Методичні основи одержання і використання трансгенних тварин

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Міністерство освіти та науки України

Національний університет «Львівська політехніка»

Кафедра технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології

Індивідуальна робота

Дисципліна: «Загальна біотехнологія, ч. 2»

Тема:

Методичні основи одержання і використання трансгенних тварин

Виконала: Мороз Анастасія

студентка групи БТ-31

Прийняв: к.х.н., доцент Курка М.С.

Львів 2021



План

Анотація

Вступ

1. Відмінності між вибірковим розведенням та трансгенезом

2. Перші експерименти по створенню трансгенних тварин

3. Основні способи впровадження трансгенних конструкцій у тваринні клітини

4. Трансгенні тварини із заданими ознаками

5. Види трансгенних тварин

6. Морально-етичні проблеми, що постають на шляху трансгенним дослідженням

Висновки

Список використаних джерел



Анотація

Генетична інженерія - це конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), або інакше - створення штучних генетичних програм. Генетична інженерія - це система експериментальних прийомів, що дозволяють конструювати лабораторним шляхом (в пробірці) штучні генетичні структури у вигляді так званих рекомбінантних або гібридних молекул ДНК.

У завдання генетичної інженерії входить вирішення трьох основних задач:

- конструювання функціонально активних генетичних структур у вигляді рекомбінантних ДНК, придатних для перенесення в інші клітини;

- розробка методів введення рекомбінантних ДНК в клітину;

- створення умов для нормальної експресії генів, введених в дану клітину.

Мета прикладної генетичної інженерії полягає в конструюванні таких рекомбінантних молекул ДНК, які при впровадженні в генетичний апарат надавали б організму властивості, корисні для людини.

Технології, що виникли на основі методів молекулярної генетики, використовуються в найрізноманітніших областях, таких як діагностика спадкових захворювань у людини і тварин, криміналістика і етнографія, виробництво господарсько цінних і біологічно активних речовин, отримання штамів мікроорганізмів, трансгенних тварин і рослин із заданими властивостями, клонування цілих організмів, органів або окремих клітин.



Вступ

Сучасні методи селекції сільськогосподарських тварин базуються на використанні внутрішньовидової генетичної мінливості. Як правило, види генетично ізольовані один від одного і не схрещуються між собою, так як цьому перешкоджає репродуктивна ізоляція.

У класичній селекції, де використовують для схрещування тварин зі статевою сумісністю, не можна застосовувати міжвидову генетичну мінливість і створювати нові генетичні форми, так як рекомбінація генів відбувається тільки між хромосомами тварини одного виду.

Подолати біологічні межі видів і використовувати міжвидову генетичну мінливість для створення нових генотипів тварин можна за допомогою біотехнологічних методів і процесів перенесення генів. Під перенесенням чужорідного гена розуміють пересадку in vitro певної конструкції гена в клітини іншої тварини незалежно від її видової приналежності. Якщо конструкція гена інтегрувалася в геном іншої тварини, то такий ген позначається, як трансген. Кодований трансгеном білок носить назву трансгенного продукту. Тварина, яка містить в своєму геномі трансген, називається трансгенною. Якщо тварини передають трансгени своїм нащадкам, то утворюються родинні групи трансгенних тварин - трансгенні лінії.

Організми, що містять інтегровані послідовності клонованої ДНК (трансгени), перенесені за допомогою методів генної інженерії (включаючи такі, як передача генів та заміщення генів - трансгенез), називаються трансгенними.

Трансгенні тварини - це індивідууми, в геном яких штучно введена додаткова генетична інформація (трансген).

Такою інформацією є або окрема ділянка ДНК зі своїми (гомологічними) регуляторними послідовностями (еукариотична транскрипційна одиниця), або сконструйований із різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген.

Впровадження різними методами рекомбінантної ДНК в живий організм перетворює його в генетично модифікований. При цьому рекомбінантні ДНК стають складовою частиною генетичного апарату рецепієнтного організму і повідомляють йому нові унікальні генетичні, біохімічні, а потім і фізіологічні властивості. Така генетична модифікація, що проводиться, як правило, в наукових або господарських цілях для отримання бажаних якостей змінюваного організму, відрізняється цілеспрямованою зміною генотипу організму, на відміну від випадкових змін, характерних для природного і штучного мутагенезу.

Отже, трансген - це штучно запроваджений інтегрований в ДНК тварин чужорідний ген. Під трансгенезом розуміють процес перенесення і інтеграції чужорідної генетичної інформацією геном тварин.

Розвиток трансгенних тварин був частиною біотехнологічних досліджень, які швидко розширювались.

Трансгенні тварини отримані з метою отримання кращої та якісної породи, збільшення надоїв, а також для отримання органів для задоволення попиту на трансплантацію органів. Генетично модифіковані тварини стають все більш важливими для розробки нових методів лікування та лікування багатьох серйозних захворювань.

На відміну від рослин, де існує можливість отримання цілої фертильної рослини з однієї трансформованої соматичної клітини і вегетативне розмноження, отримання трансгенних тварин - дуже складний і тривалий процес, тісно пов'язаний з досягненнями в області молекулярних і репродуктивних біотехнологій. Проте, сучасні методи і процеси біотехнології дозволяють забезпечити високу специфічність внесення змін в геном тварин. Це виводить на новий рівень роботи зі створення тварин-продуцентів рекомбінантних білків, в т.ч. для потреб фармацевтичної промисловості.

У світовій практиці вже отримані трансгенні тварини, що продукують з молоком цілий ряд лікарських речовин:

- фактори згортання крові проти гемофілії;

- тканинний плазменно-генний активатор, застосовуваний при лікуванні венозних тромбів і ураженні легеневої артерії;

- людський білок для запобігання утворення тромбів;

- моноклональні антитіла для лікування різних форм раку.

Використовувана стратегія отримання трансгенних тварин полягає в наступному:

1. Клонований ген вводять в ядро заплідненої яйцеклітини.

2. Запліднені яйцеклітини з екзогенної ДНК імплантують в реципієнтну жіночу особину (оскільки успішне завершення розвитку ембріона ссавців в інших умовах неможливо).

3. Відбирають нащадків, які розвинулися з імплантованих яйцеклітин, які містять клонований ген у всіх клітинах.

4. Схрещують тварин, які несуть клонований ген в клітках зародкової лінії, і отримують нову генетичну лінію.



