Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus

Размещено на http://allbest.ru

22

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus

03.02.08 - экология

Богатыренко Елена Александровна

Владивосток, 2013

Работа выполнена на кафедре экологии Школы естественных наук Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Бузолева Любовь Степановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член - корреспондент РАЕ, зав. кафедрой анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы, профессор ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Чхенкели Вера Александровна

кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН Белькова Наталья Леонидовна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО "Дальрыбвтуз"

Защита диссертации состоится 30 мая 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГУ по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Бульвар Гагарина, 24.

Отзывы просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, биолого-почвенный факультет ИГУ. Тел. / факс: (3952) 241855; e-mail: dissovet07@gmail.com.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент А.А. Приставка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Дальневосточный трепанг Apostichopus japonicus относится к важным объектам промысла в морях Дальнего Востока, являясь одним из самых дорогих и востребованных на международном рынке морепродуктов.

Несмотря на то, что у побережья Китая обитает около 20 видов голотурий, в том числе и таких коммерчески важных, как Thelenota ananas, Actinopyga miliaris, Holothuria nobilis, наиболее высоко ценится продукт, получаемый именно из дальневосточного трепанга, поэтому он пользуется повышенным спросом в Китае, Корее, Японии.

Ткани гидробионта содержат богатый набор биологически активных химических соединений, что обуславливает высокую фармакологическую ценность получаемых из трепанга продуктов (Левин, 2000).

Пищевая и целебная ценность голотурии привела к интенсификации промысла и несоблюдению норм вылова, а с начала 90-х годов прошлого столетия, и к массовому браконьерскому вылову дальневосточного трепанга, что, в конечном счете, сказалось на значительном сокращении численности популяций этого животного во всех районах его обитания.

При наметившейся тенденции уменьшения запасов данного биоресурса вполне очевидно, что за счет естественного воспроизводства численность беспозвоночного восстановиться не сможет, что в итоге приведет к исчезновению вида Apostichopus japonicus (Сергеенко, Дубровский, 1994).

На сегодняшний день одним из способов восстановления численности популяции дальневосточного трепанга является марикультура. В Приморском крае России уже существуют десятки акваферм, занимающихся искусственным разведением голотурии.

Одной из ключевых проблем подобных морских хозяйств является высокая смертность трепанга на ранних стадиях его развития, что, по мнению некоторых ученых, связано со снижением иммунитета гидробионта и его подверженности различным инфекционным заболеваниям из-за постоянно действующих факторов стресса: высоких нагрузок биомассы на единицу объёма, органических загрязнений воды, перепадов концентрации кислорода (Захарова, Шатковская, 2008).

Тем не менее, в литературе отсутствуют данные о влиянии искусственных условий воспроизводства на изменение состава и численности бактериальных сообществ кишечной микрофлоры трепанга, также как и отсутствуют данные о составе нормальной кишечной микрофлоры этого гидробионта.

Известно, что дальневосточный трепанг по способу питания является детритофагом-грунтоедом, и в среднем за год через его кишечник проходит огромное количество грунта вместе с различными микроорганизмами и останками морских растений и животных (Левин, 1982).

Таким образом, становится очевидным огромное значение собственной микрофлоры трепанга в переработке и усвоении попадающей с пищей органики.

Как показывает зарубежный и отечественный опыт, одним из наиболее перспективных способов снижения смертности промысловых видов рыб, моллюсков и ракообразных при их искусственном разведении является использование препаратов на основе пробиотиков, которые представляют собой живые организмы и (или) вещества микробного или иного происхождения, повышающие активность иммунной системы, принимающие активное участие в процессах пищеварения, способствующие восстановлению естественной микрофлоры (Бурлаченко и др., 2006). В настоящее время известно несколько механизмов положительного воздействия пробиотиков на организм, одним из которых является синтез пищеварительных ферментов, улучшающих деятельность желудочно-кишечного тракта (Verschuere et al., 2000).

На сегодняшний день в литературе наиболее полно описаны эколого-географические аспекты использования ресурсов Apostichopus japonicus для сохранения и восстановления его численности (Лебедев, 2002).

Что же касается изучения микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга, то информация по данному вопросу практически отсутствует.

В работе Шульгиной Л.В. (1982) приведены данные только о сезонной динамике численности бактерий в пищеварительном тракте голотурии, детрите и морской воде из мест обитания животного. О ферментативной активности выделенных из дальневосточного трепанга микроорганизмов упоминается лишь в некоторых работах, целью которых был поиск источников биологически активных ферментов (Урванцева и др., 2006; Беленева и др., 2010; Hirimuthugoda et al., 2007).

Цель данной работы - изучить качественный, количественный состав и биохимические свойства бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга из естественной среды обитания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из кишечников трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.

2. Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из грунтов с мест обитания трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.

3. Изучить активность пищеварительных ферментов бактерий, выделенных из кишечника трепанга.

Научная новизна работы. Впервые изучены видовой состав и численность культивируемых бактерий, входящих в состав кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга. Установлено, что бактериальное сообщество кишечника трепанга формируется за счет микробиоты грунта из мест обитания голотурии.

Впервые представлена качественная и количественная характеристика амилолитической, хондроитинсульфатазной, хитинолитической, альгинатлиазной, липолитической и протеолитической активности кишечной микрофлоры трепанга.

