Валидация способа определения концентрации 146S иммуногенного компонента вируса ящура в вакцине при сравнении графиков второй производной для сигмоид реакции амплификации
Валидационные характеристики методики опосредованного определения концентрации компонента вируса ящура. Сравнение графиков второй производной для кривых транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени с применением квадратичной функции.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 03.06.2021 |
| Размер файла | 121,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.Allbest.Ru/
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Валидация способа определения концентрации 146S иммуногенного компонента вируса ящура в вакцине при сравнении графиков второй производной для сигмоид реакции амплификации
Доронин М.И., к.б.н., с.н.с.
Михалишин Д.В., к.в.н.
Стариков В.А., к.в.н., в.н.с.
Лозовой Д.А., д.в.н., доцент
Борисов А.В., к.в.н., в.н.с.
Аннотация
В данной статье представлена оценка основных валидационных характеристик методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением квадратичной функции C146S ВЯ = 0,0111(Cp)2-1,0157Cp+20,446. Диапазон применения ОТ-ПЦР-РВ составил 0,0514,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 146S компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика характеризуется высокой специфичностью (е составляет 0,2-5,0%), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости и воспроизводимости. При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (r = 0,9965, r-1) и степенью достоверности (R2 = 0,993, R2-1). Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости. Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Ключевые слова: 146S иммуногенный компонент вируса ящура, вакцина, реакция амплификации, вторая производная, валидация
Summary
Validation of the method for determining the concentration of the 146s immunogenic component of find virus in a vaccine by comparing the second derivative for the sigmoid amplification reaction
Doronin M.I., PhD in Biological Science, Senior Researcher.
Michalishin D. V., PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory.
Starikov V. A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher.
Lozovoy D.A., Doctor of Science (Veterinary Medicine), Associate Professor, Deputy Director for Research and Development.
Borisov A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher.
Federal centre for animal health, federal governmental budgetary institution
This article presents an assessment of the main validation characteristics of the method of mediated concentration of 146S component offoot and mouth disease virus when comparing the graphs of the second derivative for real-time RT- PCR curves using a quadratic function C146S FMDV = 0,0111(СJ2-1,0157Cp+20,446. The range of application of real-time RT-PCR was 0.05-14.75 yg/cm3. When testing a virus-containing material with concentrations of 146S component from 0,05 to 5.00 yg/cm3, the validated method is characterized by high specificity (e is 0.2-5.0%), as well as high precision under convergence conditions and under reproducibility conditions. When assessing linearity and correctness, it was proved that the validated method gives error-free results with a high correlation coefficient (r = 0.9965, r - 1) and a degree of confidence (R2 = 0.993, R2 - 1). Validation results of real-time RT-PCR satisfy all eligibility criteria. Based on this, the proposed method is reliable and can be used for indirect quantitative assessment of the 146S immunogenic component of foot and mouth disease virus in unactivated raw materials for the vaccine.
Keywords: 146S immunogenic component of foot and mouth disease virus, vaccine, second derivative, real time RT-PCR, validation
Введение
При изготовлении вакцин в области ветеринарии промежуточное сырье и выпускаемая продукция проходит тщательный многоступенчатый контроль в соответствии с требованиями системы обеспечения качества.
В процессе производства вакцин против ящура одним их этапов технологического контроля сырья является определение концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ ARRIAH) [7]. 146S, или полные частицы обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, определяющими иммуногенность вакцинных препаратов [8]. Традиционно для определения данного показателя вакцины применяли реакцию связывания комплемента в модификации А.Ф. Бондаренко. Одним из новых способов опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в неинактивированной суспензии для изготовления вакцины является сравнение максимальных экстремумов графиков второй производной (Ср) сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Зависимость между количествами 146S частиц неинактивированного вируса ящура и максимальными экстремумами графиков второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала отражают в виде квадратичной функции C146S ВЯ = 0,0Ш(Сp)2-1,0157Cp+20,446 с достоверностью аппроксимации 99,3%. Данный способ является высокочувствительным и высокоспецифичным, позволяет анализировать большое количество образцов за 4-5 ч.
Оценку пригодности представленного способа проводят на основе результатов валидации, предполагающей определение специфичности, правильности, прецизионности, диапазона применения и линейности аналитической методики, а также предела обнаружения и количественного определения 146S компонента [5].