1. Відмінності між вибірковим розведенням та трансгенезом

Вибіркове розведення та генна інженерія - два методи, що використовуються для отримання організмів із бажаними ознаками.

Вибіркове розведення або штучний відбір - це спарювання двох організмів з певними генетичними характеристиками. Люди виводили продовольчі культури з диких рослин та одомашнених тварин протягом тисячоліть, тому це вид штучного відбору.

Етапи селективного селекційного процесу такі:

1) Вибір важливих характеристик;

2) Вибір батьків, які демонструють вибрані характеристики серед змішаної сукупності;

3) Розведення вибраних батьків разом;

4) Вибір найкращого потомства з бажаними характеристиками;

5) Повторення процесу розмноження протягом багатьох поколінь, щоб отримати потомство, що демонструє всі бажані характеристики.

Однією з груп рослин, яка протягом багатьох поколінь суттєво підтримувала вибірковий процес розмноження, є модифіковані штами рослини гірчиці дикої (Brassica oleracea). Ці модифіковані штами - цвітна капуста (квіткові бруньки), капуста (кінцеві листкові бруньки), брюссельська капуста (бічні листкові бруньки), брокколі (квіткові бруньки та стебло), капуста (листя) та кольрабі (стебло).

Основна відмінність між селективним розведенням та генною інженерією полягає в тому, що селективне розведення не викликає жодних змін у генетичному матеріалі організму, тоді як генна інженерія вносить зміни в генетичний матеріал організму.

Крім того, селективне розведення бере участь у схрещуванні двох організмів одного виду з бажаними характеристиками, тоді як чужорідні гени з бажаними ознаками вводяться в організм під час генної інженерії.

Вибіркове розведення відноситься до процесу модифікації характеристик живих істот з метою посилення однієї або декількох бажаних ознак шляхом відбору в селекції, контрольованої людиною. На відміну від цього, генна інженерія відноситься до навмисної модифікації характеристик організму шляхом маніпулювання його генетичним матеріалом. Таким чином, це принципова різниця між селективним розведенням та генною інженерією.

Селективне розведення не вводить чужорідну ДНК в геном, тоді як генна інженерія вводить чужорідну ДНК в геном. Це ще одна відмінність між вибірковим розведенням та генною інженерією.

Більш того, селективне розведення здійснюється шляхом штучного відбору партнерів по спарюванню, тоді як генна інженерія здійснюється шляхом введення рекомбінантних плазмід в організм господаря.

Крім того, для селективного розведення не потрібно спеціальне обладнання та навчені люди, тоді як генна інженерія є ефективним способом продукування організмів із бажаною ознакою.

Селективне розведення вимагає часу, і обмежені ознаки можуть бути змінені, тоді як генна інженерія є дорогим методом і вимагає спеціального обладнання. Отже, це ще одна відмінність між селективним розведенням та генною інженерією.

2. Перші експерименти по створенню трансгенних тварин

Процес селективного розведення, в якому відбуваються організми з бажаними ознаками (і, отже, з бажаними генами) використовуються для розмноження наступного покоління, а організми, у яких відсутня ознака, не виводяться, є попередником сучасної концепції генетичної модифікації. Різні досягнення в генетиці дозволили людям безпосередньо змінювати ДНК і, отже, гени організмів.

У 1972 році Пол Берг створив першу рекомбінантну молекулу ДНК, поєднавши ДНК вірусу мавпи SV40 з вірусом лямбда.

Герберт Боєр та Стенлі Коен створили перший генетично модифікований організм у 1973 р. Вони взяли ген бактерії, який забезпечував стійкість до антибіотика канаміцину, вставляли його в плазміду, а потім спонукали інші бактерії включати плазміду. Бактерії, які успішно включили плазміду, змогли вижити в присутності канаміцину. Бойер і Коен експресували інші гени в бактеріях. Сюди входили гени жаби Xenopus laevis в 1974 році, створивши перший ГМО, що експресує ген з організму іншого царства.

У 1974 році Рудольф Яєніш створив трансгенну мишу, ввівши чужорідну ДНК в її зародок, зробивши її першою у світі трансгенною твариною. Однак пройшло ще вісім років, перш ніж були розроблені трансгенні миші, які передали трансген своїм нащадкам. У 1984 році були створені генетично модифіковані миші, які несли клоновані онкогени, схильні до розвитку раку. Миші з видаленими генами (іменованими мишами-нокаутами) були створені в 1989 році.

Можливість конструювати нові гібридні молекули ДНК in vitro виникла завдяки зробленим в середині XX ст. відкриттям, таким як встановлення комплементарної структури ДНК, механізму її реплікації і репарації, розшифровка генетичного коду, встановлення механізму перенесення генетичної інформації в клітині, механізмів роботи і регуляція генів та ін. Одним з найбільш значних відкриттів, які дозволили розвинути генно-інженерні технології, було ідентифікація і виділення рестрикційних эндонуклеаз, що здійснюють сайт-специфічне розщеплення ДНК. До цього відкриття не існувало відтвореного методу фрагментації ДНК.

У 1976 році Герберт Боєр заснував Genentech - першу компанію генної інженерії - з венчурним капіталістом Робертом Свонсоном. Підхід Genentech до першого синтезу інсуліну перебрав підхід Уолтера Гілберта в Biogen, який використовував цілі гени з природних джерел. Бойер побудував свій ген з окремих нуклеотидів.

У серпні 1978 року Боєр виготовив синтетичний інсулін, використовуючи свої нові трансгенні генетично модифіковані бактерії, для яких у 1979 році послідував гормон росту.

Однією з вражаючих робіт на ранніх етапах трансгенезу були експерименти Пальмітера із співробітниками у 1982 р. щодо мікроін'єкції у зиготи мишей гена гормону росту (ГГР) пацюка під контролем сильного промотора металотіонеїнового гена 1 (МТ-1) миші. Перенесення такої штучної конструкції викликало посилений ріст мишей в онтогенезі і значне збільшення ваги трансформованих тварин, що народилися із ін'єкцьованих зигот.

Перші трансгенні худоби були виведені в 1985 році, а перші тварини, які синтезували трансгенні білки в своєму молоці, були мишами в 1987 році. Миші були сконструйовані для виробництва активатора плазміногену в людській тканині - білка, який бере участь у розщепленні тромбів.

Першою комерціалізованою генетично модифікованою твариною була GloFish, риба Зебра з доданим флуоресцентним геном, що дозволяє їй світитися в темряві під ультрафіолетовим світлом. Вона була випущена на ринок США в 2003 році.

