Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

В группе из четырех реципиентов сукрольными оказались три (75,0 %). Из 46 микроинъецированных и трансплантированных зигот до 13 сут беременности отмечено развитие 14 эмбрионов (табл. 1). Отсюда можно заключить, что до периода имплантации развиваются 30,4 % зигот от числа трансплантированных. В следующей группе у 10 (71,4 %) из 14 реципиентов беременность завершилась рождением потомства, причем из 212 проинъецированных и трансплантированных зигот было получено 37 крольчат (17,5 %). Следовательно, из числа микроинъецированных 78,7 % зигот развивались in vitro до стадии бластоцисты, а из числа микроинъецированных и пересаженных 30,4 % зигот -- до стадии имплантации и 17,5 % -- до рождения потомства.

Можно предположить, что потери микроинъецированных зигот в процессе культивирования до стадии бластоцисты in vitro составляли 21,3 %, а потери в организме матери к числу микроинъецированных зигот до стадии имплантации -- 59,6 % и до рождения потомства -- 82,5 %, или 22,9 % с периода имплантации до рождения потомства. Следовательно, основная масса микроинъецированных зигот погибала в первой половине беременности.

С целью получения трансгенных особей с геном чГКСФ 2741 микроинъецированная зигота была пересажена 168 самкам-реципиентам, 116 из которых (69,0 %) оказались беременными по результатам окрола. Получено 516 потомков, 17 из которых оказались трансгенными, то есть 18,2 % из числа микроинъецированных зигот развивались до рождения потомства и лишь 3,3 % из полученных крольчат были трансгенными. При этом доля живых трансгенных особей (8 гол.) составляла лишь 1,5 % от числа живых родившихся крольчат; возраста половозрелости из них достигли четыре самца. Для размножения трансгенных животных всех исходных трансгенных самцов спаривали с нетрансгенными самками (табл. 2).

2. Оценка эффективности размножения исходных трансгенных кроликов с геном человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора микроинъецированный зигота трансгенный размножение

Оплодотворяющая способность трансгенных кроликов после первого осеменения по результатам окрола была достаточно высокой -- в среднем 77,9 % (102 самки из 131). Вместе с тем у исходных трансгенных самцов наблюдались значительные индивидуальные различия по оплодотворяющей способности: у двух самцов -- 96,1-100 %, у двух других -- на 30 % ниже.

Наследование чужеродного гена у исходных трансгенных кроликов в F₁ составляло в среднем 16,6 %:

Этот показатель примерно в 3 раза ниже по сравнению с теоретически возможным по закону Менделя. Низкий уровень наследования чужеродного гена в F₁ можно объяснить мозаицизмом исходных трансгенных особей (не все их сперматозоиды были трансгенными), что является обычным явлением при микроинъекции гена в пронуклеус зиготы. У трансгенных кроликов F₁ мозаицизм отсутствовал, поэтому представляло интерес оценить наследуемость чужеродного гена в F₂ и эффективность размножения трансгенных как самцов, так и самок F₁, для чего их спаривали с половозрелыми нетрансгенными особями (табл. 3).

3. Оценка воспроизводительной способности трансгенных кроликов F₁

Почти у всех трансгенных самцов F₁ отмечена нормальная оплодотворяющая способность, исключение составлял один трансгенный самец F₁ (получен от исходного самца № 506), который после многократного спаривания с нетрансгенными половозрелыми самками не дал приплода. Нормальная воспроизводительная способность выявлена только у трансгенных самок F₁, полученных от исходного трансгенного самца № 512; от остальных самцов (№№ 25, 505 и 506) не удалось получить в F₁ трансгенных самок, способных к воспроизводству, за исключением одной, от которой получен один приплод. Повторные многократные спаривания этой самки с нетрансгенными половозрелыми самцами оказались безрезультатными: все трансгенные самки F₁, полученные от этих исходных самцов, плодотворно осеменялись только после многократных спариваний, но ни одна не принесла живого приплода. Как правило, в конце беременности плоды погибали или рождались мертвыми, а самки погибали либо в конце беременности, либо вскоре после родов.

Потери воспроизводительной способности и снижение жизнеспособности самок -- потомков трех исходных самцов можно, по-видимому, объяснить неадекватным местом введения чужеродного гена в геном исходных трансгенных животных.

4. Оценка наследования гена человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора у кроликов F₂, полученных от исходного трансгенного самца № 512

В связи с тем, что нормальной воспроизводительной способностью обладали самки F₁ при скрещивании только с самцом № 512, его использовали при оценке эффективности наследования гена чГКСФ в F₂ (табл. 4).