Специфичностью данной методики считается возможность однозначно опосредованно определять концентрацию 146S частиц вируса ящура в исследуемой суспензии при наличии в анализируемой пробе посторонних антигенных компонентов [4].
Для определения точности указанной методики раскрывают понятия правильности и прецизионности. Правильность - близость к эталонному среднему значению концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в результате большой серии экспериментов. Прецизионностью называют степень разброса значений максимальных экстремумов графиков второй производной кривых накопления сигнала флуоресценции между сериями измерений для множества проб, взятых из одного и того же образца в условиях, определенных методикой [2, 4]. Соответственно проводят анализ повторяемости результатов измерений в условиях сходимости и воспроизводимости, определяя абсолютные и относительные показатели вариации [9, 10, 11].
Предел обнаружения рассматриваемой методики - наименьшая концентрация 146S частиц вируса ящура, которые могут быть качественно детектированы [5]. Пределом количественного определения считается наименьшее значение концентрации 146S компонента вируса ящура, которое можно оценить количественно [3, 4, 5].
Для доказательства существования прямо пропорциональной зависимости значений Cp и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики оценивают ее линейность [5]. Интервал между максимальным и минимальным значениями концентрации 146S частиц, в котором алгоритм определения аналитических частиц имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности является диапазоном применения представленной методики [5, 9].
Цель исследования заключалась в оценке валидационных показателей методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в вакцине при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в ОТ- ПЦР-РВ.
Материалы и методы
Вирус ящура. Для исследования применяли культуральный вирус ящура штаммов А/Забайкальский/2013, А/Турция/2006, А/Краснодарский/2013, О/Приморский/2014, О/Саудовская Аравия/2008, О/Чечено-Ингушский/1966,Азия-1/Таджикистан/2011, Азия-1/Пакистан/2018, САТ-2/Саудовская Аравия/2000, репродукцию которых осуществляли в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH.
Определение концентрации 146S компонента в ОТ-ПЦР-РВ при анализе максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Оценку концентрации 146S частиц методом ОТ-ПЦР-РВ проводили на основе сравнительного анализа максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в соответствии с требованиями, описанными ранее [6].
Реакция связывания комплемента (РСК). Для определения концентрации 146S частиц вируса ящура применяли количественный вариант РСК, проведение которого осуществляли в соответствии с требованиями [1].
Оценка специфичности методики. Специфичность методики определяли по относительной погрешности (e) результатов, полученных одновременно с использованием валидируемой методики ОТ-ПЦР-РВ и РСК [1]. Проводили исследование 9 модельных смесей культурального вируса ящура, которые содержали разное количество 146S частиц в смеси с 75S, 12S и 3,8S компонентами [7]. Фракционирование культурального вируса ящура на компоненты проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы при 40 000 об./мин. [8]. Анализ осуществляли в 5 повторениях.
Концентрация 146S компонента вируса ящура по результатам ОТ-ПЦР-РВ, C146S - концентрация 146S компонента по данным РСК. Специфичность методики считали высокой при e < 5% [4, 5].
Оценка правильности методики. Для исследования правильности методики проводили анализ 350 проб культурального вируса ящура с известными значениями титра в ОТ-ПЦР-РВ. Данные были представлены в виде уравнения линейной зависимости между экспериментально найденными в ОТ-ПЦР-РВ (у) и истинными значениями концентрации 146S компонента (x): y=k-x+b. Для полученной функции проверяли гипотезы о тождестве тангенса угла наклона (k) единице и равенстве свободного члена (b) нулю. При доказательстве верности указанных гипотез со степенью надежности, равной 0,05, использование валидируемой методики дает свободные от ошибки результаты [2, 5].
Оценка прецизионности методики. Для исследования прецизионности методики ОТ ПЦР-РВ в условиях сходимости и воспроизводимости рассчитывали абсолютные и относительные показатели вариации [4, 5, 9].
Определение абсолютных показателей вариации. Размах вариации (R) оценивали как разность между наибольшим и наименьшим значениями
Cp:R = Cpmax-Cpmm.
Индивидуальное линейное отклонение (di) рассчитывали по формуле:
d = |Cp. - Срср|.
Среднее линейное отклонение (d) рассчитывали как среднее арифметическое из индивидуальных линейных отклонений по формуле: dld: N, где d - индивидуальные линейные отклонения пороговых циклов амплификации, N - объем совокупности. Оценку дисперсии (Ф2) показателей проводили с использованием формулы:
ф2 = (Јdi2) N.