У 2015 році лосось AquAdvantage стала першою генетично модифікованою твариною, яку було схвалено для вживання в їжу. Схвалення стосується риби, що вирощується в Панамі та продається в США. Лосось був перетворений за допомогою регулюючого гормону росту гена з тихоокеанського лосося Чинук та промотора з американської бельдюги, що дозволяє йому рости цілий рік, а не лише навесні та влітку.

Експерименти по генетичній модифікації багатоклітинних організмів шляхом введення в них трансгенів вимагають багато часу. Проте, трансгенез став потужним інструментом для дослідження молекулярних основ експресії генів ссавців і їх розвитку, для створення модельних систем, що дозволяють вивчати хвороби людини, а також для генетичної модифікації клітин молочних залоз тварин з метою отримання з молоком важливих для медицини білків.

Був навіть запропонований новий термін «фармінг» (pharming), що відноситься до процесу отримання з молока трансгенних домашніх тварин автентичних білків людини або фармацевтичних препаратів.

Використання молока доцільно тому, що воно утворюється в організмі тварини у великій кількості і її можна надоювати у міру потреби без шкоди для тварини. Новий білок, що виробляється молочною залозою і секретується в молоко, не повинен при цьому надавати ніяких побічних ефектів на нормальні фізіологічні процеси, що протікають в організмі трансгенної тварини, і піддаватися посттрансляційним змінам, які, в крайньому випадку, близькі до таких в клітинах людини. Крім того, його виділення з молока, яке містить і інші білки, не повинно становити великої праці.

Незважаючи на те, що перші трансгенні сільськогосподарські тварини були отримані в 1985 р введенням екзогенної ДНК в пронуклеус зигот, до теперішнього часу не розроблено ефективного методу, який би міг бути використаний для створення генетично модифікованих тварин незалежно від виду і від цілей експерименту. Розробка нових ефективних методів переносу генів в ембріональні і соматичні клітини тварин, а також вдосконалення існуючих підходів залишається актуальним завданням.

3. Основні способи впровадження трансгенних конструкцій у тваринні клітини

Серед великої різноманітності способів впровадження екзогенної ДНК в геном тварини можна виділити наступні, які знайшли широке застосування в практиці трансгенезу:

- метод мікроін`єкції,

- опосередковане ретровірусами перенесення генів,

- використання модифікованих ембріональних стовбурових клітин - перенесення трансформованих ядер генеративних і соматичних клітин,

- використання сперміїв і сперматогоніїв як переносників ДНК.

Серед інших методів доставки екзогенної ДНК в організм тварин можна відзначити використання ліпосом, аденовірусних векторів, а також метод високошвидкісної ін'єкції. Однак ці методи не знайшли широкого застосування внаслідок їх недостатньої стабільності, а також відсутності інтеграції трансгену в геном.

1. Метод мікроін'єкції, спочатку розроблений для отримання трансгенних мишей, став першим прийомом, успішно застосованим для створення трансгенних сільськогосподарських тварин. Суть методу полягає у введенні розчину генних конструкцій у формі лінійних молекул ДНК в чоловічій пронуклеус зигот. Незважаючи на те, що метод вимагає високої кваліфікації і дорогого обладнання, простота і надійність окупають всі його недоліки.

Першою і найбільш добре розробленою експериментальною системою для отримання трансгенних тварин стала миша. Донорних самок мишей з експериментальною суперовуляцією схрещують з самцями-виробниками, через 12 годин виділяють запліднені яйцеклітини і поміщають їх в культуру. Далі в більший з їх двох пронуклеусів (зазвичай чоловічий) ін'єктують рекомбінантну ДНК.

Яйцеклітини, що пережили ін'єкцію, пересаджують самкам-реципієнтам. Тільки частина трансплантованих ооцитів продовжує розвиватися до народження мишат. На частоту інтеграції екзогенної ДНК при використанні методу мікроін'єкції впливають такі фактори, як чистота зразка, що вводиться, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину для мікроін'єкції, якість ембріонів, а також спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (нехірургічний, хірургічний, лапароскопічний). Трансгенних тварин в потомстві ідентифікують різними методами, найчастіше ПЛР, і схрещують для отримання трансгенних ліній. Деякі з трансгенних тварин виявляються мозаїчними (статеві клітини не містять екзогенної ДНК), тому при схрещуванні трансгенним виявляється менша частина потомства першого покоління, ніж розрахункові 50%. У ряді випадків гомозиготні лінії отримати не вдається, оскільки 5-15% трансгенних включень в гомозиготному стані летальні, так як включення іноді порушує життєво-важливі частини генома.

Точний механізм, що забезпечує інтеграцію ін'єктованої ДНК в хромосоми клітини-мішені, невідомий, проте аналіз структури вбудованої ДНК дозволяє виявити деякі моменти. Інтеграція відбувається випадковим чином в один хромосомний локус, який може містити від одного до декількох тисяч тандемних копій інтегрованої ДНК. Близько 30% отриманих первинних трансгенних тварин, як правило, виявляють ту чи іншу ступінь мозаїчності, що може бути наслідком інтеграції екзогенної ДНК після завершення першого циклу реплікації.

Незважаючи на досягнуті в області трансгенезу успіхи, ефективність (число отриманих трансгенних тварин від числа пересаджених ембріонів) класичного методу мікроін'єкції залишається дуже низькою і варіює від 0,5% у великої рогатої худоби до 1,0-2,0% у кроликів. У свиней, овець і кіз результативність методу мікроін'єкції становить 0,5-1,0%.

Метод мікроін'єкції в пронуклеус залишався домінуючим в створенні трансгенних сільськогосподарських тварин до середини 90-х років XX століття і був практично повністю витіснений методом пересадки ядер соматичних клітин, генетично трансформованих in vitro. В останні роки, завдяки досягненням у розвитку сайт-специфічних ендонуклеаз метод мікроін'єкції в зиготи з деякими модифікаціями отримує своє новий розвиток.

