Биосинтез аденозиндезаминазы Escherichia coli в системе бесклеточного синтеза белка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси

Биосинтез аденозиндезаминазы Escherichia coli в системе бесклеточного синтеза белка

Казловсвий И.С.,

магистр биологических наук, младший научный сотрудник

Зинченко А.И.,

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией

Аннотация

Ранее нами был сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий гомологичную аденозиндезаминазу (АДазу). В настоящем исследовании в качестве варианта, альтернативного каноническому глубинному культивированию в ферментере, была изучена возможность синтеза АДазы в системе бесклеточного синтеза белка (БСБ). Для синтеза этого фермента использовали Б30-клеточный экстракт E. coli, РНК-полимеразу бактериофага Т7 и высококопийный плазмидный вектор pET42mut со встроенным в него геном АДазы. В результате выполнения работы нами впервые продемонстрирована возможность синтеза АДазы E. coli в системе БСБ. В частично оптимизированных условиях проведения процесса получен экспериментальный образец рекомбинантной АДазы с активностью 530 Ед/мл ферментного препарата.

Ключевые слова: аденозиндезаминаза, Escherichia coli, бесклеточный синтез белка, высококопиийная pET42mut-плазмида, ферментный препарат

Abstract

Kazlouski I.S.

Master of Biol. Sci., junior researcher,

Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences

Zinchenko A.I.

Sc.D., professor, head of laboratory,

Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences

Biosynthesis of of Escherichia coli adenosine deaminase using cell-free protein synthesis

Summury: Previously, we constructed a strain Escherichia coli that produces homologous adenosine deaminase (AD). In the present study, as an alternative to canonical submerged cultivation in a fermenter, the possibility of the AD synthesis in the system of cell-free protein synthesis (CFPS) was studied. For synthesis of this enzyme we used the E. coli-30 cell extract, T7 bacteriophage RNA polymerase, and high-copy plasmid vector pET42mut with gene AD inserted into it. As a result of the work we have demonstrated for the first time the possibility of synthesis of AD E. coli in the CFPS system. In a partially optimized process conditions, an experimental sample of recombinant AD with an activity of 530 U/ml of enzyme preparation was obtained.

Key words: adenosine deaminase, Escherichia coli, cell-free protein synthesis, high-copy pET42mutplasmid, enzyme preparation

Основная часть

Введение. В качестве альтернативы генно-инженерной технологии получения хозяйственно важных белков и вирусоподобных частиц [1], мембранных белков [2] и белков, содержащих в себе неприродные аминокислоты [3] ряд исследовательских групп использует бесклеточные системы протеинового синтеза, в которых при обеспечении оптимальных условий возможна наработка протеинов как простых, так и со сложной структурой с устранением всех барьеров несовместимости для трансляции мРНК. Однако, несмотря на то, что этот методический подход был предложен гораздо раньше, чем генно-инженерный, детальное изучение возможностей его широкого практического использования только начинает предприниматься [4].

Реакционная смесь для бесклеточного синтеза белка (БСБ) - открытая система без физического барьера, такого как клеточная мембрана. Выход конечного продукта зависит от концентрации каждого компонента, которую можно варьировать в широких пределах, в отличие от ситуации in vivo. При этом конечная концентрация белка может достигать более 2 мг/мл.

Система БСБ предусматривает транскрипцию гена и трансляцию мРНК in vitro - в лизате клеток, в который вносят рекомбинантную ДНК, аминокислоты, нуклеотиды, кофакторы и АТФ - регенерирующую систему. Эндогенная генетическая информация (ДНК и мРНК клетки-хозяина) при этом удаляется.

Первоначально система БСБ была предложена как платформа для синтеза белков in vitro [5], а также в качестве инструмента для изучения механизмов репликации ДНК.

С тех пор было продемонстрировано несколько усовершенствований, и система БСБ стала более надежной, экономичной, универсальной и масштабируемой технологией для синтеза препаративных количеств различных белковых продуктов, в том числе вакцин [6], антител [7] и цитокинов [8]. Изучение системы БСБ дало толчок для развития новой дисциплины, которая получила наименование «бесклеточная метаболическая инженерия» [9]. В последние годы на основе системы БСБ были разработаны недорогие биосенсеры [10] и портативные устройства для диагностики различных заболеваний [11].