Практическая значимость работы. Впервые получена коллекция штаммов бактерий, населяющих кишечник дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus. Полученные микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью, что делает их весьма ценными для использования в биотехнологии.

Кроме того, ряд выделенных штаммов с высокими значениями активности пищеварительных ферментов, рекомендован для применения в качестве пробиотиков при искусственном разведении голотурий. Фрагменты работы используются в качестве материалов для лекций учебной дисциплины «Морская микробиология» и летней практики студентов Дальневосточного федерального университета.

Защищаемые положения:

1. Видовой состав бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга специфичен, так как формируется за счет только факультативно анаэробных бактерий, населяющих грунты в местах обитаний голотурии.

2. Бактерии кишечной микрофлоры трепанга характеризуются высокой активностью пищеварительных ферментов как потенциальные пробиотики для использования в марикультуре.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии», г. Владивосток, 2009; IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии», г. Владивосток, 2010; I Дальневосточной междисциплинарной молодежной научной конференции «Современные методы научных исследований», г. Владивосток, 2011; 3-ем Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах», г. Иркутск, 2011; XIII международной научно-практической конференции "Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности и экономике", Санкт-Петербург, 2012. Результаты исследований были представлены на VI Межрегиональной экологической научно-практической конференции «Экологические аспекты региона», г. Воронеж, 2010; Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию со дня рождения И.И. Месяцева, г. Мурманск, 2010; I Международной научно-практической конференции «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий», Чебоксары, 2011. трепанг голотурия кишечный микрофлора

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения; обзора литературы, посвященного актуальности искусственного воспроизводства дальневосточного трепанга, проблемам, связанным с его культивированием, а также международному опыту успешного применения пробиотиков в марикультуре; главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов; двух экспериментальных глав, посвященных изучению бактериального состава микрофлоры кишечника трепанга, а также характеристике активности пищеварительных ферментов, полученных из него штаммов бактерий; выводов; списка литературы, который включает 147 источника, в том числе 83 иностранных, и 19 приложений.

Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, 9 таблицами и 19 приложениями. Данная работа выполнена при финансовой поддержке фондов Министерства образования и науки по проектам: 1.2.09; АВЦП 2.1.1./4793; Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, дог. № 11.G34.31.0010

Благодарности. Автор искренне благодарит своего научного руководителя Бузолеву Любовь Степановну, д.б.н., профессора за всестороннюю помощь, поддержку и за помощь в освоении экспериментальных методов, а также ценные консультации на всех этапах работы. Особую благодарность автор выражает профессору Чши Чжемину, заведующему лаборатории морских микроорганизмов Океанологического университета г. Циндао (Китая), а также всем сотрудникам указанной лаборатории за помощь в проведении экспериментов и постоянный интерес к работе.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе описаны морфология, биология, экология дальневосточного трепанга, подчеркнута актуальность проблемы сокращения численности природной популяции животного за счет браконьерства, а так же рассмотрены особенности и проблемы культивирования трепанга в искусственных условиях. Изучены различные классификации пробиотиков, показаны механизмы их положительного воздействия на организм хозяина. Проанализирован опыт успешного применения пробиотиков при искусственном разведении гидробионтов.

Глава 2. Материалы и методы

Выделение и идентификация микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания. Для проведения исследований по изучению свойств микрофлоры дальневосточного трепанга (Apostichopus japonicus) в августе 2004 и 2006 г.г. на глубине 5-10 м было собрано 10 взрослых особей голотурии (по 5 из каждого района) из б. Алексеева и б. Киевка Японского моря (Приморский край России). Одновременно с этим, в указанных районах были отобраны пробы грунта в местах обитания трепангов. В условиях стерильности кишечники трепангов были извлечены с помощью скальпеля и гомогенизированы. Гомогенат тканей и суспензию грунта после серийных разведений высевали на агаризованную питательную среду СММ (среда для морских микроорганизмов) и культивировали в термостате при температуре 25єC в течение двух суток (Youchimizu, Kimura, 1976). После этого различные по морфологии одиночные колонии подсчитывали, а затем откалывали с помощью микробиологической петли и пересевали на чашки с той же средой для получения чистых культур. Численность микроорганизмов выражали в КОЕ/г массы сухого гомогената ткани кишечника или грунта.

Идентификацию полученных штаммов бактерий проводили на основе морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств. Отдельно выбранные штаммы были идентифицированы с помощью готовых биохимических API - тестов производства компании bioMerieux (Франция). Для подтверждения таксономического статуса некоторые штаммы идентифицировали с применением анализа последовательностей 16S рРНК генов.

Дальнейшая работа по изучению ферментативной активности микроорганизмов проводилась путём посева штаммов на плотные и жидкие среды с хитином, крахмалом, хондроитинсульфатом, альгинатом натрия, твинами 40 и 80, оливковым маслом, казеином и желатином.

Определение активности амилаз и хондроитинсульфатаз. Для качественного определения амилолитической и хондроитинсульфатазной активности исследуемые штаммы были высеяны на чашки с агаризованными минерально-солевыми средами, содержащими крахмал и хондроитинсульфат соответственно. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре 25^?С трое суток, после чего в чашки с крахмальной средой добавляли раствор Люголя и отмечали появление светлых колец вокруг колоний, свидетельствующее о наличии амилаз, а на среде с хондроитинсульфатом фиксировали образование зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий. Для количественной оценки продуктивности ферментов из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили взвеси, которые вносили в жидкую СММ, и выращивали на качалке при 25єС в течение двух суток. Активности ферментов измеряли по методу Шомодьи (Somogyi, 1952).