Наследование чужеродного гена чГКСФ в F₂ составило в среднем 35 %, причем у потомков, полученных от трансгенных самцов F₁, этот показатель был несколько ниже, чем у таковых, полученных от трансгенных самок F₂. Эта разница обусловлена прежде всего тем, что трансгенные родители F₁ в отличие от исходных трансгенных животных не могли быть мозаиками. Эффективность наследования чужеродного гена у потомков F₂ от двух из трех самок F₁ была выше 50 %. Для окончательного суждения о закономерности наследования чужеродного ге-на, по-видимому, необходимо накопление дополнительного материала.

Для определения эффективности наследования чГКСФ в последующих поколениях мы провели спаривание трансгенных самок и самцов F₂: от 21 окролившейся самки было получено 102 крольчонка (по 4,86 на одну самку). Интеграция гена выявлена у 60 из 102 крольчат, что составляет 58,8 % (у потомков F₁ -- 16,5 %; у кроликов F₂, полученных от трансгенных особей F₁, -- 36,6 %). Более высокий показатель интеграции гена у кроликов F₃ (79,5 %) отмечен после спаривания трансгенных самок с трансгенными самцами. Эти показатели приближаются к теоретически ожидаемым (75 % по закону Менделя). В этом случае среди трансгенных особей должно быть 50 % гетерозигот и 25 % -- гомозигот.

У трех трансгенных крольчих мы проанализировали концентрацию чГКСФ в молоке, которая в среднем существенно варьировала -- от 8,80 до 22,03 мг/л.

Таким образом, выявленная нами концентрация чГКСФ в молоке трансгенных кроликов дает основание считать ее достаточной для использования этих животных в фармацевтическом производстве. Поскольку для проведения одного курса лечения онкологических больных требуется 5 мг чГКСФ, 1 л молока достаточно для проведения четырех таких курсов. Следовательно, полученные нами линии кроликов, трансгенных по гену человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора под контролем промотора гена -лактоглобулина быка, могут обеспечить годовую потребность 100 тыс. больных этой категории.

Л И Т Е Р А Т У Р А

G o r d o n K., L e e E., V i t a l e J.A. e.a. Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technology, 1987, 5: 1183-1187.

S i m o n s J.P., W i l m u t I., C l a r k A.J. e.a. Gene transfer into sheep. Bio/Technology, 1988, 6: 179-183.

P u r s e l V.G., R e x r o a d C.E. Jr. Status of research with transgenic farm animals. J. Anim. Sci., 1993, 71 (Suppl. 3): 10-15.

B a w d e n C.S., S i v a p r a s a d A.V., V e r m a P.J. e.a. Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep. Transgenic Res., 1995, 4: 87-91.

R o s e n g a r d A.M., G a r y N., H o r s l e y J. e.a. Endothelial expression of human decay accelerating factor in transgenic pig tissue: a potential approach for human complement inactivation in discordant xenografts. Transplant. Proc., 1995, 27: 326-341.

Y a n n o u t s o s N., L a n g f o r d G.A., C o z z i E. e.a. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation. Transplant. Proc., 1995, 27: 324-329.

K u b o t a N., O r i t a T., H a t t o r i K. e.a. Structural characterization of natural and recombinant human granulocyte colony-stimulating factors. J. Biochem., 1990, 107: 486-492.

F r a m p t o n J.E., L e e C.R., F a u l d s D. Filgrastim a review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in neutropenia. Drugs, 1994, 48: 731-760.

К о J.Ho., L e e C.-S., K i m K.H. e.a. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat. Transgenic Res., 2000, 9: 215-222.

U u s i - O u k a r i M., H y t t i n e n J.M., K o r h o n e n V.P. e.a. Bovine _sl-casein gene seguences direct high level expression of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the milk of transgenic mice. Transgenic Res., 1997, 6: 75-84.

W a l l R.J., H a w k H.W. Making transgenic livestok. Genetic Engeering on a Large Scale. J. Cellular Biochemistry, 1992, 49: 113-120.

E b e r t K.M., S e l g r a t h J.P., T u l l i o P.D. e.a. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology, 1991, 9: 835-839.

W r i g h t G., C a r v e r A., C o t t o m D. e.a. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Bio/Technology, 1991, 9: 830-835.

V e l a n d e r W.H., J o h n s o n J.L., P a g e R.L. e.a. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89: 12003-12007.

Размещено на Allbest.ru