Рост и физиологическое состояние морских зеленых микроводорослей Chlorella minutissima и Tetraselmis striata в условиях загрязнения среды обитания медью

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Национальный научный центр биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН

Дальневосточный федеральный университет

Рост и физиологическое состояние морских зеленых микроводорослей Chlorella minutissima и Tetraselmis striata в условиях загрязнения среды обитания медью

Ж.В. Маркина

Владивосток, Российская Федерация

Аннотация

Изучено действие меди в концентрациях 50, 100 и 150 мкг/л на рост популяции, флуоресценцию хлорофилла, содержание активных форм кислорода (АФК), мембранный потенциал митохондрий и содержание нейтральных липидов морских микроводорослей Chlorella minutissima и Tetraselmis striata (Chlorophyta) из зал. Петра Великого Японского моря. Рост C. minutissima стимулировался при концентрациях меди 50 и 100 мкг/л, T. striata -- 50 мкг/л. У обеих микроводорослей отмечено снижение показателя флуоресценции хлорофилла. У C. minutissima содержание АФК при внесении 50 мкг/л металла было ниже контрольного, а при 100 и 150 мкг/л не отличалось от такового. У T. striata содержание АФК увеличивалось при дозе меди 150 мкг/л. Мембранный потенциал митохондрий незначительно изменялся у C. minutissima при всех концентрациях меди и существенно снижался у T. striata при добавлении ее в количестве 100 и 150 мкг/л. Содержание нейтральных липидов увеличивалось при добавлении 50 мкг/л меди у C. minutissima, а при остальных концентрациях не отличалось от контроля. Токсикант во всех концентрациях приводил к снижению содержания нейтральных липидов у T. striata. Проведенные исследования показали, что T. striata более чувствителен к меди, чем C. minutissima. Концентрация меди 150 мкг/л выраженно более токсична, чем 50 и 100 мкг/л, для обеих водорослей.

Ключевые слова: загрязнение, медь, Chlorella minutissima, Tetraselmis striata, флуоресценция хлорофилла а, активные формы кислорода, митохондрии, нейтральные липиды.

Annotation

Growth and physiological state of marine green microalgae Chlorella minutissima and Tetraselmis striata in copper polluted environment.

Zh.V. Markina, A.V. Zhirmunsky national scientific center of marine biology, FEB RAS, Far Eastern Federal University, Vladivostok

.

Copper influence (in concentrations 50, 100 and 150 mkg/l) on population growth, chlorophyll a fluorescence, reactive oxygen species (ROS) content, mitochondrial membrane potential and neutral lipids content of marine microalgae from Chlorella minutissima and Tetraselmis striata (Chlorophyta) isolated from Peter the Great Bay (Sea of Japan) were investigated. C. minutissima growth stimulated at 50 and 100 mkg/l copper concentrations and T. striata - at 50 mkg/l. Both microalgae had decreased chlorophyll a fluorescence. C. minutissima ROS content in metal addition of 50 mkg/l were lower than control and at 100 and 150 mkg/l copper concentrations didn't differ from microalgae growing in pure environment. T. striata ROS content increasing at copper dose 150 mkg/l. Membrane potential of C. minutissima mitochondrion were slightly altered at all copper concentrations and the parameter of T. striata significantly decreased at its addition in the amount of 100 and 150 mkg/l substance. Neutral lipids of C. minutissima increased, during microalga exposition to 50 mkg/l copper, but other concentrations didn't alter the parameter. Toxicants in all concentrations lead to decreasing neutral lipids content in T. striata. This study revealed that T. striata more susceptible to copper that C. minutissima. Copper concentration 150 mkg/l significantly more toxic, than 50 and 100 mkg/l to both microalgae.

Key words: contamination, copper, Chlorella minutissima, Tetraselmis striata, chlorophyll a fluorescence, reactive oxygen species, mitochondria, neutral lipids.

Влияние тяжелых металлов на представителей водных экосистем привлекает огромное внимание исследователей с 60-х годов XX в. в связи с отравлениями людей, употреблявших в пищу морепродукты, выловленные или выращенные в загрязненной данными веществами среде. Наиболее изучаемыми в экотоксикологическом плане металлами являются кадмий, ртуть и медь [17, 18]. Первые два металла не являются эссенциальными, т.е. не участвуют в физиолого-биохимических реакциях, что обусловливает их высокую токсичность для организмов [12]. Медь, напротив, жизненно необходимый элемент, в том числе для растений: способствует образованию хлорофиллов, входит в состав пластоцианина (одного из переносчиков электронов между фотосистемами), участвует в ферментативных окислительно-восстановительных реакциях и азотном обмене, функционирует в цитохромоксидазном комплексе дыхательной цепи митохондрий [22]. Однако в высоких концентрациях она вызывает негативные эффекты, в том числе летальный [16]. Первичным токсическим действием данного металла на растительный организм является индуцирование продукции активных форм кислорода (АФК) [9]. Пристальное внимание к меди обусловлено также ее присутствием в разных типах сточных вод и, как следствие, большими объемами поступления в Мировой океан [18].