Определение хитинолитической активности. Хитиназную активность учитывали в динамике (через 2, 4, 7 и 9 дней) по зонам просветления вокруг посева на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота коллоидный хитин.

Для дальнейшего изучения свойств бактерий, проявивших активность на плотной среде, приготовленные из суточных культур бактериальные взвеси вносили в жидкую питательную среду, содержащую нативный хитин (10 г/л), и выращивали на качалке при 25єС в течение 9 суток (Слабоспицкая, Крымовская, 1992). Хитинолитическую активность определяли в динамике через 2, 4, 7 и 9 суток, используя модифицированный колориметрический метод оценки количества N-ацетиламиносахаров (Reissing et al., 1955).

Определение активности альгинатлиаз. Для качественной оценки альгинатлиазной активности использовали агаризованную питательную среду с альгинатом натрия и учитывали в динамике через 2, 3 и 4 суток степень гидролиза субстрата вокруг посева (в мм). Из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили бактериальные взвеси, которые вносили в жидкую среду с альгинатом натрия (10 г/л) и выращивали на качалке при 25єC 4 суток (Kitamikado et al., 1990). Активность фермента определяли в культуральной жидкости, полученной после центрифугирования, визкозиметрическим методом по изменению вязкости 0.3%-ого раствора альгината натрия, приготовленного на трис-HCL- буфере с добавлением 1.9% NaCl.

Определение липолитической активности. Для качественного определения липолитической активности исследуемые штаммы были высеяны на чашки с агаризованными средами со специфическими субстратами в качестве источника углерода.

Образование и активность ферментов липолитического комплекса оценивали по появлению отчетливых зон деэтерифицированного субстрата: оливкового масла или твинов 40 и 80 (по 0.5%), после трехсуточного инкубирования при 25^?С на МПА с добавлением CaCl₂ (Ota et al., 1966). Для количественной оценки липолитической активности бактериальные культуры выращивали в колбах емкостью 750 мл в условиях аэрации на качалке (200 об/мин) при 25^?С в течение 3х суток с 50мл жидкой синтетической среды с добавлением оливкового масла или твинов (0.5% в 1/15 М фосфатном буфере, pH 7.0). По окончании ферментации в бесклеточном фильтрате определяли активность липаз титрометрическим методом с использованием 40% эмульсии оливкового масла в 2% водном растворе поливинилового спирта (Ota et al., 1966).

Определение протеолитической активности. Для качественной оценки протеолитической активности исследуемые штаммы высевали на агаризованную среду Пфеннига (Поляк и др., 2002) с добавлением 1.5% казеина или 1.5% желатина.

Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре 25^?С трое суток, после чего фиксировали образование зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий. Для количественной оценки продуктивности ферментов из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили взвеси (2 млрд. микробных тел в 1 мл), которые вносили в жидкую СММ, и выращивали на качалке при 25єС в течение двух суток. Активность ферментов определяли спектрофотометрическим методом. В качестве белкового субстрата использовали 1% казеин или 1% желатина.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Сходство таксономического состава микробных сообществ грунтов и кишечников трепангов из районов исследования изучали с помощью коэффициента Жаккара (Елисеева, Рукавишников, 1977).

Значения уровней ферментативной активности кишечной микрофлоры трепангов из б. Алексеева и б. Киевка сравнивали с помощью U-критерия Уитни-Манна (Гублер, Генкин, 1973).

Глава 3. Сравнительная характеристика бактериального состава и численности кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания

3.1 Идентификация культивируемых бактерий микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания

В ходе исследований из дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus и из грунта, отобранного из мест обитания голотурии, выделено и таксономически охарактеризовано в общей сложности 139 штаммов бактерий (67 и 72 соответственно).

Среди кишечной микрофлоры трепангов и грунтов из мест обитания голотурий оказались представители следующих родов бактерий: Acinetobacter, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Flexibacter, Halomonas, Micrococcus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Vibrio. Часть микроорганизмов, выделенных из кишечника трепанга удалось идентифицировать до вида с вероятностью 86-99%: Aeromonas hydrophila, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Enterobacter hormaechei, Enterobacter intermedius, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida.

Для подтверждения таксономического статуса некоторые штаммы были идентифицированы сотрудниками генетической лаборатории Дальневосточного федерального университета (Владивосток) с применением анализа последовательностей 16S рРНК генов.

3.2 Характеристика состава и численности кишечной микрофлоры трепанга и грунта из мест его обитания

Из кишечников гидробионтов б. Алексеева было выделено 28 штаммов бактерий, из них большинство (78.6%) грамотрицательные. Микрофлора голотурий этого района характеризуется большим разнообразием представителей рода Pseudomonas - 14 штаммов.

Псевдомонады составили 50% от таксономического разнообразия бактерий, полученных из пищеварительного тракта животных указанного района. Остальная доля была представлена бактериями родов Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Micrococcus и Vibrio (рис. 1).

Рис. 1. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества кишечника трепанга б. Алексеева;

Общая численность гетеротрофов для данного сообщества составила 2.6·10⁸ КОЕ/г (рис. 5).