Для характеристики размеров вариации Ct рассчитывали среднее квадратичное отклонение (5), пользуясь формулой:
ф = V(ф2) [3,11].
Определение относительных показателей вариации. Расчет коэффициента осцилляции (VR) проводили, пользуясь формулой:
VR = R:Ctср*100
Линейный коэффициент вариации (Cd) рассчитывали по формуле:
Сd = dср:Сtср*100
Для оценки колеблемости индивидуальных значений пороговых циклов амплификации определяли коэффициент вариации (C5) по формуле: C5 = 6:Ct,-100 [10, 11]. Метод считают надежным при C5<2% в условиях сходимости и C5<3% в условиях воспроизводимости [9].
Расчет нижнего предела обнаружения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПОС1463). Наименьшую концентрацию 146S компонента вируса ящура с использованием валидируемой методики находили по формуле:
ПОС1463 = 3,3-Sb: k,
где Sb - стандартное отклонение аналитического сигнала, которое соответствует стандартному отклонению свободного члена (b); k - тангенс угла наклона [3, 4, 10]. Свободный член b находили при анализе 5 модельных образцов с концентрациями 146S частиц вируса ящура: 0,001; 0,01; 0,10; 0,50; 1,00 мкг/см3.
Вычисление предела количественного определения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПКОі::1464). Минимальное значение концентрации 146S компонента вируса ящура, определенное с соответствующей правильностью и прецизионностью валидируемой методики, рассчитывали, применяя формулу [10, 11]: ПКОС1463 = 10-Sb:k. Полученное значение ПКОС1463 подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных суспензий вируса ящура с концентрациями 146S компонента, близкими к найденному значению предела количественного определения: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3. Анализ проводили в 5 повторениях. Результаты исследования считали статистически достоверными при p<0,005.
Определение диапазона применения методики. Для исследования аналитической области валидируемой методики исследовали 8 модельных образцов со следующими значениями концентрации 146S частиц вируса ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 в 5 повторениях.
Определение линейности методики. Существование линейной зависимости порогового цикла амплификации и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах диапазона применения методики проверяли в экспериментально, определяя Ct для 50 проб с различными концентрациями 146S частиц в 5 повторениях. Полученные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием регрессии вида:
C=k-C146S+b,
где k - угловой коэффициент; b - свободный член. Достоверность результатов анализа подтверждали, вычисляя коэффициент корреляции (r), который по модулю должен быть > 0,99 [3, 4, 10].
Результаты и обсуждение
валидационный вирус ящур транскрипазный полимеразный
На первом этапе исследования определяли специфичности валидируемой методики для опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ. Подготавливали 9 модельных образцов, добавляя к суспензиям 146S частиц, определяющих иммуногенность вакцины [7, 8], смесь 75S, 12S и 3,8S компонентов для выявления возможного их влияния на специфичность данной методики. Состав модельных образцов, а также результаты определения относительной погрешности (e) при исследовании в ОТ-ПЦР-РВ представлены в таблице 1.
Таблица 1
Оценка специфичности методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5, M±m)
|
№ смеси |
Состав модельной смеси |
Относительная погрешность (e) при измерении концентрации 146S частиц в сырье для вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ, % |
|||
|
название компонента |
содержание компонента в смеси, % |
концентрация 146S компонента, мкг/см3 |
|||
|
1 |
146S |
100 |
5,00 |
0,20-0,65 |
|
|
75S+12S+3,8S |
0 |
||||
|
2 |
146S |
80 |
4,00 |
0,25-1,50 |
|
|
75S+12S+3,8S |
20 |
||||
|
3 |
146S |
60 |
3,00 |
0,35-1,67 |
|
|
75S+12S+3,8S |
40 |
||||
|
4 |
146S |
40 |
2,00 |
0,50-2,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
60 |
||||
|
5 |
146S |
20 |
1,00 |
1,00-2,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
80 |
||||
|
6 |
146S |
10 |
0,50 |
2,00-3,12 |
|
|
75S+12S+3,8S |
90 |
||||
|
7 |
146S |
2 |
0,10 |
3,00-3,54 |
|
|
75S+12S+3,8S |
98 |
||||
|
8 |
146S |
1 |
0,05 |
4,00-5,00 |
|
|
75S+12S+3,8S |
99 |
||||
|
9 |
146S |
0,5 |
0,025 |
-* |
|
|
75S+12S+3,8S |
99,5 |
Примечание: * Cp превышают предельное значение, позволяющее применять функцию C,46S ВЯ = 0,0111(С )2-l,0157C +20,446.
