Получение диагностических наборов для серодиагностики инфекционного гепатита плотоядных

Размещено на http://www.allbest.ru//

Получение диагностических наборов для серодиагностики инфекционного гепатита плотоядных

Урюмцева Татьяна Игоревна

Введение

Мероприятия по борьбе с инфекционными заболеваниями животных по сей лень является одной из актуальных задач ветеринарии. Болезни бактериальной и вирусной этиологии способны нанести огромный экономический ущерб не только промышленному животноводству, но и деятельности по разведению мелких домашних животных.

Расширению нозоареалов ряда вирусных болезней способствует возрастание объемов экспортно-импортных операций.

Вирусные инфекции занимают значительное место в патологии мелких домашних животных, имеют разную форму клинического течения, включая развитие осложнений. Изучение вопроса распространенности и частоты встречаемости вирусных инфекций необходимо для проведения мониторинга инфекционных заболеваний у собак, что имеет особую актуальность в условиях популяризации и развития служебного и декоративного собаководства, а также способствует осуществлению верных алгоритмов диагностики с применением эффективных методов терапии. [1, 2]

Инфекционный гепатит собак имеет широкое распространение с отягощенным влиянием на уровень здоровья животных. В городских условиях болезнь поражает собак различных пород и возрастов, наиболее подвержены заболеванию щенки в 2-6 месячном возрасте. [3, 4, 5]

Решающее значение в диагностике придается лабораторным исследованиям, при которых необходимо исключить чуму, лептоспироз, бешенство, сальмонеллез, токсоплазмоз, авитаминоз В1, алиментарные интоксикации, а также парвовирусный энтерит собак. [6]

Эффективность методов диагностики во многом зависит от активности и специфичности диагностических препаратов.

Помимо клинического материала широко используется опыт культивирования вакцинных штаммов в клеточных системах с последующим использованием выделенных вирусов в качестве составляющих диагностических систем.

Материалы и методы. При проведении исследований был использован вакцинный штамм вируса инфекционного гепатита собак (ИГС), полученный в Научно-исследовательском сельскохозяйственном институте Национального центра по биотехнологии. Для культивирования использовали культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов, перевиваемые культуры клеток почки эмбриона свиньи, почки телёнка, почки собаки (MDCK), почки сирийского хомячка (ВНК-21). Использовали стационарный режим культивирования в матрасах. Культивирование в первичной и субкультуре клеток фибробластов куриных эмбрионов и перевиваемых линиях клеток почки собаки и сирийского хомячка показало наиболее высокие титры. Использование в экспериментах культур клеток фибробластов куриных эмбрионов является нетехнологичным, по этой причине исследования были продолжены с перевиваемой линией клеток почки собаки и перевиваемой линией клеток сирийского хомячка. Для культивирования использовали вращающиеся сосуды заражение производили в дозе 0,1 ТЦД 50/клетку. При получении цитопатогенного действия (ЦПД) более чем в 70 % монослоя клеток собирали урожай вируса.

Результаты исследований. Активность культивируемого штамма вируса в линиях клеток MDCK возрастала с ростом пассажного уровня, при неизменных сроках культивирован. Стабильность высоких титров вирусного материала в культуре клеток MDCK не зависела от пассажного уровня и сроков наступления деструкции монослоя.

По результатам данных исследований определили оптимальные системы для наращивания в высоких титрах вакцинного штамма вируса инфекционного гепатита собак. Было определено культивирование вакцинного штамма вируса ИГС в культуре клеток MDCK в роллерной системе.

При получении диагностических наборов необходимо обеспечить получение высокой активности антигена с сохранением специфичности. При получении вирусного диагностикума важно изыскать оптимальные методы концентрирования и очистки вирусного материала.

С этой целью заражённые вакцинным штаммом ИГС культуру клеток MDCK, выращенную во вращающихся сосудах, при наступлении деструкции монослоя в 75-80 %, снимали двумя способами: шпателем с резиновым наконечником и раствором Версена. Для концентрирования вируса использовали следующие растворы: раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000), раствор сульфата аммония, также применялось центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 мин. Для очистки антигена от балластных белков клеточного слоя осуществляли двукратный термолизис клеток, затем подвергали центрифугированию.