Увеличение содержания тяжелых металлов в водоемах в результате антропогенной деятельности приводит к их активному поглощению и накоплению в растениях, что отрицательно отражается не только на самих растениях, но и представляет серьезную угрозу здоровью человека и животных [22]. Одноклеточные водоросли являются источником питания для личинок беспозвоночных и взрослых двухстворчатых моллюсков, в том числе промысловых [1]. Это делает изучение действия меди на микроводоросли актуальным.

В экотоксикологической оценке микроводорослей базовым показателем является численность клеток [9]. Однако при неизменной или увеличивающейся величине этого показателя физиологические процессы в клетках могут быть угнетены. Наиболее часто измеряется флуоресценция хлорофилла а как показатель работы фотосинтетического аппарата - основного поставщика энергии растительной клетке [7]. В то же время состоянию митохондрий в токсической среде уделяется гораздо меньше внимания, хотя их работа также нарушается в стрессовых условиях [8, 19]. Известно, что стрессовые факторы наряду с физиологическими изменениями приводят к дефициту или накоплению некоторых веществ, например нейтральных липидов. Их метаболизм тесно связан с фотосинтезом, дыханием и другими физиологическими процессами [20].

Помимо выявления механизмов действия меди на микроводоросли и их органеллы, наиболее подверженные ее влиянию, что необходимо для пополнения данных об экологии видов, прогнозирования изменений в экосистемах, необходимо подобрать наиболее чувствительные показатели для оценки физиолого-биохимических нарушений для биотестирования природных вод с помощью микроводорослей, а также оценки токсичности веществ.

Действие меди на пресноводные одноклеточные зеленые водоросли исчерпывающе исследовано [9, 11, 16, 17], однако морским видам в данном плане все еще не уделяется должного внимания [5, 15], несмотря на их важную роль в экосистемах [21].

Для быстрой и качественной оценки состояния культур микроводорослей все чаще применяется проточная цитометрия, вошедшая в альгологическую практику более 30 лет назад [13]. На современном этапе она оснащена всем арсеналом методов флуоресцентного анализа компонентов клеток и происходящих в них процессов [2]. Измеряется автофлуоресценция хлорофилла а, применяются флуоресцентные красители для выявления физиологических и биохимических откликов на условия среды. Например, определение содержания липидов с помощью проточной цитометрии соответствует данным, полученным другими методами, что продемонстрировано на разных микроводорослях [13].

Цель настоящей работы заключалась в исследовании действия меди на динамику численности популяции, состояние фотосинтетического аппарата и митохондрий, содержание АФК и нейтральных липидов морских зеленых микроводорослей Chlorella minutissima и Tetraselmis striata.

Материал и методика исследования

Объектами исследования служили культуры одноклеточных водорослей из отдела Chlorophyta, выделенные из зал. Петра Великого (Японское море): Chlorella minutissima Fott et Novakova и Tetraselmis striata Butcher. Культуры микроводорослей Chlorella minutissima штамм MBRUCM-86 и Tetraselmis striata штамм MBRUP-86 предоставлены ресурсным центром «Морской биобанк» ННЦМБ ДВО РАН. Водоросли выращены на средеf приготовленной на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды соленостью 32%, в 250 мл колбах Эрленмейера с объемом культуральной среды 100 мл при температуре 18°С, интенсивности освещения 70 мкмоль/м²-с в области видимого света и свето-темновым периодом 14 ч свет: 10 ч темнота [4]. В качестве инокулята использовали культуры на экспоненциальной стадии роста. Начальная концентрация клеток C. minutissima - 20 * 10⁴ кл./мл, T. striata - 3,7 * 10⁴ кл./мл. Продолжительность экспериментов 7 сут. Пробы для проточно-цитометрического анализа отбирали через 3 и 7 сут опыта.

