Методы приготовления различных питательных сред

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

"Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого"

Институт: Институт Медицинского образования

Направление: Стоматология

Кафедра микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней

Исследовательская работа по микробиологии

на тему:

Методы приготовления различных питательных сред

Великий Новгород 2019г.

Введение

Питательные среды в микробиологии - это однокомпонентные или многокомпонентные субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры.

Микробы, как любые другие живые организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов осуществляют за счёт постоянного обмена веществ с окружающей его внешней средой, т.е. путём питания и дыхания.

Типы питания, дыхания (аэробы и анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают при разработке составов питательных сред и условий культивирования микробов invitro.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, для выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств. Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать определенным требованиям.

Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Требования, предъявляемые к средам

· Быть питательными, то есть содержать в легко усваиваемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать.

· Иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2--7,4). Исключение составляют холерный вибрион - его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5--9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2--6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, то есть содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена.

· Быть изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида.

· Быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды.

· Плотные средым должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию.

· Обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10.

· Быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов.

Желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Техника приготовления основных питательных сред

Для культивирования микробов в лабораторных условиях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т.п.),искусственные, приготовленные из продуктов животного или растительного происхождения, и синтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90--100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.

Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18--20° С в однородный коллоидный студень и расплавляющийся при 25--27° С.

В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.

Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них микроорганизмы должны быть хорошо видны и иметь определенную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.

Классификация питательных сред

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар (простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.

2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь, гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl2, раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия.

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества - соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Также по назначению различают среды:

1) стандартные (универсальные) - предназначаются для культивирования большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные - предназначаются для выращивания только определенного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические - предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.

Стандартные питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ).В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18--20 ч в прохладное место (4--6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в течение часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа. При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необходимо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2--7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20--30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2--3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2--7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды. Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2--3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посуды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. Затем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно приготовить агар скошенной формы, пробирки с расплавленным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом пробирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ).К мясопептонному бульону добавляют 10% зимой и не менее 18--20% летом измельченного желатина и подогревают в текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН 7,2 путем добавления 10%-ного раствора NaОН. После охлаждения до 60°С осветляют яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом аппарате 20--30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и разливают по пробиркам. Стерилизуют дробно по 15--20 мин три дня подряд при температуре 100°С.

Картофельная среда. Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 2--3 ч для нейтрализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики, диаметр которых должен соответствовать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки с водой и разрезают по диагонали на две части, подсушивают фильтровальной бумагой и половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок используют обычные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревянные палочки, а на них - картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20--25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л дистиллированной воды растворяют 30 г пептона. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-- 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4--7,6, разливают по 10 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холодной дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

Специальные (элективные) питательные среды

Среды для выращивания анаэробных микробов. Мясопептонный печеночный бульон Кита - Тароцци (МППБ). Свежую или замороженную печень (лучше крупного рогатого скота) режут на мелкие куски, заливают равным по массе количеством водопроводной воды, варят в течение часа, фильтруют через вату и добавляют к 1 части полученного экстракта 3 части мясопептонного бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют химически чистую поваренную соль (на 1 л среды 1,25 г) и доводят рН до 7,6--7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный или увлажненный ватный фильтр. К профильтрованному бульону добавляют мелко нарезанные кусочки (по 1,5-- 2 г) печени, из расчета на 1 л бульона 100 г печени (печень предварительно очищают от пленок и промывают водой). В пробирку помещают несколько таких кусочков, наливают высоким столбиком 7--10 мл бульона, на поверхность его наслаивают вазелиновое или парафиновое масло.

Бульон с кусочками печени стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин. С целью удаления из пробирки кислорода перед посевом среду кипятят 10 мин и быстро охлаждают водой.

Полужидкий агар для анаэробов. К МПБ добавляют 0,25--0,75% агар-агара и 1% глюкозы; рН среды 7,4. Среду разливают высокими столбиками в пробирки. Стерилизуют дробно текучим паром по 15--20 мин в течение 3 дней.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий. Молоко (цельное).Нагревают до кипения. Наливают в тубусную склянку и ставят на 10--20 ч в холодное место для отстаивания сливок. По истечении этого времени через кран тубуса разливают обезжиренную часть молока по пробиркам, закрывают ватными пробками. Стерилизуют дробно при 100°С три дня по 20 мин или при 112° С однократно 30 мин.

Обезжиренное молоко. Для получения обезжиренного молока цельное молоко сепарируют и далее поступают так же, как при использовании цельного молока. питательный микробиология субстрат

Гидролизованное молоко (по Богданову).Берут 1 л прокипяченногои остуженного до 45° С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6--7,8, добавляют 0,5 г порошка панкреатина (разведенного предварительно в небольшом количестве теплой воды) или 2--3 г измельченной поджелудочной железы и через несколько минут 5 мл хлороформа. После этого бутыль тщательно встряхивают, плотно закрывают корковой пробкой и помещают на 3 суток в термостат при температуре 40° С при ежедневном встряхивании жидкости. По истечении указанного срока с целью удаления хлороформа бутыль открывают, жидкость фильтруют и разбавляют в 2--3 раза водопроводной водой. Доводят рН среды до 7,0-- 7,2 и стерилизуют.