2. Використання модифікованих ембріональних стовбурових клітин. Іншим, використовуваним на сьогодні методом створення трансгенних тварин, є трансгенез через модифіковані стовбурові клітини. Для того, щоб зрозуміти, як відбувається трансгенез, потрібно знати природу стовбурових клітин. Стовбуровою клітиною вважають недиференційовану примітивну клітину, особливою ознакою якої є здатність до двох типів поділу: симетричного і асиметричного. За симетричного поділу із материнської клітини утворюються дві однакові недиференційовані клітини. За асиметричного поділу одна із дочірніх клітин залишається стовбуровою, водночас як інша - дочірня клітина стає на шлях диференціації у клітину спеціалізованої тканини. До тих пір, поки клітина залишається здатною до обох типів поділу, вона вважається стовбуровою.

Залежно від походження існує декілька типів стовбурових клітин:

- тотипотентні стовбурові клітини (всемогутні - тоти, тотальні, потентні - могутні), які можуть диференціюватися у будь-які типи клітин. Такими клітинами вважаються ембріональні стовбурові клітини.

- плюрипотентні (тканинно-специфічні) клітини, які можуть диференціюватися у різні типи клітин в межах однієї тканини. Наприклад, стовбурові клітини крові диференціюють у еритроцити, лейкоцити та тромбоцити, а нервові стовбурові клітини диференціюють у нейрони, гліальні клітини астроглії, олігодендроглії, епендими та мікроглії;

- уніпотентні клітини можуть перетворюватися лише на один тип клітин. Це клітини епітелію, м'язові, а також статеві стовбурові клітини.

Ембріональні стовбурові клітини (ЕСК) утворюються з внутрішньої клітинної маси на ранній стадії розвитку зародка - бластоцисти. Зародок людини досягає стадії бластоцисти на стадії 4-5 днів після запліднення, бластоцист людини складається з 50-150 клітин.

Уперше лінія ембріональних стовбурних клітин (ЕСК) була отримана із бластоцист миші М. Евансом, М. Кауфманом і Г. Мартіном у 1981 році. Клітини, виділені з ембріонів мишей на стадії бластоцисти, можуть проліферирувати (рости і розмножуватися) у культурі.

Ембріональні стовбурові клітини є плюрипотентними. Це означає, що вони можуть диференціюватися в усі три первинні зародкові листки: ектодерму, ентодерму і мезодерму. Таким чином утворюються більш 220 видів клітин. Властивість плюрипотентності відрізняє ембріональні стовбурові клітини від поліпотентних клітин, які можуть дати початок лише обмеженій кількості видів клітин. У відсутність стимулів до диференціації in vitro, ембріональні стовбурові клітини можуть підтримувати плюрипотентність протягом багатьох клітинних поділів. Наявність плюрипотентних клітин у дорослого організму залишається об'єктом наукових дискусій, хоча дослідження показали, що існує можливість утворення плюрипотентних клітин з фібробластів дорослої людини.

Зважаючи на пластичність і потенційно необмежений потенціал самовідновлення, ембріональні стовбурові клітини мають перспективи застосування в регенеративній медицині та заміщенні пошкоджених тканин. Однак у даний момент не існує жодного медичного застосування ембріональних стовбурових клітин. Стовбурові клітини дорослих організмів і стовбурові клітини спинного мозку використовуються для терапії різних захворювань. Деякі захворювання крові та імунної системи (у тому числі генетичні) можуть бути вилікувані такими неембріональними стовбуровими клітинами. Розробляються методи лікування за допомогою стовбурових клітин таких патологій, як онкологічні захворювання, юнацький діабет, синдром Паркінсона, сліпота і порушення роботи спинного мозку.

Існують як етичні, так і технічні труднощі, пов'язані з трансплантацією гематопоетичних стовбурових клітин. Ці проблеми пов'язані, в тому числі, з гістосумісністю. Такі проблеми можуть бути дозволені при використанні власних стовбурових клітин або шляхом терапевтичного клонування.

Тотіпотентність - здатність утворювати будь-яку клітину з приблизно 350 типів клітин організму (у ссавців).

Хоумінг - здатність стовбурових клітин, при введенні їх в організм, знаходити зону пошкодження і фіксуватися там, виконуючи втрачену функцію.

Фактори, які визначають унікальність стовбурових клітин, знаходяться не в ядрі, а в цитоплазмі. Це надлишок мРНК всіх 3 тисяч генів, які відповідають за ранній розвиток зародка.

В даний час лінії плюрипотентних клітин людини отримують з двох джерел за допомогою методів, відпрацьованих на тваринних моделях:

а) плюрипотентні клітини виділяють безпосередньо з внутрішньої клітинної маси ембріона людини на стадії бластоцисти. Сам ембріональний матеріал отримували у великих кількостях в клінічних, а не дослідницьких цілях для здійснення екстракорпорального запліднення, щоразу просячи дозвіл на його використання у обох донорів. Клітини внутрішньої клітинної маси культивували і отримували лінію плюрипотентних клітин.

б) Інша група дослідників виділяла плюрипотентні клітини з тканини плоду. Дозвіл на це давалося обома подружжям вже після того, як вони самі прийняли рішення перервати вагітність. Клітини відбиралися з тієї області плоду, яка повинна була розвинутися в яєчники або насінники.

Незважаючи на те що плюрипотентні клітини в двох зазначених випадках походили з різних джерел, отримані клітинні лінії були ідентичними.

Ще одним способом отримання плюрипотентних клітин може стати метод, заснований на перенесенні в енуклеїрованну (позбавлену ядра) яйцеклітину ядра соматичної клітини. Відповідні досліди вже проведені на тваринах. Сама яйцеклітина з новим ядром і її безпосередні «нащадки» здатні за відповідних умов розвинутися в повноцінний організм, тобто є тотіпотентними. З них формується бластоциста, яка і служить джерелом плюрипотентних клітин.

Як і за використання ЕСК, даний метод дозволяє проводити аналіз інтеграції в культурі клітин, а також здійснювати цілеспрямоване вбудовування генних конструкцій у бажані ділянки генома. Крім того, використані клітинні лінії можуть бути каріотипізовані в культурі, що дозволить заздалегідь визначати стать трансгенних тварин. Якщо, наприклад, потрібно отримати тварин, що синтезують рекомбінантні білки в молочній залозі, то доцільне народження первинних трансгенних особин жіночої статі, що уможливлює їхнє безпосереднє тестування на наявність експресії. Після одержання трансгенних тварин з різних клітинних ліній і визначення рівня експресії може бути зроблений відбір бажаних клонів для їх подальшого використання у пересадках ядер. ЕСК відкрили нові можливості для створення тварин як з додатково введеними генами, так і з генами, що виключенні. Виключення у тварини певного гена називають генним нокаутом або генним таргетингом. Нормальний ген в ЕСК замінюється на «зламану» копію, що містить вставку - послідовність, що кодує білок неоміцинтрансферазу. У результаті такої транслокації в клітині відбуваються дві події: по-перше, через вставку зрушується рамка зчитування й білок, що кодується за цим геном, не синтезується, а, по-друге, експресія вставленого гена неоміцинтрансферази робить клітину стійкою до впливу неоміцину. При здійсненні нокауту в культурі ЕСК відсоток клітин із транслокацією дуже низький, але тільки вони виживають у селективному середовищі, що містить антибіотик неоміцин.