Активность полученных антигенных препаратов проверяли при постановке реакции диффузионной преципитации (РДП) и реакции связывания комплемента (РСК) со специфической сывороткой против ИГС. Специфичность полученных антигенных препаратов проверяли при постановке РСК используя нормальные и гетерологичные сыворотки крови животных.

Результаты проверки специфической активности полученных антигенов вируса ИГС, полученных различными методиками, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Специфическая активность полученных антигенов возбудителя ИГС

серодиагностика вакцинный вирус

Как видно из таблицы 1, наиболее активен антиген вируса ИГС полученный путем центрифугирования клеток монослоя, которые поражены на 75 и более процентов, с дальнейшим ресуспендированием осадка с одной сотой части первоначального объёма суспензии, неоднократным термолизисом и осаждением клеточного балласта.

При проверке активности в серологических реакциях в РСК показан титр до 1:40, в РДП до 1:8.

При проверке на специфичность вирусного антигена полученного путем центрифугирования клеток снятых механически при поражении монослоя с повторным суспендированнием преципитата после центрифугирования в 1/100 части первоначального объёма смеси, термолизисом в двукратной повторности и выделением балласта применяли сыворотки против ИГС, чумы плотоядных, аденовирусной инфекции КРС, парвовирусного энтерита, а также сыворотки от здоровых животных. В РСК было продемонстрированно, что антиген вируса инфекционного гепатита собак обладает высокой степенью специфичности с нормальными и гетерологичными сыворотками. Были получены положительные результаты с сыворотками крови, которые содержали антитела против вируса ИГС и аденовирусы КРС, что объясняется антигенным родством (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты проверки диагностического антигена вируса инфекционного гепатита собак на специфичность

ПРИМЕЧАНИЕ:

- результат отрицательный

Заключение

Важно было установить возможность использования полученного вирусного антигена в прочих серологических реакциях, в частности, в реакции агглютинации латекса (РАЛ). Тенденция к использованию в качестве носителей антигенов и антител инертных синтетических материалов продиктовала изучение возможности использования, полученного диагностического вирусного антигена при постановке РАЛ. При сравнении результативности обнаружения специфического антигена вируса инфекционного гепатита собак при постановке серологических реакций (РСК и РАЛ) получили примерно одинаковой результат, титры выявляемых антигенов изменялись в пределах от 1:4 в РСК и до 1:256 в РАЛ. Апробированный метод позволяет производить специфические диагностические антигены вируса инфекционного гепатита собак, которые можно использовать при постановке серологических реакций с активностью в РДП 1:4-1:8 и в РСК 1:20-1:40. Ценность использования специфического антигена при постановке РАЛ, заключается в возможности прижизненной диагностики ИГС.

Список литературы

1. Афанасьев. Е.П. Парвовирусный энтерит собак// Ветеринария. - 2013. - № 5. - С. 64 -67.

2. Гаврилов К.Е., Середа А.Д. Защита животных против чумы плотоядных и рассмотрение новых подходов к решению данной проблемы// Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: сборник научных работ. - Ульяновск, 1998.-С. 156-163.

3. Китаев Н.С., Петрова О.Г. Эпизоотологические особенности инфекционного гепатита собак в условиях г. Екатеринбурга// Аграрный вестник Урала. - Екатеринбург, 2010. - № 11-2 (77). - С. 25.

4. Уколова М.В. Гепатиты собак в условиях мегаполиса (этиология, патогенез, особенности распространения, терапия): дис. канд. вет. наук. - М., 2005. -148 с.

5. Хожаева И.Г. Чума и парвовирусный энтерит собак в условиях крупного промышленного города: эпизоотология, клиника, иммунология и меры борьбы: автореф. дис. канд. вет. наук. - Алматы, 2001 - 21 с.

6. Белов А.Д., Данилов Е.П., Дукур И.И. и др. Болезни собак. М.: Агропромиздат, 1990. - 368с.

Размещено на Allbest.ru