Медь добавляли в виде CuSO₄ * 5H₂O, концентрации (50, 100 и 150 мкг/л) указаны в пересчете на ионы меди. ПДК меди для морских вод России - 5 мкг/л, ее содержание достигает 50 мкг/л, уровень 150 мкг/л относится к категории «высокое загрязнение» [3].

Измерения всех показателей проведены на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter, США). Для анализа записано 10 000 событий (регистрируемых в пробе частиц) в течение каждого измерения. Выбор клеток водорослей из общего числа событий, регистрируемых цитометром, проводили по флуоресценции хлорофилла, а [13]. Проточно-цитометрический анализ выполнен в ННЦМБ ДВО РАН.

Интенсивность флуоресценции хлорофилла, а регистрировали на длине волны 690 нм, длина волны возбуждения составляла 488 нм [13]. Продукцию активных форм кислорода (АФК) оценивали с помощью флуоресцентного красителя 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата, окрашивание проводили в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Показатель флуоресценции его окисленного и диацетилированного продукта определяли на длине волны 525 нм, длина волны возбуждения 488 нм [10]. Для определения мембранного потенциала митохондрий использовали флуоресцентный краситель DiOC6(3), окрашивание проводили в течение 30 мин, длина волны возбуждения 488 нм, испускания - 525 нм [2]. Содержание нейтральных липидов определяли по флуоресценции флуорохрома Nile Red, окрашивание проводили в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, длина волны возбуждения 488 нм, испускания - 580 нм [6].

Эксперименты проведены в трех повторностях. Данные в виде средних значений и стандартных отклонений, выраженные в процентах к контролю, представлены на рисунке. За контроль приняты показатели, полученные без добавления меди.

медь зеленый микроводоросль митохондрия липид

Влияние разных концентраций меди на рост и физиологические показатели Chlorella minutissima и Tetraselmis striata было разнонаправленным (см. рисунок).

Медь оказывала как стимулирующий эффект на микроводоросли Chlorella minutissima и Tetraselmis striata при концентрации 50 мкг/л, так и ингибирующий при концентрации 150 мкг/л. Ранее было показано, что рост пресноводной зеленой водоросли Scenedesmus incrassatulus замедлялся через 6 сут экспозиции при 40 и 80 мкг/л этого металла [19].

Такую же реакцию на медь в концентрации 50-100 мкг/л проявила диатомея Phaeodactylum tricornutum [8]. Обнаруженное как нами, так и другими авторами снижение численности клеток при добавлении в среду меди обусловлено нарушением процессов фотосинтеза. В условиях интоксикации растительный организм может использовать энергию, предназначенную для роста, на другие клеточные процессы, необходимые для поддержания гомеостаза клетки

Численность и показатели физиологического состояния микроводорослей Chlorella minutissima и Tetraselmis striata при воздействии меди (% к контролю)

Кроме того, медь оказывает негативное действие на морфологию хромосом и клеточный цикл, что приводит к ингибированию клеточного деления [14].

Рост растений прежде всего зависит от эффективного поглощения солнечной энергии и ее трансформации в химическую, которая утилизируется в процессе фотосинтеза [19]. Снижение интенсивности флуоресценции хлорофилла, а у обеих микроводорослей в наших опытах может быть связано как с уменьшением количества пигмента (в результате ингибирования его синтеза, непосредственного разрушения, выхода из фотосинтетических мембран), так и с ингибированием процесса фотосинтеза в результате нарушения работы электрон-транспортной цепи фотосистем. Также медь способна заменять магний в молекуле хлорофилла а, делая его неспособным к фотосинтезу. Сбрасываемая энергия от таких поврежденных хлорофиллов может передаваться молекулярному кислороду, приводя к появлению синглетного кислорода, вызывающего окислительное повреждение [18], что также является одной из причин снижения флуоресценции хлорофилла а и изменения других физиологических показателей.

Проведенные опыты показали, что у C. minutissima добавление 50 мкг/л меди приводило к снижению содержания АФК. Так как данный процесс происходил одновременно с увеличением численности клеток, можно предположить, что эта концентрация является благоприятной для развития водоросли. У T. striata содержание АФК увеличивалось на 3-и сутки при концентрации 150 мкг/л металла. Показано, что с началом возрастания содержания АФК в клетках запускается активация генов, вовлеченных в пути детоксикации [23]. Вероятно, поэтому мы наблюдали снижение содержания АФК после его резкого увеличения при данных условиях к 7-м суткам опыта, что свидетельствует о включении адаптационных механизмов водоросли.