Из данных таблицы 1 видно, что относительная погрешность опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура с помощью валидируемой методики при содержании 146S частиц 5,00-4,00; 4,00-3,00; 3,00-2,00; 2,00-1,00; 1,00-0,50; 0,50-,10; 0,10-0,05 мкг/см3 составляла 0,20-1,50; 0,25-1,67; 0,35-2,00; 0,50-2,00; 1,00-3,12; 2,00-3,54; 3,00 - 5,00%, соответственно. Таким образом, отмечали высокую специфичность методики для суспензий с концентрациями 146S частиц вируса ящура от 5,00 до 0,05 мкг/см3, при исследовании которых относительная погрешность не превышала 5%. В исследовании не анализировали пробы с концентрациями 146S компонента более 5,00 мкг/см3, поскольку в неинактивированных суспензиях культурального вируса ящура содержание не превышает данного значения.
Следующий этап исследования посвящен оценке правильности валидируемой методики, тестируя в ОТ-ПЦР-РВ 350 проб вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 0,50; 1,00; 2,00; 3,00; 4,00; 5,00 мкг/см3 (по 50 проб на каждую концентрацию). Результаты исследования представлены на рисунке 1 в виде линейной функции y = 0,9963-x+0,0149, которая при степени достоверности (R2) 0,9994, подтверждает, что тангенс угла наклона (k) стремится к единице (k = 0,9963), а свободный член (b) - к нулю (b = 0,0149). Таким образом, применение валидируемой методики позволяет получать достоверные результаты.
На следующем этапе проводили оценку прецизионности методики опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с расчетом абсолютных и относительных показателей вариации.
Прецизионность в условиях сходимости определяли по вариабельности результатов реакции внутри одного исследования 5 суспензий культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 1,00; 2,00; 3,00; 5,00 мкг/см3, которые одновременно тестировал один оператор на одном анализирующем термоциклере в 20 повторениях. Результаты статистического анализа полученной совокупности максимальных экстремумов сигмоидных ОТ-ПЦР-РВ (Cp. отражены в таблице 2, из данных которой следует, что размах вариации составил 0,040,29, среднее линейное отклонение - 0,0080,045, иными словами, уровень вариации Cpj в полученных выборках при указанных значениях концентрации 146S частиц вируса ящура относительно средней величины признака низкий. Коэффициент дисперсии находился в диапазоне 0,000-0,004, среднее квадратичное отклонение составило 0,0110,063, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Cp от среднего арифметического (Срср). Таким образом, колеблемость индивидуальных значений в выборках низкая, а значения Cp представляют собой надежную совокупность.
Для оценки колеблемости полученных значений Cpj внутри генеральной совокупности определяли относительные показатели вариации. Коэффициент осцилляции составлял 0,208-0,981%, иными словами, относительное изменение крайних значений Cpj по сравнению со средней величиной во всех выборках низкое. Линейный коэффициент вариации находился в диапазоне 0,044-0,152%, следовательно, доля усредненного значения отклонений от Срср в каждой совокупности не значительна. Коэффициент вариации индивидуальных значений пороговых циклов амплификации составил 0,056-0,214%, что соответствует общим требованиям, предъявляемым к валидируемым методикам (Cg<2%) [3, 4, 5, 10].
Таким образом, при исследовании суспензий вируса ящура с концентрациями аналита от 0,10 до 4,00 мкг/см3 в 20 повторениях с помощью предложенной методики одним оператором получены однородные и надежные совокупности значений максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоид ОТ-ПЦР-РВ, которые можно применять для опосредованного выражения концентрации 146S компонента вируса ящура.
Следующий этап работы был посвящен исследованию прецизионности валидируемой методики в условиях воспроизводимости. Для этого анализ суспензий культурального вируса ящура проводили два оператора в разное время в 20 повторениях (40 измерений для каждой пробы). Полученные результаты отражены в таблице 2, из которой следует, что для генеральной совокупности значений Cp размах вариации составил 0,07-0,66, среднее линейное отклонение (d) - 0,009-0,055, иными словами, степень колеблемости Cpt в полученных выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия составила 0,000-0,008, среднее квадратичное отклонение - 0,012-0,091, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Cp от среднего арифметического и высокий уровень достоверности результатов внутри каждой выборки максимальных экстремумов графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ.