Из кишечников трепангов, отобранных из б. Киевка было выделено 39 штаммов микроорганизмов, большинство из которых (51.3%) отнесены к грамположительным бактериям.

В микрофлоре голотурий данного района обнаружено 18 штаммов различных видов рода Bacillus, что составило 46.16% от общего количества полученных изолятов. Помимо бацилл, в исследуемых образцах было зафиксировано присутствие представителей тех же родов, что и в микрофлоре трепангов б. Алексеева, а также штаммы бактерий, отнесенные к Flavobacterium, Halomonas и Pseudoalteromonas (рис. 2).



Рис. 2. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества кишечника трепанга б. Киевка

Проведенный анализ полученных данных показал, что коэффициент сходства Жаккара (Kj) для бактериальных сообществ кишечников трепангов из двух районов оказался довольно высоким - 0.7. Богатый видовой состав микробного сообщества, населяющего кишечник голотурий б. Киевка, возможно, связан с более высоким содержанием органического вещества в песчано-илистых грунтах б. Киевка по сравнению с каменисто-песчаными грунтами б. Алексеева (Нестерова, 2005).

Преобладание в б. Киевка представителей рода Bacillus, а не Pseudomonas, скорее всего, объясняется тем, что бациллы - преимущественно почвенные микроорганизмы, и в морскую среду могут поступать вместе с терригенными стоками (Исаченко, 1937), а в б. Киевка впадает река с одноименным названием, которая вносит в море микрофлору почвенного слоя. В ходе исследования микрофлоры грунта из мест отбора голотурий б. Алексеева было получено 33 штамма бактерий, большинство из которых (81.8%) является грамотрицательными. Как и в случае состава микрофлоры трепангов данного района, по количеству выделенных видов в пробах преобладали представители рода Pseudomonas (18 штаммов), а также присутствовали Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Micrococcus и Vibrio (рис. 3).



Рис. 3. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества грунта б. Алексеева;

Рис. 4. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества грунта б. Киевка

Таким образом, Kj =1, что означает полное сходство составов микрофлоры трепанга и грунта из б. Алексеева. Единственное различие заключалось в численности полученных микроорганизмов, а именно численность в грунте была на порядок ниже таковой в пищеварительном тракте животных (рис.5). Полученные данные дают основание говорить о том, что есть прямая связь между микрофлорой грунта и кишечника голотурий, которые по способу питания являются детритофагами-грунтоедами. Бактерии, попадая вместе с грунтом в организм беспозвоночного, получают преимущество перед свободноживущими организмами за счет непрерывного поступления доступного органического вещества, что обуславливает их интенсивное размножение в организме хозяина.

Рис. 5. Общая численность культивируемых гетеротрофов бактериального сообщества кишечника трепанга и грунта из б. Алексеева; Рис. 6. Общая численность культивируемых гетеротрофов бактериального сообщества кишечника трепанга и грунта б. Киевка

Аналогичные данные были получены и для б. Киевка. Из грунта этого района выделено 39 штаммов микроорганизмов, большинство из которых (51.3%) отнесено к грамположительным бактериям. В микробном сообществе преобладали представители рода Bacillus (16 штаммов), и отмечался практически тот же видовой состав бактерий, что и в кишечнике беспозвоночных (рис. 4). Коэффициент сходства микрофлоры кишечника трепанга и грунта оказался равен 0.75, микрофлоры грунтов двух районов - 0.5. Общая численность полученных из грунта гететрофных микроорганизмов (9.7·10⁶ КОЕ/г) была ниже таковой из трепанга (2.7·10⁸ КОЕ/г) (рис. 6).

В образцах грунта были найдены представители родов Flexibacter, Arthrobacter и Acinetobacter (рис. 4). Отсутствие указанных бактерий в кишечнике трепангов говорит о том, что, несмотря на их присутствие в среде, данные микроорганизмы не вступают с голотуриями в симбиотические отношения. Одной из причин этого может быть отсутствие подходящих факторов для их развития. Эти микроорганизмы являются строгими аэробами, что ограничивает их жизнедеятельность в условиях низкой концентрации кислорода в пищеварительном тракте животных. Поэтому данные виды развиваются, скорее всего, только на поверхности грунта при более насыщенной аэрации.

Глава 4. Ферментативная активность микрофлоры дальневосточного трепанга

4.1 Амилолитическая активность

Из 67-ми штаммов различную степень ферментативной активности на чашках со средой, содержащей крахмал, проявили только 8, что составило около 12 % (табл. 1).

Среди представителей микрофлоры трепангов б. Алексеева наличие амилолитической активности было выявлено у 3-х штаммов бактерий, идентифицированных нами как Aeromonas hydrophila А3, Pseudomonas stutzeri А8 и Enterobacter intermedius А4. Кольцо с максимальной толщиной было зафиксировано вокруг посева Aeromonas hydrophila А3 (10 мм), а с минимальной - вокруг Enterobacter intermedius А4 (4 мм); зона просветления субстрата вокруг посева Pseudomonas stutzeri А8 оказалась равной 8 мм. Из коллекции бактерий, выделенных из трепангов б. Киевка, способность расщеплять крахмал продемонстрировали 5 штаммов: Bacillus coagulans К2, Bacillus megaterium K13, Bacillus subtilis К8, Bacillus megaterium К20 и Bacillus circulans К17. Представители рода Bacillus активно разлагали субстрат, при этом размеры зон просветления среды варьировали в пределах 7-12 мм.