У першу чергу технологія таргетингу зробила суттєвий внесок у генетику миші та аналіз різних аспектів функції генів in vivo. Внаслідок використання таргетингу генів були створені чисельні трансгенні миші із різноманітними цілеспрямованими змінами генів, починаючи від точкових мутацій і закінчуючи хромосомними перебудовами (рис. 36). Таким чином, генний нокаут, як і перенесення генів, мітохондрій і цілих хромосом, дозволяє не тільки визначати функцію гена, а й модулювати деякі патології людини. У наш час цей прийом стає одним із ключових у молекулярній генетиці. Його надзвичайна важливість на даному етапі досліджень визначається масовим переходом від досліджень щодо структурної генетики до функціональної генетики.

Виділення плюрипотентних клітин людини відкриває нові можливості перед дослідниками, які займаються пошуками нових лікарських речовин і їх тестуванням. Різноманітні клітинні лінії (наприклад, лінії ракових клітин) використовуються в цих цілях вже зараз, а культура плюрипотентних клітин дозволяє проводити тестування відразу на декількох типах клітин. Це не замінює тестування на рівні цілого організму, але значно полегшує пошук нових лікарських речовин.

Одне із самих вражаючих застосувань плюрипотентних клітин людини - це так звана «клітинна терапія». Багато захворювань людини обумовлюються порушенням функціонування клітин або цілих органів, і сьогодні для усунення дефекту в таких випадках використовується метод трансплантації. На жаль, нерідко пошкодження носять множинний характер, і замінити всі порушені ними органи не представляється можливим. Плюрипотентні клітини, стимульовані до диференціювання з утворенням строго спеціалізованих клітин, можуть служити поновлюваним джерелом не порушених ураженням клітин, що заміщають ті, що вибули з ладу дефектні клітини. Це відкриває широкі можливості для лікування найрізноманітніших захворювань людини, включаючи такі серйозні, як хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера, серцево-судинні захворювання, ревматоїдний артрит, діабет та інші.

Незважаючи на всю перспективність описаного підходу, пройде ще чимало часу, перш ніж його вдасться застосувати в клініці. По-перше, необхідно з'ясувати, які події передують переходу клітини в організмі людини до стадії диференціювання; тільки тоді ми зможемо цілеспрямовано змінювати хід подій, щоб отримати з плюрипотентних клітин саме ті, які потрібні для трансплантації. По-друге, перш ніж вводити культивовані клітини в організм людини, слід вирішити проблему імунологічного відторгнення. Оскільки плюрипотентні клітини, взяті з бластоцисти або тканини плоду, навряд чи будуть ідентичні клітинам реципієнта, необхідно навчитися модифікувати їх для мінімізації цієї відмінності або створити банк тканин.

У деяких випадках проблему несумісності вдається вирішити, використовуючи метод перенесення ядра соматичної клітини. Припустимо, що пацієнт страждає прогресуючою серцевою недостатністю. Якщо взяти у нього будь-яку соматичну клітину і ввести її ядро в енуклеїровану яйцеклітину-реципієнт, ми отримаємо химерну яйцеклітину, у якої практично весь генетичний матеріал ідентичний такому як у пацієнта. З неї можна отримати бластоцисти, а потім, відібравши клітини внутрішньої клітинної маси, - плюрипотентні клітини. Останні можна стимулювати до утворення клітин серцевого м'яза, ідентичних в генетичному відношенні нормальним клітинам пацієнта, і імплантувати їх хворому без необхідності піддавати його імуносупресорній терапії, чреватої серйозними наслідками.

Ще більш вражаюче застосування стовбурових клітин людини - генна терапія ex vivo. У цьому випадку в організм хворого можна інфузувати не звичайні стовбурові клітини, а генетично модифіковані, які заміщають дефектні клітини або заповнюють недолік продукту того гена, який включений в геном інфузуючих клітин. Стовбурові клітини можна отримувати від самого пацієнта або від сумісних з ним донорів. Слід зазначити, однак, що генна терапія ex vivo із застосуванням стовбурових клітин людини робить лише перші кроки.

Набагато більш реальним є використання модифікованих ембріональних стовбурових клітин для створення трансгенних тварин. Відповідні експерименти вже широко проводяться на мишах. Спочатку одержують ембріональні стовбурові клітини з внутрішньої клітинної маси бластоцисти миші. Їх генетично модифікують (трансформують) за допомогою вектора, який несе потрібний ген (трансгени), культивують і відбирають тим або іншим способом. Популяцію трансфіцированих клітин знову культивують і вводять в бластоцисти, які потім імплантують в матку «сурогатної» матері. Схрещуючи тварин, що несуть трансгени в клітинах зародкової лінії миші, отримують лінію трансгенних мишей. У геном стовбурової клітини можна не тільки вмонтувати корисний ген, що кодує який-небудь необхідний організму продукт, але й спрямованим чином вивести з ладу («нокаутувати») ген, що кодує, наприклад, який-небудь токсин. Трансгенних мишей з порушеннями в певному гені широко використовують в якості моделі для вивчення захворювань людини на молекулярному рівні

3. Пересадка ядер соматичних клітин (SCNT), генетично трансформованих in vitro. У генетиці та біології розвитку ядерний перенос соматичних клітин (SCNT) - це лабораторна стратегія створення життєздатного зародка з клітини тіла та яйцеклітини. Методика полягає у взятті енуклейованого ооцита (яйцеклітини) та імплантації донорського ядра із соматичної (тілесної) клітини. Застосовується як для терапевтичного, так і для репродуктивного клонування.

