Размещено на http://allbest.ru

Активность ферментов хлоропластов и содержание метаболитов в листьях хлорофилльных мутантов гороха посевного и их гибридов

О.Б. Вайшля, В.В. Иванищев

Аннотация

Оценивали активность ферментов хлоропластов и содержание метаболитов в листьях растений изогенных линий гороха посевного, характеризующихся хлорофилльной недостаточностью.

Обсуждается взаимосвязь между фотосинтезом и гетерозисом.

Введение

Сложность исследований по генетике фотосинтеза связана прежде всего с двойным ядерно-цитоплазматическим контролем этого процесса (1).

У хлорофилльных мутантов обычно нарушения затрагивают не только систему биосинтеза пигментов, но и активность ряда ферментов, участвующих в ассимиляции углекислого газа, что сопровождается снижением продуктивности растений (2).

В то же время выявлен эффект гетерозиса у гибридов гороха от скрещивания хлорофилльного мутанта М-2004 с исходным сортом Торсдаг (3). Повышенную урожайность гибридов можно объяснить увеличением интенсивности фотосинтеза и/или снижением интенсивности дыхания, однако причины этого явления остаются невыясненными. Отчасти поэтому до сих пор не созданы достаточно эффективные селекционные технологии повышения продуктивности растений, основанные на физиолого-биохимической оценке исходного материала.

С целью объяснения эффекта гетерозиса мы определяли активность ферментов хлоропластов и содержание метаболитов в листьях гибридов гороха.

Методика

Объектом исследования служили хлорофилльные мутанты гороха посевного (Pisum sativum L.) -- M-2004 и М-2014 (по каталогу Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова), полученные на основе сорта Торсдаг.

Различия между мутантом M-2004 и исходной формой затрагивали один локус; плейотропное действие мутантного гена проявлялось по степени пигментации, высоте растений и зерновой продуктивности (3, 4).

У линии М-2014 мутация хлорофилльной недостаточности (chi) не локализована. Хлорофилльная недостаточность и низкая продуктивность были характерны для обеих мутантных форм, но у гибридов от скрещивания линии М-2014 с исходным сортом не выявлено эффекта гетерозиса.

Опыты проводили на экспериментальном участке в 3-4-кратной повторности (по три аналитических повторности в каждой) в течение 3 лет. Определяли урожай зерна с одного растения (анализировали по 15-20 растений каждой формы). В ювенильную фазу онтогенеза (четыре-пять междоузлий) в 9-10 ч утра отбирали одновозрастные, закончившие рост листья верхнего междоузлия.

Хлоропласты выделяли методом дифференциального центрифугирования при 4 ^оС, фракцию несколько раз промывали средой выделения без цистеина и контролировали чистоту препаратов (3).

Содержание сахаров определяли микрометодом (по реакции восстановления феррицианида калия) (5), крахмала -- сульфосалициловым методом (5), аминокислот -- на автоматическом анализаторе «Т-339» (Чехия), малата и пирувата -- энзиматическим методом (6), активность ферментов в хлоропластах -- на спектрофотометрах «Specord UV-VIS» (Германия) и СФ-46 (Россия) (5). При анализе использовали реактивы фирм «Reanal» (Венгрия), «Serva» (Германия), «Calbiochem» (США) и химически чистые минеральные соли (Россия).

Чистую продуктивность фотосинтеза (ЧПФ) рассчитывали по формуле:

ЧПФ = 2(В₂ - В₁)/[T(S₁ + S₂)],

где S и В -- соответственно площадь поверхности и сухая масса листьев в начале и конце учетного периода, Т -- продолжительность периода, сут; индекс мобилизации -- как отношение массы бобов к массе надземной части растений (7). Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами (8).

Результаты

Удельная активность РБФ-карбоксилазы (рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза) -- основного фермента ассимиляции углекислого газа -- фракции хлоропластов у мутанта М-2004 была почти в 2 раза выше, чем у исходного сорта Торсдаг (табл. 1).

1. Удельная активность ферментов фракции хлоропластов листьев хлорофилльных мутантов, гибридов и исходного сорта гороха посевного (мкмоль субстрата/(г мин сырой массы))

Гибридные растения от прямого и обратного скрещиваний мутанта и исходного сорта также характеризовались повышенной активностью фермента по сравнению с сортом Торсдаг, но у гибрида Торсдаг М-2004 этот показатель был ниже, чем у мутанта М-2004.

Относительно высокая активность РБФ-карбоксилазы фракции хлоропластов отмечена у мутанта М-2014. Наиболее высокая активность ГАФ-дегидрогеназы (глицеральдегидрофосфатдегидрогеназа) выявлена у мутанта М-2004, наиболее низкая -- М-2014. Различия по показателям активности ФЕП-карбоксилазы (фосфоенолпируваткарбоксилаза), НАДФ-МДГ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат-малатдегидрогеназа) и НАДФ-МЭ (НАДФ-малик-энзим) между мутантами, гибридами и исходным сортом были практически аналогичны таковым по РБФ-карбоксилазе.