Дальнейшая количественная оценка активности амилаз по методу Шомодьи показала, что среди штаммов б. Алексеева наибольшей способностью расщеплять крахмал обладали штаммы Aeromonas hydrophila А3 и Pseudomonas stutzeri А8, у которых вместе с интенсивным ростом на плотной среде (зоны просветления 8 и 10 мм) отмечались и высокие значения активности амилаз, составившие 0.382 и 0.337 ед. соответственно. В то же время штамм Enterobacter intermedius А4 относительно слабо гидролизовал субстрат (толщина кольца 4 мм) и обладал низкой ферментативной активностью (0.046 ед.).

Таблица 1

Количественная оценка амилолитической активности микрофлоры трепангов из б. Алексеева и б. Киевка

б. Алексеева
Виды бактерий	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм	Активность амилаз, ед. (мкмоль/мл•мин)
Aeromonas hydrophila А3	10	0.382 ± 0.021
Enterobacter intermedius А4	4	0.046 ± 0.009
Pseudomonas stutzeri А8	8	0.337 ± 0.011
б. Киевка
Bacillus coagulans К2	10	0.587 ± 0.016
Bacillus megaterium К13	12	0.593 ± 0.024
Bacillus subtilis К8	7	0.327 ± 0.031
Bacillus megaterium К20	9	0.455 ± 0.027
Bacillus circulans К17	8	0.441 ± 0.021

Из представителей микрофлоры трепангов б. Киевка наиболее активно гидролизовали субстрат штаммы Bacillus coagulans К2 и Bacillus megaterium К13, активность амилаз которых была равна 0.587 и 0.593 ед. соответственно.

Вместе с тем, остальные 3 штамма также продемонстрировали высокие уровни расщепления крахмала (активность их амилаз составила 0.327 - 0.455 ед.), что вполне согласуется с данными, полученными на плотной среде (зоны гидролиза 7-9мм).

Интересно отметить, что при анализе полученных данных с помощью критерия Манна-Уитни, используемого для малых выборок, не было выявлено статистически достоверных различий в значениях амилолитической активности бактерий из б. Алексеева и б. Киевка. U-критерий оказался равен 2 (зона незначимости), что указывает на схожие уровни ферментативной активности кишечной микрофлоры трепангов из обоих районов исследования.

Способностью разлагать крахмал обладают многие виды морских бактерий, активность которых, как правило, измеряется 0.001 - 1.343 ед. (мкмоль/мл мин)(Wonger, 2003). Сравнив полученный материал с литературными данными, мы пришли к выводу, что все исследованные нами штаммы, кроме Enterobacter intermedius А4, обладают высокой способностью использовать крахмал в качестве источника энергии, что делает их весьма перспективными при оценке их возможных пробиотических свойств.

4.2 Хондроитинсульфатазная активность

Из всей коллекции активный рост на среде с хондроитинсульфатом продемонстрировали только 4 штамма, выделенные из трепангов б. Алексеева: Ps. stutzeri А8, Ps. putida А11, Ps. fluorescens А19 и B. pumilus А27, что составило примерно 6% (табл. 2).

Как видно из таблицы 2, штаммы B. pumilus А27 (0.412 ед.) и Ps. stutzeri А8 (0.387 ед.) обладали высокой ферментативной активностью и проявили способность интенсивно расщеплять исследуемый субстрат, что подтверждается данными, полученными на агаризованной среде. Вместе с тем штаммы Ps. putida А11 и Ps. fluorescens А19 сравнительно слабо синтезировали внеклеточную хондроитинсульфатазу, активность которой составила всего 0.146 и 0.124 ед., соответственно, что объясняет относительно низкую степень гидролиза хондроитинсульфата клетками этих микроорганизмов на плотной среде.

Согласно литературным источникам, среди морских микроорганизмов наличием хондроитинсульфатазной активности, варьирующей в пределах 0.001 - 0.643 ед., как правило, характеризуются бактерии, ассоциированные с донными позвоночными и беспозвоночными гидробионтами (Wonger, 2003). В наших исследованиях ферментативная активность, выделенных из голотурий бактерий составила 0.124 - 0.412 ед., что даёт основание говорить о довольно высоких возможностях изучаемых микроорганизмов расщеплять и усваивать хондроитинсульфаты, входящие в состав соединительной ткани позвоночных.

Таблица 2

Количественная оценка хондроитинсульфатазной активности бактерий, выделенных из дальневосточного трепанга (б. Алексеева)

Вид бактерий	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм	Активность хондроитинсульфатаз, ед. (мкмоль/мл•мин))
Pseudomonas stutzeri А8	6	0.387 ± 0.012
Pseudomonas putida А11	4	0.146 ± 0.016
Pseudomonas fluorescens А19	4	0.124 ± 0.026
Bacillus pumilus А27	8	0.412 ± 0.032

Следует отметить, что ни один из штаммов, выделенных из кишечников голотурий б. Киевка, не проявил активности в расщеплении хондроитинсульфата, что, возможно, объясняться наличием у животных эндогенных ферментов. Известно, что детрит животного происхождения весьма эффективно усваивается организмом трепанга (Левин, 1982), однако до сих пор ничего неизвестно о природе ферментов, участвующих в этом процессе. Вполне вероятно, что у трепангов обоих исследуемых районов клетки кишечника способны вырабатывать хондроитинсульфатазы, но у голотурий б. Алексеева, судя по представленным данным, значительный вклад в усвоение детрита животного происхождения вносят ферменты бактериальной природы.