Цей метод є сьогодні найбільш часто використовуваним способом отримання трансгенних сільськогосподарських тварин. Можливість отримання життєздатного потомства за допомогою SCNT, культивованих in vitro, вперше була продемонстрована на вівцях з використанням в якості донорів ядер клітин молочної залози. Трохи пізніше та ж група повідомила про отримання трансгенних овець за допомогою пересадки ядер стабільно трансформованих первинних фетальних (ембріональних) фібробластів. Ефективність трансгенезу становила 100%, в той час як застосування методу мікроін'єкції в тій же лабораторії дозволяло отримувати лише 4,35% трансгенних нащадків від числа народжених тварин.

У процесі ядерної трансплантації соматичних клітин беруть участь дві різні клітини. Перша - жіноча гамета, відома як яйцеклітина (яйцеклітина / ооцит). У експериментах SCNT на людях ці яйцеклітини отримують за згодою донорів, використовуючи стимуляцію яєчників. Друга - соматична клітина, що відноситься до клітин людського тіла. Клітини шкіри, жирові клітини та клітини печінки - лише кілька прикладів. Генетичний матеріал донорської яйцеклітини видаляється і викидається, залишаючи його "депрограмованим". Залишилась соматична клітина та енуклейована яйцеклітина. Потім вони зливаються шляхом вставки соматичної клітини в «порожню» яйцеклітину.

Після введення в яйцеклітину ядро соматичної клітини перепрограмується яйцеклітиною-господарем. Яйцеклітина, яка зараз містить ядро соматичної клітини, стимулюється шоком і почне ділитися. Яйцеклітина тепер життєздатна і здатна виробляти дорослий організм, що містить всю необхідну генетичну інформацію лише від одного з батьків. Розвиток відбуватиметься нормально, і після багатьох мітотичних поділів одна клітина утворює бластоцисту (ранній етап ембріона з приблизно 100 клітинами) з ідентичним геномом вихідного організму (тобто клону). Тоді стовбурові клітини можна отримати шляхом знищення цього клонового ембріона для використання в терапевтичному клонуванні або у випадку репродуктивного клонування ембріон клону імплантують матері-хазяїну для подальшого розвитку і доводять до терміну.

У 1996 році вівця Доллі прославилася тим, що стала першим успішним випадком репродуктивного клонування ссавців. У січні 2018 року команда вчених у Шанхаї оголосила про успішне клонування двох яєць крабоїдних макак (на ім'я Чжун Чжун і Хуа Хуа) з ядер плода.

"Терапевтичне клонування" стосується потенційного використання SCNT в регенеративній медицині; цей підхід відстоювався як відповідь на багато питань, що стосуються ембріональних стовбурових клітин (ESC) та знищення життєздатних ембріонів для медичного використання, хоча залишаються питання про те, наскільки справжніми є два типи клітин.

Ядерна трансплантація соматичних клітин стала предметом вивчення досліджень стовбурових клітин. Метою проведення цієї процедури є отримання плюрипотентних клітин із клонованого ембріона. Ці клітини генетично відповідали донорському організму, з якого вони походили. Це дає їм можливість створювати специфічні для пацієнта плюрипотентні клітини, які потім можуть бути використані в терапії або дослідженнях захворювань.

4. Ретровірусні і лентивірусні вектори є ще одним ефективним інструментом для введення генів у ембріональні лінії тварин: вони здатні стабільно інтегруватися в геном клітина-хазяїн; відносно невеликі розміри геному вірусів дозволяють легко з ними маніпулювати in vitro; внутрішні послідовності геному можуть бути видалені таким чином, що всі функції, необхідні для реплікації, будуть надані in trans; використовуючи поверхневі глікопротеїни вірусу, тропний до широкого спектру господарів, можна інфікувати гібридними вирионами практично будь-який вид і тип клітин хребетних. трансгенний вибірковий розведення тварина ген клітина

Інфікування передімплантаційних ембріонів рекомбінантними ретровірусами - відносно нескладна ефективна процедура. Восьмиклітинну морулу звільняють від прозорої оболонки і поміщають в культуральну чашку з фібробластами, що продукують рекомбінантний ретровірус.

Інфіковані ембріони, які досягли стадії бластоцисти, імплантують псевдовагітним самкам. В результаті формуються трансгенні організми, мозаїчні по числу і локалізації вбудованих рекомбінантної ДНК в геном. Тому для отримання чистих ліній далі необхідний масштабний аутбридинг.

Недоліком методу є обмеження розміру вставки екзогенної ДНК, внаслідок чого трансген може виявитися позбавленим прилеглих регуляторних послідовностей, необхідних для його експресії, а в деяких випадках інтеграція у вихідний локус нестабільна.

Нові лентивірусні вектори (лентивіруси належать сімейству ретровірусів) показали дуже високу ефективність при доставці ДНК в ооцити і зиготи. Ін'єкція рекомбінантних лентивірусних конструкцій в перивітелліновий простір свинячих зигот і коров'ячих ооцитів призвело до появи потомства з найвищою на даний момент часткою трансгенних особин.

Принципові відмінності між двома вищезгаданими типами векторів полягають в тому, що ретровірусні вектори можуть інтегруватися тільки в клітини, що активно діляться, в той час як лентивіруси здатні реплікуватися як в клітинах, що діляться, так і в клітинах, що не діляться.

У той же час лентивірусні вектори володіють усіма недоліками ретровірусних: малий розмір вставки екзогенної ДНК і множинна інтеграція в хазяйський геном, яка може привести до таких небажаних побічних ефектів, як активація онкогенів і інсерційний мутагенез. Крім того, для лентивірусних векторів спостерігається високий ступінь мозаїчності одержуваного трансгенного потомства і окремі факти сайленсингу (інактивації) лентивірусних рекомбінантних послідовностей в отриманих трансгенних лініях.

Використання ретровірусних векторів має і ще один великий недолік. Хоча ці вектори створюються так, щоб вони були дефектними по реплікації, геном штаму ретровірусу (вірусу-помічника), який необхідний для отримання великої кількості векторної ДНК, може потрапити в те ж ядро, що і трансген. Незважаючи на всі вжиті заходи, ретровіруси-помічники можуть реплікуватися в організмі трансгенної тварини, що абсолютно неприпустимо, якщо цих тварин передбачається використовувати в їжу або як інструмент для отримання комерційного продукту. І оскільки існують альтернативні методи трансгенезу, ретровірусні вектори рідко використовуються для створення трансгенних тварин, що мають комерційну цінність.