Агар из гидролизованного молока. К гидролизованному молоку прибавляют 1,5--2% агара, расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПав течение 15 мин. На этой среде хорошо растут молочнокислые палочки.

Сывороточный агар. На 100 мл водопроводной воды берут 7,5 г агара, кипятят до полного растворения, добавляют воды до первоначального объема (т. е. в объеме, равном объему испарившейся воды), прибавляют 400 мл заранее приготовленной молочной сыворотки, подвергают действию текучего пара в течение 30 мин, фильтруют через слой ваты, разливают по пробирками стерилизуют под давлением 0,05 МПа в течение 30 мин.

Капустная среда. 200 г измельченной капусты (или люцерны) заливают 100 мл воды и кипятят в кастрюле 10 мин, отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и разводят в 2 раза водопроводной водой. Добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, разливают по пробиркам и стерилизуют три избыточном давлении 0,05 МПа в течение 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей. Примерно в 1 л дистиллированной воды вносят 200 г предварительно подогретого меда, 1 г двуфосфорнокислого калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г виннокислого аммония, 0,1 г хлористого натрия и 0,1 г хлористого калия. Все компоненты смешивают и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среда для выращивания галофилов. Используют обычные мясопептонные среды с добавлением от 10--15 до 20--30% поваренной соли. Кроме того, при изготовлении плотных питательных сред увеличивают и процентное содержание агара. Стерилизацию проводят под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среды обогащения. Среда Мюллера. К 4,5 г химически чистого мела, предварительно простерилизованного сухим жаром, добавляют 90 мл МПБ и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение-20 мин. Готовят: а) раствор гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита заливают до 100 мл дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин); б) раствор йода (20 г металлического йода и 25 г йодистого калия заливают до 100 мл дистиллированной водой). Перед посевом к бульону с мелом стерильно добавляют 10 мл раствора гипосульфита и 2 мл раствора йода. При добавлении каждого ингредиента смесь взбалтывают. Разливают по стерильным пробиркам или колбам.

Среда Киллиана. К 100 мл обычного МПБ стерильно добавляют перед использованием 1 мл водного раствора (1:1000) бриллиантового зеленого.

Дифференциально-диагностические (цветные) питательные среды

Среда Эндо. К 100 мл нейтрального расплавленного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекислого натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в течение 10 мин при температуре 100°С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следующим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спиртового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний принимает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса. Для изготовления индикатораАндредэ берут 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдерживают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте. Среду с индикатором Андредэ приготовляют следующим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0--7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0--7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% - 1% (лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета образования газа бродильными трубочками. Вместо трубочек иногда помещают кусочки ваты - 0,02 г на пробирку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера. В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Стерилизация питательных сред

Богатая питательная среда - прекрасный субстрат для развития в ней микроорганизмов. Для обеззараживания питательных сред используют химическое воздействие (дезинфекция), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен для применения.

В биотехнологии широко используют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.) Как известно, отдельные компоненты питательных сред также по-разному реагируют на термическое воздействие. Особенно термолабильны органические соединения: витамины, углеводы, гормоны и др. Сложные сахара и полисахариды при автоклавировании частично гидролизуются. Степень гидролиза зависит от источника углерода, температуры и продолжительности автоклавирования. При высоких температурах происходит карамелизация сахаров. Растворы, содержащие аминокислоты и восстанавливающие сахара, при термическом воздействии приобретают коричневатый цвет вследствие сахароаминных реакций. Все эти процессы сильно зависят от рН используемой среды. Существует сложная зависимость между рН среды, содержанием ионов, температурой, продолжительностью автоклавирования, с одной стороны, и степенью термодеградации питательных сред - с другой. Во избежание нежелательных деструктивных изменений компонентов питательных сред (субстратов) применяют по возможности более мягкие режимы стерилизации или раздельную стерилизацию компонентов. Высокие, но кратковременные температурные режимы инактивируют споры бактерий, оказывая минимальное влияние на биологически активные компоненты среды.

В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред проводят в автоклавах паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации.

Установлено, однако, что температура выше 1210С может быть причиной нарушения качества сред и, как следствие, плохого роста культур. К тому же в принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов питательных сред, что при прочих равных условиях позволяет уменьшать время стерилизации, так как укорачивается период прогрева проб.

В последнее десятилетие широкое распространение для получения стерильных воздуха и различных жидкостей приобрела мембранная фильтрация. Это разновидность холодной стерилизации, которая эффективна для стерилизации термолабильных веществ. Наиболее распространенными процессами являются обычная фильтрация (макрофильтрация -1-10 мкм), микрофильтрация (20 -10 мкм), ультрафильтрация, диализ (10 мкм-1 нм). Если для макрофильтрации применяются обычные бумажные или стеклянные фильтры, то для остальных используются нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливинильные, полиамидные, фторуглеродные мембраны толщиной менее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в пределах 10-4-10 мкм. Для стерилизации в биотехнологических целях достаточно микрофильтрации.