Функционирование митохондрий напрямую зависит от условий среды и энергетических потребностей клетки [16]. У C. minutissima в присутствии меди мембранный потенциал митохондрий увеличивался. Это также зарегистрировано у P tricornutum при добавлении 50 и 100 мкг/л, однако рост диатомеи ингибировался [8]. Мембранный потенциал митохондрий T. striata снижался при воздействии меди, что свидетельствует о деполяризации мембран. Возможно, большее воздействие меди на митохондрии T. striata связано с тем, что данный вид, в отличие от C. minutissima, является подвижным, а на поддержание двигательной активности требуется большее количество АТФ, и, соответственно, возрастает нагрузка на митоходрии. Такое же явление зарегистрировано у зеленой микроводоросли Pseudokirchneriella subcapitata при концентрации меди 80 мкг/л через 3 сут опыта [16]. При подавлении фотосинтеза микроводорослей в токсических условиях усиливается роль митохондрий в метаболических процессах. Например, активация дыхания является следствием потребления энергии для обеспечения детоксикации меди. Митохондрии C. minutissima и T. striata подверглись большему воздействию меди, чем хлоропласты. Однако H.V Perales-Vela с соавторами [19] указывают, что процессы, связанные с обеспечением дыхания растений, более устойчивы к меди, чем фотосинтез. Возможно, это обусловлено видовыми различиями, однако в настоящее время мало экспериментов, посвященных одновременному изучению митохондрий и хлоропластов, чтобы сделать однозначные выводы. Также имеются сведения, что медь влияет на мембраны митохондрий сильнее, чем другие металлы даже в больших концентрациях [16].

У водорослей при стрессовых условиях любой природы часто отмечается накопление нейтральных липидов, однако в настоящей работе, напротив, отмечено их уменьшение. Это может быть связано с их использованием для восполнения энергозатрат клетки в токсических условиях. На примере другого тяжелого металла - кадмия показано, что его содержание в среде приводит к снижению количества нейтральных липидов, даже разрушению липидных телец у микроводорослей [9, 17]. Известно также, что накопление нейтральных липидов уменьшается при высоком уровне АФК [17], что было наиболее ярко выражено у T. striata на 3-и сутки опыта при концентрации 150 мкг/л меди.

Выводы

Проведенные исследования показали, что вид Tetraselmis striata более чувствителен к действию меди в концентрациях 50-150 мкг/л, чем Chlorella minutissima. Одной из возможных причин этого может являться присутствие в составе клеточной оболочки Chlorella споропеллина, устойчивого к химическим воздействиям [1].

При концентрации 50 мкг/л рост обеих водорослей стимулировался, при 100 мкг/л у C. minutissima он продолжился, а у T. striata слабо ингибировался. Концентрация 150 мкг/л приводила к гибели части популяции T. striata.

Флуоресценция хлорофилла а уменьшалась к концу опыта у обеих водорослей при всех концентрациях токсиканта.

Содержание АФК у C. minutissima выраженно уменьшалось при концентрации 50 мкг/л. Самое большое его увеличение происходило при 150 мкг/л у T. striata. В остальных случаях отмечались незначительные колебания показателя.

Мембранный потенциал митохондрий при добавлении меди увеличивался или оставался неизменным у C. minutissima и снижался у T. striata.

Содержание нейтральных липидов у C. minutissima увеличивалось при 50 мкг/л к концу опыта и оставалось неизменным при остальных концентрациях меди. У T. striata во всех случаях показатель был ниже контрольного уровня. Снижение содержания нейтральных липидов у водорослей, особенно в сочетании с уменьшением их численности, может являться дополнительной причиной (помимо непосредственной интоксикации медью) гибели организмов, чьей кормовой базой являются микроводоросли, например моллюсков и личинок беспозвоночных.

Таким образом, по увеличению чувствительности к влиянию меди исследованные показатели можно расположить в следующий ряд: флуоресценция хлорофилла а < численность клеток < содержание нейтральных липидов = содержание АФК < мембранный потенциал митохондрий. То есть такой широко используемый вследствие быстроты анализа критерий оценки, как флуоресценция хлорофилла а, является самым малоинформативным. В связи с этим рекомендуется или сочетать его с другими, или выбирать для оценки качества морских вод и токсичности веществ с помощью микроводорослей иные показатели, например мембранный потенциал митохондрий.

Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории клеточных технологий ННЦМБ ДВО РАН за помощь в работе.

Литература

1. Ботаника: курс альгологии и микологии / под ред. Т.Ю. Дьякова. М.: МГУ, 2007. 559 с.

2. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в медицине и биологии. 2-е изд., доп. и расшир. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2014. 576 с.