Успіхи в отриманні трансгенної великої рогатої худоби показали, що ретровірусні вектори можуть служити хорошою альтернативою для ефективного трансгенезу у сільськогосподарських тварин. Хоча лентивірусні вектори були ефективно використані для отримання трансгенних свиней, корів і курей, їх широке застосування на сільськогосподарських тварин розглядається, головним чином, в області генотерапії.

5. Використання сперміїв в якості переносників ДНК (обумовлений сперміями перенесення генів, SMGT) розглядається як один з перспективних підходів генетичної модифікації тварин. Як природний вектор, що доставляє ДНК до клітин, можуть бути використані сперматозоїди. Вже в 1971 році була показана можливість перенесення ДНК SV40 до яйцеклітин кролів після штучного запліднення спермою, що попередньо інкубувалася із ДНК.

У досвідах М. Лавітрано зі співавторами (1989) 30% мишей, отриманих після запліднення обробленої ДНК спермою, виявилися трансгенними й передавали трансген нащадкам. Наступні численні спроби в інших лабораторіях в усьому світі виявилися неуспішними. Аналіз 1300 мишей, що народилися після запліднення in vitro обробленої ДНК спермою, не виявив наявності трансгена в жодної з досліджених особин. Дослідження показали, що за застосування методу переносення ДНК за допомогою сперматозоїдів у одній і тій же лабораторії, навіть за використання однакової схеми досліджень, можуть бути отримані суперечливі результати. Це дозволяє припустити, що вбудовування ДНК відбувається тільки на певній стадії клітинного циклу. Однак дотепер не встановлений механізм інтеграції екзогенної ДНК у геном сперматозоїдів.

Досліджували так само здатність сперматозоїдів поглинати лінійну ДНК in vitro і in vivo. Наявність чужорідної ДНК було показано в 60…70% сперматозоїдів після обробки in vitro і in vivo. Позитивний сигнал був виявлений у ядрі сперміїв і не зникав за обробки ДНК-азою. Таким чином, було показано, що сперматозоїди як in vitro, так і in vivo здатні поглинати ДНК і акумулювати її в ядрі, а також те, що секрети придатків і сім'яних канальців не блокують цей процес. Для підвищення ефективності зв'язування ДНК зі сперматозоїдами використовують різні методи: ДНК-ліпосомні комплекси, ін'єкцію в сім'яники, безпосередню ін'єкцію в сім'яні канальці й придатки, ін'єкцію в сім'яні канальці з наступною електропорацією, доін'єкцію головок сперміїв і ДНК в ооцити. Використання сперматозоїдів як носіїв для трансгена здатне забезпечити інтродукцію їх у геном зародка в найбільш оптимальний для цього період. Однак, це залежить від місця, в яке потрапляє чужорідна ДНК.

Установлено, що для бугаїв і кнурів здатність до зв'язування трансгена обмежена головним чином екваторіальною зоною і постакросомальним районом головки сперматозоїда. Потрапляння чужорідної ДНК в залишки цитоплазми в основі хвоста не призводить до трансгенозу. Сперматозоїди мають спонтанну тенденцію до зв'язування трансгена, що присутній в культуральному середовищі. Експерименти показали, що з'єднання чужорідної ДНК і її проникнення в головку сперматозоїда можливе лише в тому разі, коли сім'яна плазма ретельно віддалена.

Однак незважаючи на хороші результати у використанні чоловічих статевих клітин для отримання трансгенних мишей, а також окремі успішні спроби отримання трансгенних свиней і великої рогатої худоби, яких-небудь значних успіхів в отриманні трансгенних сільськогосподарських тварин за допомогою трансформованих сперматогоніїв і спрямовує до теперішнього часу досягнуто не було.

Трансфекція клітин за допомогою фосфату кальцію є одним із методів введення рекомбінантних ДНК, що найбільш широко використовується, але важко відтворюються. Розчин СаСl2 поряд із ДНК, що в ньому міститься, повільно змішують із фосфатним буфером, внаслідок чого утворюється нерозчинний фосфат кальцію і одночасно відбувається осадження ДНК. Суспензія вноситься у чашки Петрі, де культивуються клітини. Через деякий час часточки фосфату кальцію, що містять ДНК, сорбуються на поверхні клітин і проникають усередину внаслідок ендоцитозу. У подальшому незначна фракція рекомбінантної ДНК з'являється в ядрі, де може бути інтегрованою до хромосоми або деякий час існувати у позахромосомному стані. Метод дуже простий у реалізації, однак дуже чутливий до умов здійснення експерименту (концентрації ДНК і СаСl2, значенням рН, тривалості трансфекції) і тому важко відтворюється. Надмірна тривалість інкубації клітин з фосфатом кальцію викликає його цитотоксичний вплив. З урахуванням цього, для кожної лінії клітин потрібне здійснення ретельної оптимізації умов.

Ліпосоми і трансфекція. Використання ліпосом є ще одним ефективним, популярним і універсальним методом уведення рекомбінантних ДНК до клітин тварин і людини. Для створення ліпосом найчастіше використовують катіонні ліпіди, що є амфіфільними (здатними приєднувати з обох боків) молекулами, які самоасоціюються і у присутності ДНК, завдяки електростатичним та іншим взаємодіям, конденсуються у часточки, що дістали назву ліпоплекси (lipoplexes). Ліпоплекси, що несуть сумарний позитивний заряд, взаємодіють із сіаловими кислотами клітинних мембран і забезпечують ефективне проникнення ДНК усередину клітини в процесі ендоцитизу.

Незважаючи на те, що більшість ДНК, яка потрапила у лізосоми, деградує, значна їх фракція доставляється в ядро клітин, що трансфекуються. Для отримання ліпоплексів катіонні ліпіди і ДНК змішують у безсироватковому поживному середовищі, оскільки сироватка запобігає їх об'єднанню, і клітини, що культивуються, короткочасно інкубують в їх присутності. Метод дозволяє здійснювати як тимчасову, так і постійну трансфекцію з утворенням стабільних клітинних ліній. За допомогою ліпосом вдається здійснити трансфекцію у складних випадках тих клітинних ліній, які не піддаються введенню рекомбінантних ДНК іншими способами. Більш того, даний метод допускає проведення трансфекції у суспензійних культурах, не потребує мітотичного поділу клітин під час проведення експерименту і, як правило, високо відтворювальний.