Рис. 1. Исследование правильности методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5)
Исследуя относительные показатели вариации Cpp выявили, что коэффициент осцилляции составил 0,365-2,231%, линейный коэффициент вариации - 0,045-0,185%, коэффициент вариации - 0,064-0,185%, что соответствует общепринятым нормам (C5<3%) [3]. Исходя из полученных результатов, относительное изменение крайних значений Cp и доля усредненного значения абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. Следует отметить, что вариация значений параметров валидации при исследовании суспензий вируса ящура с увеличением концентрации 146S компонента от 0,10 до 5,00 мкг/см3 снижалась, а степень достоверности результатов возрастала.
В результате сравнительного анализа данных, полученных при оценке прецизионности валидируемой методики, доказали, что в условиях сходимости степень достоверности результатов опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура выше по сравнению с оценкой, проводимой в условиях воспроизводимости, что соответствует общепринятым статистическим ожиданиям [9]. По абсолютным и относительным показателям вариации валидируемая методика удовлетворяла критериям приемлемости [3, 9, 11].
На следующем этапе исследования определяли предел обнаружения (POC146S) и количественного определения (ПКОС1463) концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины с помощью валиди- руемой методики. Проведя исследования в 7 повторениях, получили следующие значения свободного члена (b): 20,444; 20,446; 20,447; 20,448; 20,449; 20,443; 20,446. Учитывая, что стандартное отклонение свободного члена (Sb) составило 0,002, а тангенс угла наклона (k) был равен (-0,45), провели расчеты и определили, что nOc146S данной методикой составил 0,01551 мкг/см3 (или 15,51 нг/см3), а nKOC146S - 0,047 мкг/см3 (или 47 мкг/см3).
Таблица 2
Оценка прецизионности методики для опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5)
|
Валидационные показатели методики при оценке прецизионности |
Значения показателей валидации при исследовании суспензий с разными концентрациями 146S частиц вируса ящура (мкг/см3) |
||||||||||
|
условия сходимости |
условия воспроизводимости |
||||||||||
|
0,10 |
1,00 |
2,00 |
3,00 |
5,00 |
0,10 |
1,00 |
2,00 |
3,00 |
5,00 |
||
|
объем выборки Cp (N) |
20 |
20 |
20 |
20 |
20 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
|
|
среднее значение Cp (СРср) |
29,569 |
27,078 |
24,811 |
22,811 |
19,198 |
29,579 |
27,066 |
24,802 |
22,779 |
19,197 |
|
|
суммарное значение индивидуального линейного отклонения по модулю (X|di|) |
0,896 |
0,844 |
0,630 |
0,354 |
0,168 |
2,192 |
2,424 |
1,932 |
1,818 |
0,342 |
|
|
суммарное значение квадрата модуля индивидуального линейного отклонения (Xdi2) |
0,080 |
0,054 |
0,042 |
0,010 |
0,002 |
0,329 |
0,226 |
0,197 |
0,154 |
0,006 |
|
|
наибольшее значение Cp (Cp ) |
29,640 |
27,200 |
24,900 |
22,860 |
19,220 |
29,950 |
27,300 |
24,960 |
22,860 |
19,230 |
|
|
наименьшее значение Cp (Cpmin) |
29,350 |
27,000 |
24,690 |
22,770 |
19,180 |
29,290 |
26,980 |
24,650 |
22,600 |
19,160 |
|
|
размах вариации (R) |
0,290 |
0,200 |
0,210 |
0,090 |
0,040 |
0,660 |
0,320 |
0,310 |
0,260 |
0,070 |
|
|
среднее линейное отклонение (dm) |
0,045 |
0,042 |
0,031 |
0,018 |
0,008 |
0,055 |
0,061 |
0,048 |
0,045 |
0,009 |
|
|
дисперсия (52) |
0,004 |
0,003 |
0,002 |
0,001 |
0,000 |
0,008 |
0,006 |
0,005 |
0,004 |
0,000 |
|
|
среднее квадратичное отклонение (5) |
0,063 |
0,052 |
0,046 |
0,023 |
0,011 |
0,091 |
0,075 |
0,070 |
0,062 |
0,012 |
|
|
коэффициент осцилляции (VR), % |
0,981 |
0,739 |
0,846 |
0,395 |
0,208 |
2,231 |
1,182 |
1,250 |
1,141 |
0,365 |
|
|
линейный коэффициент вариации (Cd), % |
0,152 |
0,156 |
0,127 |
0,078 |
0,044 |
0,185 |
0,224 |
0,195 |
0,199 |
0,045 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
0,214 |
0,191 |
0,185 |
0,099 |
0,056 |
0,306 |
0,278 |
0,283 |
0,272 |
0,064 |
Рассчитанное значение nKOC146S подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных образцов культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3 в пяти повторениях. Результаты анализа отражены в таблице 3.