Выявлено отсутствие прямой положительной корреляционной связи между активностью ферментов фракции хлоропластов и урожаем зерна с одного растения. При этом чем выше была активность РБФ-карбокси-лазы, НАДФ-МЭ и особенно ФЕП-карбоксилазы в хлоропластах, тем ниже зерновая продуктивность растений.

При сравнении активности ферментов фракций хлоропластов у гибридов выявлено доминирование по материнской линии. По активности ГАФ-дегидрогеназы гибриды занимали промежуточное положение по отношению к обеим родительским формам. Увеличение активности ГАФ-дегидрогеназы в листьях гибридов, по-видимому, обусловливает повышение содержания в хлоропластах триозофосфатов, причем более значительное, чем у растений сорта Торсдаг, но меньшее, чем у мутанта М-2004, что согласуется с полученными ранее данными (3).

Известно, что триозофосфаты играют ведущую роль как в процессах биосинтеза углеводов, так и обмене восстановительных эквивалентов через оболочку хлоропластов (9). При этом обеспечивается более высокая интенсивность транспорта, транспирации и газообмена в листьях растений (10). Активность ГАФ-дегидрогеназы фракции хлоропластов у мутанта М-2014 была значительно ниже, чем у остальных форм, что можно объяснить нарушениями структуры и/или процесса биосинтеза этого фермента, а также повышенной активностью ФЕП-карбоксилазы. Происходящие при этом изменения метаболизма приводят к снижению содержания крахмала и повышению содержания серина, аспартата и малата в листьях растений (табл. 2).

2. Содержание метаболитов в гомогенате листьев хлорофилльных мутантов, гибридов и исходного сорта гороха посевного

Между содержанием крахмала и сахарозы в листьях выявлена прямая корреляционная зависимость, что свидетельствует о более быстром метаболизме этих соединений как у обоих мутантов, так и у гибридов по сравнению с исходным сортом. Аналогичные данные получены у гибридов кукурузы (11). селекционный горох фотосинтез метаболизм хлоропласт

Коэффициенты линейной корреляции между содержанием крахмала, сахарозы, аланина, пирувата в листьях растений и урожаем зерна имели положительные значения (соответственно 0,72; 0,50; 0,37; 0,47); между содержанием редуцирующих сахаров, серина, аспартата, малата и урожаем -- отрицательные (соответственно -0,67; -0,40; -0,93; -0,89); между содержанием глицина и урожаем прямая корреляция отсутствовала (r = = 0,11). Эти данные позволяют косвенно судить о направленности метаболизма и изменении активности ряда ключевых ферментов восстановительного и окислительного путей метаболизма углерода.

Коэффициент линейной корреляции между активностью РБФ-карбоксилазы в хлоропластах и содержанием углеводов в листьях составлял r = -0,88 (как по отношению к крахмалу, так и к сахарозе).

Коэффициенты линейной корреляции между активностью ГАФ-дегидрогеназы и содержанием крахмала и сахарозы составляли соответственно r = -0,15 и r = -0,14, что свидетельствует о значительном участии ГАФ-дегидрогеназы скорее в транспорте веществ через мембрану хлоропластов, чем в накоплении крахмала и сахарозы (9). Можно предположить, что именно снижение активности ГАФ-дегидрогеназы в хлоропластах приводило к резкому уменьшению продуктивности мутанта М-2014 и отсутствию эффекта гетерозиса у гибридов от скрещивания этой линии и исходного сорта Торсдаг (табл. 3).

3. Оценка фотосинтетической продуктивности хлорофилльных мутантов, гибридов и исходного сорта гороха посевного

При этом у мутанта М-2014 было нарушено соответствие между показателем ЧПФ и урожаем зерна. В целом следует отметить, что коэффициенты линейной корреляции между показателями фотосинтетической и зерновой продуктивности у исследуемых форм имели высокие значения (0,91-0,98).

Коэффициент линейной корреляции (r = 0,64) отражал соотношение активности карбоксилирующих ферментов в хлоропластах (при явно различающейся удельной активности), то есть активность хлоропластной ФЕП-карбоксилазы существенно зависела от таковой РБФ-карбоксилазы (см. табл. 1). По-видимому, это может быть связано с использованием в реакциях карбоксилирования одного и того же субстрата (бикарбонат/углекислый газ). Повышение активности ферментов цикла Кальвина (РБФ-карбоксилаза и ГАФ-дегидрогеназа) в хлоропластах мутантных и гибридных форм сопровождалось увеличением активности ферментов метаболизма С₄-дикарбоновых кислот (ФЕП-карбоксилаза, НАДФ-МДГ и НАДФ-МЭ), что также наблюдалось при исследовании других ферментов (12).