4.3 Хитинолитическая активность

Хитиназную активность учитывали в динамике (через 2, 4, 7 и 9 дней) по зонам просветления вокруг посева на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота коллоидный хитин (таблица 3).

Из всей коллекции исследованных микроорганизмов только 4 штамма (около 6 %), входящие в состав микрофлоры трепангов б. Алексеева (Enterobacter hormaechei А5, Pseudomonas stutzeri А8, Bacillus pumilus А27, Pseudomonas maltophilia А21), в различной степени гидролизовали хитин вокруг колоний. Отсутствие хитиназ у бактерий голотурий б. Киевка, возможно, также как и в случае с хондроитинсульфатазной активностью, объясняется наличием у трепангов этого района ферментов эндогенной природы.

Что касается клеток перечисленных выше штаммов бактерий, то они проявили активность уже на второй день эксперимента, однако максимальный синтез хитиназы был зарегистрирован на 4-е и 7-е сутки, что коррелирует с результатами других авторов (Sundarray, Bhat, 1972; Cody, 1989). Самые большие зоны просветления среды наблюдались вокруг посева Pseudomonas stutzeri А8 (4-8 мм), остальные штаммы проявили относительно низкую степень активности (всего 1-3 мм) и замедляли расщепление субстрата спустя четверо суток.

Для количественного определения хитиназной активности в динамике (2, 4, 7 и 9 дней) суточные культуры высевали в жидкую питательную среду, содержащую в качестве индуктора измельчённый нативный хитин. Оценка активности проводилась по количеству восстанавливающих сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе коллоидного хитина с помощью колориметрической реакции с раствором 3,5-динитросалициловой кислоты. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Количественная оценка хитинолитической активности бактерий, выделенных из кишечника трепанга Apostichopus japonicus (б. Алексеева)

Вид бактерий	Хитинолитическая активность (по зонам просветления вокруг колоний в мм)	Хитинолитическая активность, ед. (мг редуцирующих сахаров/ мл•ч)
	на 2-е сутки	на 4-е сутки	на 7-е сутки	на 9-е сутки	на 2-е сутки	на 4-е сутки	на 7-е сутки	на 9-е сутки
Enterobacter hormaechei А5	1	3	3	3	0.15 ± 0.02	0.27 ± 0.07	0.29 ± 0.01	0.12 ± 0.02
Pseudomonas stutzeri А8	4	6	8	8	1.13 ± 0.06	1.78 ± 0.02	2.09 ± 0.05	1.71 ± 0.05
Bacillus pumilus А27	1	3	3	3	0.02 ± 0.01	0.56 ± 0.02	0.87 ± 0.03	0.61 ± 0.01
Pseudomonas maltophilia А21	1	3	3	3	0.51 ± 0.04	0.64 ± 0.01	0.55 ± 0.05	0.38 ± 0.02

Было выяснено, что для всех штаммов, кроме Pseudomonas maltophilia А21, концентрация редуцирующих сахаров достигала максимального уровня к 7-у дню инкубации и начинала уменьшаться на 9-й день, в то время как у Pseudomonas maltophilia А21 наибольшая активность проявилась на 4-е сутки (0.64 ед.), а на 7-й день заметно снизилась (0.55 ед.).

Самое большое количество восстанавливающих сахаров продуцировал штамм Pseudomonas stutzeri А8 (1.13 - 2.09 ед.), что согласуется с данными, полученными на агаризованной среде с хитином (зоны просветления до 8 мм).

Вместе с тем, штамм Enterobacter hormaechei А5 проявлял низкую степень активности как на плотной (зоны просветления 1-3 мм), так и жидкой среде (0.12 - 0.29 ед.).

На основании полученных результатов можно предположить, что хитинолитическая система всех 4-х изученных штаммов бактерий состоит из двух гидролаз (хитиназы, которая гидролизует хитин до хитобиозы, и в-N-ацетилглюкозаминидазы, гидролизующей хитобиозу до N-ацетил-D-глюкозамина), причём у некоторых штаммов преобладала одна из них.

Этим, по-видимому, объясняется несоответствие, наблюдаемое у штаммов Bacillus pumilus А27, Pseudomonas maltophilia А21, которые несмотря на слабый рост на чашках (зоны просветления 1-3 мм), сравнительно активно гидролизовали хитин до свободного N-ацетил-D-глюкозамина (до 0.87 и 0.64 ед. соответственно). Приведённые данные указывают на то, что упомянутые штаммы продуцировали больше хитобиазы, чем хитиназы.

4.4 Альгинатлиазная активность

Для качественной оценки альгинатлиазной активности использовали агаризованную питательную среду с альгинатом натрия, учитывая в динамике через 2, 3 и 4 дня степень просветления субстрата вокруг посева. Полученные результаты представлены в таблице 4.

