and mercury via enhanced crosslinking aggregation of aptamer-labeled gold nanoparticles / A.N. Berlina, A.V. Zherdev, S.M. Pridvorova [et al.] // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2019. No 19. P. 1-7.

Размещено на Allbest.ru