Аденозиндезаминаза (АДаза; КФ 3.5.4.4) -

фермент, играющий важную роль в метаболизме пуриновых нуклеозидов. Этот фермент осуществляет необратимую реакцию превращения аденозина в инозин путем замены ИН₂-группы в гетероциклическом основании нуклеозида на гидроксил. Помимо своего основного субстрата - аденозина, АДаза E. coli может использовать ряд других природных и модифицированных нуклеозидов - 2'-дез - оксиаденозин, З'-дезоксиаденозин, 2', 3'-дидезокси - аденозин, 6-метиламинопуринрибозид, 2,6 - диами - нопуринрибозид [12]. Способность фермента осуществлять дезаминирование модифицированных пуриновых нуклеозидов делает его привлекательным для использования в химико-ферментативных схемах получения различных субстанций с потенциальной фармакологической активностью.

Целью настоящей работы служило получение гомологичной АДазы при помощи системы БСБ, основанная на клеточном лизате E. coli.

Материалы и методы исследования. Источником гена АДазы (add; GenBank ID: 945851) служила ДНК E. coli K-12, выделенная из бактериальной биомассы с помощью коммерческого набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, США). Целевой фрагмент ДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы геномной ДНК и синтетических праймеров. Подбор олигонуклеотидов проводили с использованием программного обеспечения UGENE 1.22 (UniPro, Россия) на основе последовательностей гена АДазы: прямой add-F (5' - gtggtggtccacaacatgattgataccaccctgc-3') и обратный add-R (5'-ggtgatggtgatgctccttcgcggcgact - 3'). На 5'-окончания праймеров были добавлены последовательности, комплементарные плазмиде pET42mut [13]. Амплификацию осуществляли по следующей программе: этап предденатурации (30 с при 98 ^ОС) - 30 циклов амплификации (10 с при 98 ^ОС; 15 с при 55 ^ОС; 30 с при 72^ОС) - финальная элонгация 75 с при 72^оС. На втором этапе линеаризовали плазмиду pET42mut методом ПЦР с использованием Diamant-ДНК-полимеразы [14] и двух праймеров: прямой pET42mut-F (5'-catatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagag-3') и обратный pET42mut-R (5'-gagcatcaccatcaccaccaccaccactaattg-3'). Амплификацию вектора осуществляли по программе: этап предденатурации (30 с при 98 ^ОС) - 30 циклов амплификации (10 с при 98 ^ОС, 15 с при 55 ^ОС, 3 мин при 72^ОС) - финальная элонгация 3 мин и 25 с при 72 ^оС. На третьем этапе собирали линеаризованный вектор и целевой ген методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (Ш1-ПЦР) [15] по следующей программе: этап предденатурации (30 с при 98 ^ОС) - 16 циклов амплификации (10 с при 98 ^ОС; 15 с при 50 ^ОС; 4 мин при 72 ^ОС) - финальная элонгация 5 мин при 72 ^оС. На этом этапе в качестве матрицы и затравки были использованы фрагменты, полученные на первых двух этапах, в эквимолярных количествах.

Синтезированным в ходе ПП-ПЦР продуктом трансформировали компетентные клетки E. coli XL (Novagen, США) c последующим посевом на плотную селективную питательную среду Luria-Bertani (LB; 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1% триптон) с добавлением канамицина (100 мкг/мл).

Для определения наличия плазмид, содержащих целевые «вставки ДНК», часть одиночной колонии отбирали при помощи стерильного наконечника и вносили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (pH 8.3); 17 мМ (NH4) 2SO4; 2 мМ MgCL; 0.02% Твин-20, смесь четырех канонических дНТФ (каждого в концентрации 0.2 мМ) и 1 ед ДНК-полимеразы «Diamant» [14]. В качестве ДНК-затравки использовали праймеры (по 10 пмоль) к последовательности промотора фага Т7 (прямой T7p-F 5'-taatacgactcactataggg-3') и к последовательности, кодирующей АДазу (обратный add - R). ПЦР проводили по следующей программе: этап начальной денатурации 2 мин при 94 ^ОС - 25 циклов амплификации (30 с при 94 ^ОС; 15 с при 55 ^ОС; 1 мин при 72 ^ОС) - финальная элонгация 2 мин при 72 ^ОС.

Клетки-трансформанты выращивали в LB - среде с добавлением канамицина с конечной концентрации 80 мкг/мл. Клетки, содержащие целевые плазмиды, культивировали в жидкой среде LB с последующим выделением плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

Для синтеза АДазы использовали следующую реакционную смесь (1.0 мл): 0.25 мл клеточного экстракта S30, 0.65 мл премикса, 5 000 ед. активности РНК-полимеразы бактериофага Т7, 500 нг плаз - мидной ДНК, полученной на предыдущем этапе работы, и инкубировали при 30°С в течение 5-6 ч.