В ходе исследований было выяснено, что из 67 штаммов альгинатлиазной активностью обладали только 7.5 %: из них 2 штамма из трепангов б. Алексеева (Pseudomonas stutzeri А8 и Pseudomonas maltophilia А21) и 3 штамма из трепангов б. Киевка Bacillus coagulans К2, Bacillus megaterium К13 и Bacillus subtilis К8.

Интересно отметить, что у всех изученных штаммов максимальная ферментативная активность проявлялась на 3-й день (зоны просвеления 3-8 мм соответственно). На 4-й и последующие дни качественных изменений в отношении активности на чашках с бактериями не отмечалось.

Количественную оценку альгинатлиазной активности проводили визкозиметрическим методом по степени падения вязкости 0.3%-ого раствора альгината натрия, приготовленного на трис-HCL- буфере с добавлением 1.9% NaCl.

Было обнаружено, что самое эффективное снижение вязкости тест-раствора бактерии осуществляли на 3-и сутки, что подтверждает данные, полученные на плотной среде (табл. 4).

Таблица 4

Количественная оценка альгинатлиазной активности микрофлоры трепанга

Вид бактерий	Альгинатлиазная активность (зоны просветления вокруг колоний в мм)	Снижение вязкости тест-раствора, %
	на 2-е сутки	на 3-и сутки	на 4-е сутки	на 2-е сутки	на 3-и сутки	на 4-е сутки
Pseudomonas stutzeri А8 (б. Алексеева)	3	6	6	55.3 ± 0.3	75.4 ± 0.7	75.1 ± 0.7
Pseudomonas maltophilia А21 (б. Алексеева)	2	4	4	24.1 ± 0.2	29.7 ± 0.2	29.4 ± 0.2
Bacillus coagulans К2 (б. Киевка)	4	8	8	45.2 ± 0.8	78.1 ± 0.5	78.3 ± 0.5
Bacillus megateriumК13 (б. Киевка)	2	7	7	31.4 ± 0.3	73.6 ± 0.4	73.4 ± 0.2
Bacillus subtilis К8 (б. Киевка)	0	3	3	16.7 ± 0.6	31.2 ± 0.4	30.1 ± 0.4

Из 5-ти изучаемых нами штаммов наибольшую альгинатлиазную активность проявили бактерии видов Pseudomonas stutzeri А8, Bacillus coagulans К2 и Bacillus megaterium К13 со значениями 75.4 %, 78.1 % и 73.6 % соответственно. Остальные 2 штамма Pseudomonas maltophilia А21 и Bacillus subtilis К8 изменяли вязкость среды со значительно меньшей эффективностью (29.7 % и 31.2 %).

4.5 Липолитическая активность

Из коллекции бактерий, полученных из трепанга, липолитическую активность на всех представленных субстратах проявили 7 штаммов (10,4%), только на твинах - 11 штаммов, что составило 16.4% (табл. 5).

Среди представителей микрофлоры голотурий б. Алексеева липолитической активностью обладали 4 штамма бактерий (табл. 5). Из всех субстратов лучше всего микроорганизмы гидролизовали твин 40 (эфир пальмитиновой кислоты) и твин 80 (эфир олеиновой кислоты), а слабее всего - оливковое масло, что по данным некоторых исследователей зависит от длины углеродной цепочки и степени насыщенности жирных кислот в их составе (Elwan et. al., 1983). Такие отличия в липазной специфичности бактерий в литературе объясняются различной проницаемостью клеточных стенок под действием испытуемых субстратов, и, следовательно, различным выходом низкомолекулярных веществ в окружающую среду (Рубан, 1977; Марченкова, Лобырева, 1979).

Таблица 5

Количественная оценка липолитической активности микрофлоры трепанга

б. Алексеева
Вид бактерий	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм	Липолитическая активность, ед/мл
	Твин 40	Твин 80	Оливковое масло	Твин 40	Твин 80	Оливковое масло
Bacillus megaterium A1	12	8	6	191 ± 5	163 ± 4	84 ± 4
Bacillus megaterium A2	11	8	5	165 ± 2	131 ± 2	69 ± 3
Bacillus pumilus A12	8	5	0	98 ± 5	73 ± 3	0
Vibrio sp. A7	10	8	7	77 ± 2	61 ± 5	24 ± 1
б. Киевка
Bacillus megaterium K13	18	15	11	316 ± 4	272 ± 6	141 ± 3
Bacillus megaterium K16	9	7	5	180 ± 5	164 ± 5	42 ± 1
Bacillus coagulans К2	16	14	8	280 ± 3	232 ± 4	92 ± 1
Bacillus subtilis K4	14	12	0	233 ± 4	210 ± 2	0
Bacillus subtilis K8	13	10	0	240 ± 5	192 ± 6	0
Bacillus pumilus К6	7	6	0	92 ± 2	83 ± 5	0
Vibrio sp. K22	12	10	9	68 ± 3	44 ± 3	22 ± 1

Величина зон гидролиза твина 40 вокруг посевов бактерий б. Алексеева варьировала в пределах 8-12 мм, при этом активнее всего субстрат разлагал штамм Bacillus megaterium A1 (зона гидролиза 12 мм). Что касается расщепления твина 80 микроорганизмами трепанга исследуемого района, то зоны гидролиза данного субстрата составили 5-8 мм, при этом штаммы Bacillus megaterium A1, Bacillus megaterium A2 и Vibrio sp. A7 разлагали его с одинаковой интенсивностью (зоны гидролиза по 8 мм). Оливковое масло полученные микроорганизмы расщепляли хуже всего (0-7 мм). Стоит отметить, что штамм Bacillus pumilus A12 не проявил никакой активности на чашках с указанным субстратом.