Таблица 3
Выявление предела количественного опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n = 5, M±m)
|
№ суспензии вируса ящура |
Концентрация 146S частиц (C146S), мкг/см3 |
Исследование суспензии в ОТ-ПЦР-РВ |
Экспериментальное подтверждение, что теоретическое значение ПКО - 0,047 мкг/см3, 146S |
||
|
Cp |
концентрация 146S частиц (C146S), мкг/см3 |
||||
|
1 |
0,015 |
31,56 |
-* |
подтверждено |
|
|
2 |
0,030 |
30,49 |
- |
подтверждено |
|
|
3 |
0,045 |
30,14 |
- |
подтверждено |
|
|
4 |
0,050 |
29,52 |
0,048 |
подтверждено |
|
|
5 |
0,100 |
29,38 |
0,100 |
подтверждено |
Примечание: «-» - концентрация 146S частиц не определена, так как значение максимального экстремума графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ выходит за пределы функции C146S ВЯ = 0,0111(Cp)2-1,0157Cp+20,446.
Из данных таблицы 3 следует, что экспериментальное значение nKOC146S валиди- руемой методикой подтверждает расчеты и составляет 0,050 мкг/см3.
При исследовании 8 модельных образцов с концентрациями 146S компонента вируса ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 определили, что аналитическая область опосредованной оценки содержания 146S частиц при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ находилась в диапазоне 0,05
14,75 мкг/см3 при значениях Cp от 29,52±0,05 до 6,00±0,01, соответственно (n=5, p<0,005). При концентрациях 146S компонента более 14,75 мкг/см3, по всей видимости, по причине высокого содержания полных вирусных частиц предложенная квадратичная модель не позволяла проводить достоверный опосредованный количественный анализ (n = 5, p>0,01). Определен нижний предел значения Cp, который для разработанной модели q46S ВЯ = 0,0111(Сp)2-1,0157Cp+20,446 составил 29,65.
Таблица 4
Оценка параметров валидации методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ
|
Параметр валидации методики |
Валидационный показатель |
Значения показателей валидации методики при исследовании вируса ящура с разными концентрациями 146S компонента (мкг/см3) |
||||||
|
0,05 |
0,10 |
0,50 |
1,0 |
3,0 |
5,0 |
|||
|
специфичность |
относительная погрешность (e), % |
4-5 |
3-3,54 |
2-3,12 |
1,0-2,0 |
0,35-1,67 |
0,20-0,65 |
|
|
сходимость |
среднее квадратичное отклонение (5), % |
н/и |
0,063 |
н/и |
0,052 |
0,023 |
0,011 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
н/и |
0,214 |
н/и |
0,191 |
0,099 |
0,056 |
||
|
Воспроизводи-мость |
среднее квадратичное отклонение (5), % |
н/и |
0,091 |
н/и |
0,075 |
0,062 |
0,012 |
|
|
коэффициент вариации (C5), % |
н/и |
0,306 |
н/и |
0,278 |
0,272 |
0,064 |
||
|
линейность |
коэффициент корреляции (r) |
0,9965 |
||||||
|
правильность |
степень достоверности (R2) |
0,9930 |
||||||
|
тангенс угла наклона (k) |
0,9963 |
|||||||
|
свободный член (b) |
0,0149 |
|||||||
|
Аналитическая область |
диапазон опосредованного количественного определения, мкг/см3 |
0,05-14,75 |
Примечание: н/и - не исследовали.
На заключительном этапе исследования проведена проверка линейной зависимости значения Cp и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики, тестируя 50 вируссодержащих суспензий с концентрациями аналита от 0,05 до 14,75 мкг/см3 в пяти повторениях. В результате анализа получена квадратичная функция С1468 вя = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 с коэффициентом корреляции (r), равным 0,9965, что позволяет судить о достоверности результатов статистического исследования.