Определение рН питательных сред

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0--7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной практике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

№1

Цель: Приготовить питательную среду для выделения и идентификации энтеробактерий

Материалы и оборудование: стерильные пробирки, мерная посуда (колбы, цилиндры), аналитические весы, электроплита, лабораторный дозатор, дистиллированная вода, шпатель, ламинарный шкаф, шкафы для хранения сухих смесей и компонентов сред, готовая питательная среда.

Состав питательной среды г/л:

· Натрий додецилсульфат 0,5

· Пептон сухой ферментативный 7,5

· ПГРМ 7,5

· Лактоза 10,0

· Натрия хлорид 6,0

· Бромтимоловый синий 0,05

· Натрия карбонат 0,3± 0,05

Ход выполнения работы:

Приготовление среды: Отмеряем на аналитических весах 3,2 гр. готовой питательной среды, пользуемся стерильным шпателем. Наливаем 100 мл дистиллированной воды в тару для варки, добавляем порошок, перемешиваем шпателем. Ставим тару на электроплиту и кипятим 1-2 мин. Разливаем немного остывший раствор по 5 мл в стерильные пробирки с помощью дозатора. Не автоклавируем!

Вывод: Готовая среда после стерилизации кипячением прозрачная, зеленого цвета. Среду можно использовать в течении 7 суток при условии ее хранения при температуре 2-8 °C в темном месте.

Наличие роста и ферментацию лактозы в SDS- бульоне устанавливают визуально по диффузному помутнению среды и изменению цвета среды из зеленого в желтый.

№2

Цель: Приготовить питательную среду для выделения стафилококков.

Желточно-солевой агар.

Материалы и оборудование: чашки Петри, бутыль, мерная посуда (колбы, цилиндры), аналитические весы, электроплита,, дистиллированная вода, физиологический раствор, шпатель, ламинарный шкаф, шкафы для хранения сухих смесей и компонентов сред, готовая питательная среда

Ход выполнения работы:

Состав: яично-желточная эмульсия 100 мл, питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой, натрия хлорид,, динатрия фосфат обезвоженный.

Приготовление среды: Отмеряем на весах 23,3 гр. питательной среды. Измеряем с помощью мерного цилиндра 200 мл дистиллированной воды. Наливаем воду в бутыль, добавляем порошок в воду и перемешиваем до полного растворения агара. Затем закрываем бутыль крышкой и пишем название и дату приготовления. Ставим бутыль в автоклав и автоклавируем в течение 15-20 мин. при температуре (121±2)°С. Среду охлаждаем до температуры 45-50°С.

Желточно-солевой агар.

Для растворения застывшей среды используем "водяную баню".

Пока растворяется агар. Готовим яично-желточную эмульсию.

Во флакон отмеряем 100 мл. физиологического раствора. Куриное яйцо протираем ватой, смоченной этиловым спиртом, отделяем желток от белка, с помощью стерильного инструмента. Выливаем желток в стерильную колбу с физиологическим раствором, содержимое встряхиваем до однородности. Мы получили яично-желточную эмульсию.

Далее в 200 мл растопленного агара добавляем 40мл. яично-желточной эмульсии. Тщательно перемешиваем.

Смесь разливаем в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм.

Вывод: После застывания среды в чашках ее подсушивают, соблюдая правила асептики, при температуре (37±1) в течение 40-60 мин. Готовая среда в чашках Петри светло-желтого цвета.

Готовую среду можно использовать в течение 10 сут при условии хранения ее при температуре от 2 до 8°С.

Заключение

Микроорганизмы культивируют на питательных средах. К универсальным средствам относят мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон. Первая характеристика изучаемого микроорганизма определяется способностью его роста на универсальных средах. На плотных питательных средах многие микроорганизмы образуют колонии. Для микроорганизмов, не растущих на обычных средах, используют специальные среды. Для выделения каких-либо определенных видов, отличающихся особенностями роста, применяют элективные среды.

В процессе проведенной практической работы, нами были получены навыки приготовления питательных сред.

Мы приготовили среды для выделения и идентификации энтеробактерий. Среда предназначена для выделения энтеробактерий и их идентификации по признаку ферментации лактозы при санитарном обследовании пищевых продуктов и объектов внешней среды.

Также был приготовлен желточно-солевой агар, который предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала: пищевые продукты, грудное молоко, смывы, вода, кровь, кал, моча, мокрота, мазки из носоглотки, отделяемое ран, свищей, глаз и др.

В лабораториях используют сухие готовые питательные среды, чтобы придти к общей стандартизации питательных сред

Правильный подбор и использование питательных сред обеспечивает успешное культивирование микробов для накопления биомассы и её биотехнологическое использование для производства диагностических и вакцинных препаратов, определения и идентификации микробов в диагностической лаборатории и научных исследованиях.

Список литературы

1. https://fb.ru/article/251675/sredyi-pitatelnyie-v-mikrobiologii

2. https://bio.wikireading.ru/4217

3. https://pcgroup.ru/blog/pitatelnye-sredy-v-mikrobiologii/

4. https://studfile.net/preview/3005951/

5. https://www.activestudy.info/pitatelnye-sredy/

6. https://бмэ.орг/index.php/ПИТАТЕЛЬНЫЕ_СРЕДЫ

Размещено на Allbest.ru