Снижение содержания аланина, аспартата и малата в листьях гибридных форм по сравнению с исходным сортом Торсдаг свидетельствует о более интенсивном метаболизме этих веществ, одним из продуктов превращения которых является пируват (см. табл. 2). При этом более интенсивные процессы утилизации аланина и накопления пирувата обусловлены влиянием (доминированием) генотипа мутанта М-2004. У низкопродуктивного мутанта М-2014 не наблюдалось явной зависимости между содержанием в листьях аланина, аспартата, малата и пирувата. Трудно объяснить повышенное содержание малата по отношению к пирувату во фракции хлоропластов этого мутанта при наличии высокоактивного НАДФ-МЭ и низком соотношении НАДФН/НАДФ (13). По-видимому, у мутанта М-2014 не соблюдался необходимый баланс синтезируемых in vivo АТФ и НАДФН, что было обусловлено недостаточным синтезом АТФ при низком содержании хлорофилла и невозможностью интенсивной утилизации НАДФН ГАФ-дегидрогеназой (3, 9). При этом даже при повышенной активности оксалоацетат-декарбоксилазы и высокой (по сравнению с сортом Торсдаг) активности НАДФ-МДГ не обеспечивалось образование такого количества пирувата в хлоропластах, как у исходного сорта.

Сопоставление активности НАДФ-МДГ и НАДФ-МЭ, с одной стороны, и содержания малата и пирувата в той же фракции хлоропластов, с другой, свидетельствует об очень слабой прямой зависимости (или ее отсутствии) между НАДФ-МЭ и малатом, НАДФ-МЭ и пируватом, НАД-МДГ и малатом -- соответственно r = 0,21; r = 0,45; r = -0,13, что подтверждает различный характер регуляции метаболизма С₄-дикарбоновых кислот в хлоропластах (12).

Значительное накопление серина в листьях мутанта М-2014 отражает частичное подавление интенсивности дыхания, по-видимому, на одном из этапов превращения этого субстрата в фосфоглицерат (см. табл. 2). Об этом свидетельствует также пониженное содержание глицина, из которого образуется серин. Наоборот, в листьях мутанта М-2004 метаболизм серина проходил более интенсивно при, видимо, меньшей скорости его образования из глицина. Выделяющийся при дыхании аммиак обычно включается в реакцию с глутаминовой кислотой (9). Накопление глутамина могло тормозить реакцию дезаминирования аспартата и его превращение в оксалоацетат и служить одной из причин накопления аспартата у мутанта М-2014.

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о ведущей роли ГАФ-дегидрогеназы в проявлении эффекта гетерозиса у гибридов гороха посевного от скрещивания хлорофилльного мутанта М-2004 и исходного сорта Торсдаг, а также более активном процессе утилизации синтезируемых в результате фотосинтеза углеводов ферментами дыхания.

Литература

Taylor W.С. Regulatory interactions between nuclear and plastid genomes. Annu. Rev. Plant Physiol. and Mol. Biol., 1989, 40, 1: 211-233.

Изогенные линии и генетич. коллекции. Мат. II совещ. Новосибирск, 1993.

Vaishlya О.В., Ladygin V.G., Sokolov V.A. е.а. Characterization of photosynthetic apparatus of pea chlorophyll mutants and their heterotic F₁ hybrids with standard genotype (cv. Torsdag). Photosynthetica, 1998, 35, 3: 428-443.

Соколов В.А. Изучение механизма гетерозиса. Автореф. докт. дис. Новосибирск, 1992.

Методы биохимического исследования растений. Л., 1972.

Plumb-Dhindsa P.L., Dhindsa R.S., Thorpe T.A. Non-autotrophic CО₂ fixation during shoot formation in tobacco callus. J. Exp. Bot., 1979, 30, 117: 759-767.

Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения. М., 1989.

Плохинский Н.А. Биометрия. М., 1970.

Эдвардс Дж., Уокер Д. Фотосинтез С-3 и С-4 растений: механизмы и регуляция. М., 1986.

Соколов В., Шумный В., Цонев Ц. и др. Частота, размер и функциональные характеристики устьиц в связи с гетерозисом у гороха. Изв. СО АН СССР, сер. биол., 1988, 2: 89-94.

Dwayer L.M., Andrews С.J. Carbohydrate levels in field-grown leafy and normal maize genotypes. Crop Sci., 1995, 35, 10: 1020-1027.

Иванищев В.В., Горенкова Л.Г. Исследование ферментов биосинтеза фосфоенолпирувата и утилизации оксалоацетата у изогенных мутантов гороха. Физиол. раст., 1995, 42, 5: 754-758.

Takahama U., Shimizu-Takahama М., Heber U. The redox state of the NADP system in illum. chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1988, 916, 3: 446-452.

Summary

Chloroplast enzymes activity and metabolites content in leaves of chlorophyll mutants of Pisum sativum L. and their hybrids

O.B. Vaishlya, V.V. Ivanishchev

The authors evaluated the chloroplast enzymes activity and metabolites content in leaves of the chlorophyll mutants M-2004 and M-2014 of Pisum sativum L. of the Torsdag variety and also in leaves of their hybrids with original form. The leading role of the GAPH-dehydrogenase in heterosis effect in pea hybrid plants was shown. It was suggested, that respiration enzymes utilized more active the carbohydrates, which are synthesized during photosynthesis.

Размещено на Allbest.ru