Затем определяли активность полученного фермента по скорости дезаминирования аденозина. Реакционную смесь, содержащую 20 мМ нуклеозид, 50 мМ Трис-НС1-буфер (рН 8.0) и фермент, инкубировали при 37°С. в течение от 30 мин до 1.5 ч. Из анализируемых образцов при помощи микрокапилляра отбирали аликвоты (5 мкл), которые наносили на хроматографические пластины для тонкослойной хроматографии Silufol-UV254. Хроматографию проводили в системе растворителей: хлороформ: метанол:аммиак-10:10:2,5. Расположение пятен субстратов и продуктов реакции определяли в УФ-свете. Вещества элюировали 5 мл воды. УФ-светопоглощение элюатов измеряли с помощью спектрофотометра при длине волны Z=255 нм. Активность фермента определяли на начальной стадии реакции, когда выход продукта не превышал 10-15% от максимального. За единицу активности фермента принимали такое количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мл ферментного препарата.

Результаты и обсуждение.

На начальном этапе работы методом ПЦР ам - плифицировали ген add, кодирующий аминокислотную последовательность АДазы. Праймеры для

ПЦР-амплификации гена подбирали таким образом, чтобы после их амплификации 5'- и З'-окончания ПЦР-продуктов содержали нуклеотидные последовательности, pET42mut.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации генов add (1). М - маркер молекулярных масс фрагментов ДНК

На следующем этапе проводили линеаризацию вектора pET42mut с помощью ПЦР. Праймеры для линеаризации вектора подбирали таким образом, чтобы при встраивании в плазмиду на З'-окончание целевого гена добавлялась последовательность нуклеотидов, обеспечивающая наличие дополнительного октагистидиного олигопептида на С - конце целевого белка.

Затем проводили постановку ПП-ПЦР, которая, в отличие от стандартной ПЦР, требует наличия в векторе и вставке перекрывающихся комплементарных участков, добавляемых на стадии клонирования целевых генов.

Как известно, при проведении 1П1-ПЦР [15] катемеров, содержащих различное количество повторов «вставка-вектор». Данной смесью высокомолекулярных линейных молекул трансформируются клетки-реципиенты, в которых происходит формирование нескольких кольцевых молекул - плазмид, несущих в себе целевой ген.

Таким образом, ген add, кодирующий АДазу E. coli, был встроен в плазмиду рЕТ42ти1. Полученной смесью ПП-ПЦР трансформировали компетентные клетки E. coli XL. Из полученных трансформантов выделили плазмиду с помощью щелочного лизиса и проанализировали при помощи электрофоретического разделения в 1%-ном агарозном геле (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма плазмид (1 и 2), полученных при помощи щелочного лизиса трансформантов. М - маркер молекулярных масс фрагментов ДНК

На следующем этапе работы проводили оценку эффективности синтеза АДазы в БСБ на основе S30 экстракта из E. coli. Конечная концентрация компонентов реакции составляла: 100 мМ HEPES-KOH (pH 8.0), 8 мМ Мд(СНзСОО) 2, 90 мМ КСНзСОО, 20 мМ фосфоенолпируват калия, набор аминокислот (каждая в концентрации 1.3 мМ), 0,15 мг/мл фолиевой кислоты, каждый из четырех рибонуклеозидтрифосфатов в концентрации 1 мМ, 0.05% NaN3, 2% полиэтиленгликоль 8000, 0.04 мг/мл пируваткиназы, 5.5 мкг/мл РНК-полимеразы фага Т7, 0.3 мг/мл плазмидной ДНК, содержащей ген, кодирующий АДазу, 0.5 мг/мл суммарной тРНК (из E. coli MRE 600) и экстракт S30, полученный из лизата клеток E. coli (30% от общего объема реакционной смеси). Инкубацию проводили в течение 6 ч при 30°С с умеренным перемешиванием. Для контроля синтеза АДазы, каждый час отбирали по 1 мкл для анализа ферментативной активности синтезируемого белка. В качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь БСБ с внесением вместо плазмидной ДНК соответствующего количества буферного раствора. Результаты представлены на рис. 3.