Заключение
Проведена оценка основных валидационных характеристик методики опосредованного концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с применением квадратичной функции
СМ68 ВЯ = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 (таблица 4).
Выявлено, что диапазон применения ОТ- ПЦР-РВ составил 0,05-14,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 146S компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика ха- растеризуется высокой специфичностью (е составляет 0,2-5,0%), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости, (S находилось в диапазоне 0,011-0,063%, 5<2%, С5 - 0,056-0,214%, Cs<2%) и в условиях воспроизводимости (5 составило 0,012-0,091%, S <3%, с5 - 0,064-0,306%, C5<3%).
При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (r = 0,9965, г-1) и степенью достоверности (R2 = 0,993, R2-1).
Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости.
Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Список литературы
1. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. / А.Ф. Бондаренко. Суздаль, 1994. 92 с.
2. Государственная фармакопея XII изд. Ч. 1. М., 2010. С. 254-266.
3. Ланг Т.А. Как описывать статистику в медицине. Руководство для авторов, редакторов и рецензентов. / Т.А. Ланг, М. Сесик. М.: Практическая Медицина, 2011. 480 с.
4. Носырев П. ОАО «Ай Си Эн Лексредства» / П. Носырев, М. Носырева, Т Рассказова, Н. Корнеева. // Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория.
5. ОФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик. Фармакопея.ру.
6. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // 2017. Бюл. №14. Лозовой Д.А., Доронин М.И., Михалишин Д.В. [и др.].
7. Пономарев А.П. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. / А.П. Пономарев, В.Л. Узюмов, К.Н. Груздев. Владимир: Фолиант, 2006. 250 с.
8. Ререр Х. Ящур / Х. Ререр. Пер. с нем. Г.А. Сурковой; Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. Москва: Колос, 1971. 432 с.
9. СТБ ИСО 5725-2002. «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Части 1-6. - 01.11.2002.
10. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.
11. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.
Размещено на allbest.ru
Подобные документы
Сущность и содержание метода полимеразной цепной реакции, особенности его использования в реальном времени для диагностики различных, в том числе и вирусных, заболеваний. Актуальность и этапы разработки быстрых и эффективных диагностических тестов.
статья [686,1 K], добавлен 26.07.2013- Эффективность и качество использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике гриппа
Рассмотрение сути метода полимеразной цепной реакции. Понятие амплификации как процесса увеличения числа копий дезоксирибонуклеиновой кислоты. Основные принципы подбора праймеров при создании тест-системы. Подготовка пробы биологического материала.
курсовая работа [610,8 K], добавлен 14.11.2014 Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, его использование в диагностике мутаций в генах, приводящих к возникновению рака молочной железы и яичника. Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса. Наследственные формы рака.
дипломная работа [306,1 K], добавлен 09.10.2013Изготовление микропланшетов. Определение спектра поглощения. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации. Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan. Система детекции результатов анализа.
дипломная работа [873,4 K], добавлен 15.12.2008Природа константы К в уравнении. Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен. Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции, образование устойчивого комплекса. Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции, устройства для их определения.
курсовая работа [278,9 K], добавлен 23.02.2012Дефицит кислорода как стрессовый фактор для растений. Энергетическое состояние клетки в условиях гипоксии. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Динамика активности фумаратгидротазы в зеленых листья кукурузы в условиях гипоксии.
курсовая работа [325,9 K], добавлен 09.08.2016Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их применение в генной инженерии. Реакция лигирования; рестриктазные операции. Использование метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции.
презентация [985,3 K], добавлен 17.08.2015Фенотипические последствия гибридизации животных. Молекулярные методы определения видов. Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila. Разработка специфических праймеров для полимеразной цепной реакции. Особенности секвенирования по Сэнгеру.
дипломная работа [3,7 M], добавлен 25.06.2017Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК. Обнаружение мутации в геномной ДНК при помощи блот-гибридизации с помощью меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. Исследование фрагментов ДНК при полимеразной цепной реакции.
учебное пособие [2,5 M], добавлен 11.08.2009Методы определения аффинности антител. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген—антитело, ее кинетические закономерности. Сущность метода равновесного диализа. Экспериментальные методы и определения кинетических констант реакции.
контрольная работа [744,7 K], добавлен 19.09.2009