6. Штучні хромосоми людини (ШХЛ), містять цілком імуноглобуліновий локус людини з важкими і легкими ланцюгами, були впроваджені в бичачі фібробласти, які потім використовували для соматичного ядерного перенесення. Отримані транс-хромосомальні телята, що експресували імуноглобуліни людини в своїй крові. Ця система стала важливим кроком у напрямку тваринної продукції терапевтичних поліклональних антитіл людини. Подальші спостереження за трансгенними тваринами показали, що рекомбінантні ШХЛ підтримувалися в більшості особин першого покоління протягом декількох років. Чи будуть отримані штучні хромосоми відповідним чином розділятися в процесі мейозу і успадковуватися, ще тільки належить з'ясувати.

Незважаючи на розроблений широкий спектр методик отримання трансгенних тварин, в даний час поки відсутня надійна і ефективна технологія трансгенезу тварин. Найбільші проблеми пов'язані з безладним вбудовуванням екзогенної ДНК в геном при використанні більшості існуючих методів. Так що подальші якісні поліпшення технології необхідні в області розробки прицільної модифікації клітинних генів і точного вбудовування екзогенної ДНК в геном. Тим більше, що геноми більшості господарсько важливих організмів до теперішнього часу повністю секвеновані і можна планувати майбутню структуру трансгенного організму. Поєднання повністю розшифрованих послідовностей геномів з методами адресної доставки екзогенної ДНК дозволить проводити цілеспрямоване конструювання трансгенних геномів із заздалегідь заданими властивостями.

7. Прогрес в області геномної інженерії сільськогосподарських тварин в даний час пов'язують з розвитком технологій так званого активного трансгенезу, які за допомогою екзогенних ферментів або кодують їх ДНК забезпечують можливість спрямованої (сайт-специфічної) інтеграції з метою привнесення нових функцій (gain-of-function) або, навпаки, втрати функцій (loss-of-function). Як інструменти в технологіях активного трансгенеза знаходять застосування системи ДНК-транспозони і сайт-специфічних ендонуклеаз.

ДНК-транспозони або транспозони другого типу - це мобільні генетичні елементи, які переміщаються по геному хазяїна, використовуючи механізм «вирізати - вставити». Вони включають послідовність білка транспозази, яка фланкирована інвертованими термінальними повторами (ITRs), що несуть сайти зв'язування транспозази. Будь-які послідовності ДНК, фланкірований ITRs, будуть дізнаватися траспозазою і ензиматично інтегруватися в ядерну ДНК. Транспозази знайшли широке застосування для трансгенезу і інсерційного мутагенезу безхребетних.

Першим транспозоном, що володіє достатньою активністю для використання на хребетних, був розроблений в Університеті Міннесота в 1997 році транспозон «Спляча красуня», який отримав свою назву через флуоресценцію, яку забезпечує ген, включений в транспозон додатково до цільового гену.

Основною перевагою використання транспозонів для трансгенезу є їх інтеграція в області еухроматину, що запобігає сайленсінг трансгенів, що спостерігається при випадковій інтеграції в області гетерохроматину. Крім того, використання траспозонів характеризується високою ефективністю і однокопійністю інтеграції. Результативне отримання трансгенних свиней з використанням транспозони було досягнуто як при використанні методу мікроін'єкції, так і методу SCNT.

Однак якщо поросята, отримані методом мікроін'єкції несли тільки специфічні транспозони, то в геномі клонованих поросят виявлялись множинні інтеграційні події, а також випадково інтегровані плазмідні копії, що обмежує потенційну значимість таких тварин.

Серед сайт-специфічних нуклеаз спочатку для трансгенезу тварин, головним чином, з метою нокауту генів набули поширення так звані нуклеази «цинкових пальців» (ZFN), ефекторні нуклеази, подібні активаторам транскрипції (TALEN) і хомінгмегануклеази, що індукують в цільових послідовності генома мутації в формі інсерції або делеції невеликого розміру за допомогою репарації розривів ДНК негомологічних з'єднань кінців (NHIJ) або гомологічній рекомбінації. Використовуючи технології ZNF і TALEN, був успішно «вимкнений» ген б-1,3-галактозилтрансферази (GGTA1) у свиней, що є першим кроком у створенні трансгенних свиней - донорів.

Слід, однак, відзначити, що суттєвим недоліком ZFN і TALEN є висока трудомісткість конструювання рекомбінантних векторів і дорожнеча на тлі несуттєвої переваги в порівнянні з традиційною технологією нокауту.

1.8. Нову епоху в області трансгенезу тварин пов'язують із застосуванням для геномної інженерії ссавців системи CRISPR / Cas9, що включає короткі паліндромні повтори, розташовані групами рівномірно віддаленими одна від одної (CRISPR), і CAS9-нуклеази (CRISPR-асоційовані нуклеази). Впізнавання цільової ділянки ДНК в системі CRISPR / Cas9 засноване на використанні малих некодуючих направлених РНК (gRNA), які комплементарно взаємодіють з мішенню, маркуючи тим самим специфічну ділянку чужорідної ДНК для подальшого розрізання нуклеазами. На відміну від інших мегануклеаз при використанні системи CRISPR / Cas9, для таргетингу цільового гена потрібно конструювання короткого олігомера, в той час як для збірки ZNF і TALEN необхідні кілька послідовних кроків клонування. Завдяки своїй високій ефективності, а також простоті і малої трудомісткості, технологія знаходить все більш широке застосування. Крім того, вона може бути використана для одноступінчастої генерації мутацій в декількох генах одночасно, що неможливо жодним з раніше використовуваних методів. Висока ефективність системи CRISPR / Cas9 дозволяє ідентифікувати колонії клітин, що несуть множинні мутації генів за допомогою прямого скринінгу без використання при створенні системи селективних маркерів, що в подальшому виключає необхідність видалення останніх за допомогою реклонування або схрещування.

Хоча безпосередня модифікація геному на рівні зигот має ряд переваг, дана стратегія може призводити до отримання гіпоморфних мутацій, які не здатні передаватися потомству, або тварин-мозаїки, які потребують додаткового кроку розведення для отримання гомозиготних особин. Метод SCNT, навпаки, робить можливим виділення мутантних клітин перед початком дорогих експериментів на тварин і дозволяє гарантувати отримання тварин з запланованими модифікаціями генів. В даний час за допомогою CRISPR / Cas9 створені генетично модифіковані лінії фетальних фібробластів практично всіх основних видів сільськогосподарських тварин (великої рогатої худоби, свиней, кіз) з нокаутом і вставками цілого ряду генів.