рекомбинантный бесклеточный белок фермент

Рис. 3. Синтез АДазы E. coli в системе БСБ

Выход Адазы в эксперименте, описанном выше, достиг 530 Ед/мл реакционной смеси. В плане сравнения следует отметить, что при проведенном ранее синтезе рекомбинантной АДазы E. coli в цельноеклеточной системе экспрессии максимальный выход ферментативной активности составлял 1,0 Ед/мл культуральной жидкости [16].

Впервые продемонстрирована возможность синтеза АДазы E. coli в системе БСБ. В частично оптимизированных условиях проведения процесса получен экспериментальный образец рекомбинантной АДазы с активностью 530 Ед/мл ферментного препарата.

По нашему мнению, синтез АДазы в системе БСБ может выступать в качестве варианта, альтернативного каноническому глубинному культивированию в ферментере.

Литература

1. Smith M.T., Varner C.T., Bush D.B., Bundy B.C. The incorporation of the A2 protein to produce novel QP virus-like particles using cell-free protein synthesis. Biotechnol. Progr. 2012. Vol. 28, №2. P. 549-555.

2. Hovijitra N.T., Wuu J.J., Peaker B., Swartz J.R. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes. Biotechnol. Bioeng. 2009. Vol. 104, №1. P. 40-49.

3. Patel K.G., Swartz J.R. Surface functionalization of virus-like particles by direct conjugation using azide-alkyne click chemistry. Biocon. Chem. 2011. Vol. 22, №3. P. 376-387.

4. Georgi V., Georgi L., Blechert M., Bergmeister M., Zwanzig M., Wustenhagen D.A., Bier F.F., Junga E., Kubick S. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab. Chip. 2016. Vol. 16. P. 269-281.

5. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet. 1973. Vol. 7. P. 267287.

6. Lu Y., Chan W., Ko B., VanLang C., Swartz J.R. Assessing sequence plasticity of a virus-like nanoparticle by evolution toward a versatile scaffold for vaccines and drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. Vol. 112. P. 12360-12365.

7. Xu Y., Lee J., Tran C., Heibeck T., Wang W., Yang J., Stafford R., Steiner A.R., Sato A.K., Hallam T.J., Yin G. Production of bispecific antibodies in «knobs-into holes» using a cell-free expression system. mAbs. 2015. Vol. 7, №1. P. 231-242.

8. Zawada J.F., Yin G., Steiner A.R., Yang J., Naresh A., Roy S.M., Gold D.S., Heinsohn H.G., Murray C.J. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production a new approach for shortening protein production development timelines. Bio - technol. Bioeng. 2011. Vol. 108. P. 1570-1578.

9. Guo W., Sheng J., Feng X. Mini-review: in vitro metabolic engineering for biomanufacturing of high - value products. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2017. Vol. 15. P. 161-167.

10. Salehi A.S., Shakalli Tang M.J., Smith M.T., Hunt J.M., Law R.A., Wood D.W., Bundy B.C. A cell - free protein synthesis approach to biosensing hTRp - specific endocrine disruptors. Anal. Chem. 2017. Vol. 89. P. 3395-3401.

11. Pardee K., Green A., Ferrante T., Cameron D.E., DaleyKeyser A., Yin P., Collins J.J. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 2014. Vol. 159. P. 940954.

12. Okuyama K., Shibuya S., Hamamoto T., Noguchi T. Enzymatic synthesis of 2'-deoxyguanosine with nucleoside deoxyribosyltransferase-II. Biosci. Bi - otechnol. Biochem. 2003. Vol. 67, №5. P. 989-995.

13. Казловский И.С., Рымко А.Н., Зинченко А.И. Модификация экспрессионной pET-системы для использования в бесклеточном синтезе белка. Сб. науч. трудов Института микробиологии НАН Беларуси «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты». Т. 10. 2018. С. 69-78.

14. Korovashkina A.S., Kvach S.V., Eroshevskaya L.A., Zinchenko A.I. Production of thermostable DNA polymerase suitable for whole-blood polymerase chain reaction. Biochemistry and Biotechnology: Research and Development / Eds: S.D. Varfolomeev, G.E. Zaikov, L.P. Krylova. 2012. Р. 1-5.

15. You C., Zhang X.Z., Zhang Y.H.P. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and Bacillus sub - tilis. Appl. Environ. Microbiol. 2012. Vol. 78, №5. P. 1593-1595.

16. Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. Оптимизация условий экспрессии штамма-суперпродуцента аденозиндезаминазы Escherichia coli. Динамика исследований - 2008: матер. IV Между - нар. науч. практ. конф., София, 16-31 июля 2008 г. Т. 22. С. 26-29.

Размещено на Allbest.ru