3. Качество морских вод по гидрохимическим показателям. Ежегодник. 2016 / под ред. А.Н. Коршенко. М.: Наука, 2017. 190 с.

4. Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А., Стоник И.В. Лабораторное культивирование морских микроводорослей, включая продуцентов фитотоксинов: науч.-метод. пособие. Владивосток: Дальнаука, 2011. 89 с.

5. Adams M.S., Dillon C.T, Vogt S., Lai B., Stauber J., Jolley D.F. Copper uptake, intracellular localization and speciation in marine microalgae measured by synchrotron radiation X-Ray fluorescence and absorption microspectroscopy // Environ. Sci. Technol. 2016. Vol. 50. P. 8827-8839.

6. Aleman-Nava G.S., Cuellar-Bermudez S.P, Cuaresma M. et al. How to use Nile Red, a selective fluorescent stain for microalgal neutral lipids // J. Microbiol. Methods. 2016. Vol. 128. P 14-19.

7. Araujo C.V.M., Diz F.R., Lubian L.M., Blasco J., Moreno-Garrido I. Sensitivity of Cylindrotheca closterium to copper: Influence of three test endpoints and two test methods // Sci. Total. Environ. 2010. Vol. 408. P. 3696-3703.

8. Cid A., Fidalgo P, Herrero C., Abalde J. Toxic action of copper on the membrane system of a marine diatom measured by flow cytometry // Cytometry. 1996. Vol. 25. P 32-36.

9. El-Naggar A.H., Sheikh H.M. Response of the green microalga Chlorella vulgaris to the oxidative stress caused by some heavy metals // Life Sci. J. 2014. Vol. 11. P. 1349-1357.

10. Gomes F., Ferdandes E., Lima J.F.L.C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species // J. Biophys. Biochem. Methods. 2005. P. 45-80.

11. Hamed S.M, Selim S., Klцck G., AbdElgawad H. Sensitivity of two green microalgae to copper stress: Growth, oxidative and antioxidants analyses // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2017. Vol. 144. P. 19-25.

12. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J. Exp. Bot. 2002. Vol. 53. P 1-11.

13. Hyka P, Lickova S., Pribyl P, Melzoch K., Kovar K. Flow cytometry for development of biotechnological processes with microalgae // Biotechnol. Adv. 2013. V. 31. P. 2-16.

14. Jiang W., Liu D., Liu X. Effect of copper on root growth, cell division, and nucleolus of Zea mays // Biol. Plantarum. 2001. Vol. 44. P 105-109.

15. Kumar K.S., Shin K.-H. Effect of copper on marine microalga Tetraselmis suecica and its influence on intra- and extracellular iron and zinc content // KJEE. 2017. Vol. 50. P. 16-28.

16. Machado M.D., Soares E.V. Modification of cell volume and proliferative capacity of Pseudokirchneriella subcapitata cells exposed to metal stress // Aquat. Toxicol. 2014. Vol. 147. P. 1-6.

17. Miazek K., Iwanek W., Remacle C., Richel A., Goffin D. Effect of metals, metalloids and metallic nanoparticles on microalgae growth and industrial products biosynthesis: a review // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16. P. 23929-23969.

18. Nagajyoti PS., Lee K.D., Sreekanth Tvm. Heavy metals, occurrence and toxicity for plants: a review // Environ. Chem. Lett. 2010. Vol. 8. P. 199-216.

19. Perales-Vela H.V, Gonzalez-Moreno S., Montes-Horcasitas C., Canizares-Villanueva R.O. Growth, photosynthetic and respiratory responses to sub-lethal copper concentrations in Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae) // Chemosphere. 2007. Vol. 67. P 2274-2281.

20. Pyc M., Cai Y., Greer M.S. et al. Turning over a new leaf in lipid droplet biology // Trends Plant Sci. 2017. Vol. 22. P. 596-609.

21. Tragin M., Vaulot P. Green microalgae in marine coastal waters: the ocean sampling day (OSD) dataset // Sci. Rep. 2018. Vol. 8.

22. Yruela I. Copper in plants // Braz. J. Plant Physiol. 2005. Vol. 17. P 145-156.

23. Zhu Q.-L., Sai-Nan G., Wen F. et al. Transcriptional and physiological responses of Dunaliella salina to cadmium reveals time-dependent turnover of ribosome, photosystem, and ROS-scavenging pathways // Aquat. Toxicol. 2019. Vol. 207. P. 153-162.

Размещено на allbest.ru