Для всех штаммов, кроме Vibrio sp. A7, наблюдалась зависимость величины липолитической активности в жидкой среде от размера зоны гидролиза соответствующего субстрата на плотной среде. Так, например, штамм Bacillus megaterium A1 с различной интенсивностью гидролизовал оливковое масло, твины 80 и 40 (зоны гидролиза 6, 8 и 12 мм соответственно), что коррелирует с данными, полученными на жидких средах (липолитическая активность составила 84, 163 и 191 ед/мл соответственно). Та же корреляция наблюдалась и у штаммов Bacillus megaterium A2 и Bacillus pumilus A12.

Что касается штамма Vibrio sp. A7, то при относительно больших зонах гидролиза субстрата на плотных средах (7-10 мм), отмечались низкие значения липолитической активности при ее количественном анализе (24-77 ед/мл). Возможно, положительный результат при качественной оценке в некоторых случаях может объясняться дополнительным действием неспецифических эстераз, активность которых в жидких средах не определялась.

Среди микроорганизмов трепангов б. Киевка различной липолитической активностью обладали 7 штаммов (табл. 5) Так же, как в случае, результатов, полученных для б. Алексеева, бактерии б. Киевка слабее всего гидролизовали оливковое масло, а лучше всего твин 40.

Величина зон гидролиза субстрата на чашках с твином 40 составила 7-18 мм, с твином 80 - 6-15 мм, с оливковым маслом - 0-11 мм. Наиболее активными в отношении расщепления всех изучаемых источников олеиновой кислоты оказались штаммы Bacillus megaterium K13 и Bacillus coagulans К2 с зонами гидролиза 11-18 мм и 8-16 мм соответственно.

Интересно, что штаммы Bacillus subtilis K4, Bacillus subtilis K8 и Bacillus pumilus К6 не продемонстрировали никакой активности в отношении разложения оливкового масла. Полученные данные позволяют отметить присутствие различной специфичности экзолипаз у исследуемых бактерий. Не исключено, что способность внеклеточных липаз расщеплять те или иные субстраты или несколько различающихся по жирнокислотному составу субстратов, может быть следствием сложности состава липазного комплекса, то есть наличия у микроорганизмов нескольких типов липаз с разными свойствами и разных по действию (Sekhon et al., 2005).

Количественная оценка липолитической активности микрофлоры трепангов б. Киевка показала схожую с результатами для б. Алексеева зависимость величины ферментативной активности на жидких средах от размера зон расщепления субстрата на плотных средах. Так, например, самым активным штаммом являлся Bacillus megaterium K13, у которого зоны гидролиза исследуемых компонентов варьировали в пределах 11-18 мм, что вполне согласуется с данными, полученными на жидких средах (ферментативная активность составила 141-316 ед/мл). Подобная корреляция наблюдалась и у всех остальных штаммов, кроме Vibrio sp. K22. У указанного штамма отмечалась низкая липолитическая активность (22-68 ед/мл) при относительно больших размерах зон гидролиза на плотных средах.

Примечательно, что, липолитическая активность бактерий из трепангов обоих районов имела определенные схожие черты. Так из всей коллекции штаммов способностью расщеплять оливковое масло и твины обладали в основном представители рода Bacillus, из них самыми активными в обоих районах оказались представители одного вида - Bacillus megaterium. Бактерии вида Bacillus pumilus из обеих бухт характеризовались способностью расщеплять твины, но не гидролизовали оливковое масло. Кроме того, представители рода Vibrio из кишечников трепангов б. Алексеева и б. Киевка демонстрировали низкие липолитические активности в жидких средах, несмотря на высокие результаты при качественной оценке ферментативной активности.

Возможно, показанные особенности связаны с наличием одинаковых липазных комплексов у бактерий одного вида или рода независимо от района выделения. Кроме того, при анализе данных с помощью критерия Манна-Уитни не выявлено статистически достоверных различий между липолитической активностью микрофлоры трепангов из б. Алексеева и б. Киевка. U-критерий при сравнении результатов, полученных на среде с твином 40, равен 8, на среде с твином 80 - 6, а на среде с оливковым маслом - 12.5, что свидетельствует о схожих уровнях ферментативной активности бактерий из обоих районов исследования.

4.6 Протеолитическая активность

Из 67-ми штаммов различную степень ферментативной активности на чашках со средой, содержащей казеин, проявили только 3, что составило около 4.5 % (табл. 6). Среди представителей микрофлоры трепангов б. Алексеева наличие протеолитической активности было выявлено у одного штамма бактерий - Pseudomonas stutzeri А8. Зона гидролиза субстрата для этого микроорганизма составила 12 мм, при этом ферментативная активность была равна 0.237 ед.

Таблица 6

Протеолитическая активность бактерий дальневосточного трепанга

Виды бактерий	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм (среда с казеином)	Активность протеаз, ед. (мкмоль/мл• мин) (казеин)	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм (среда с желатином)	Активность протеаз, ед. (мкмоль/мл• мин) (желатин)
Pseudomonas stutzeri А8 (б. Алексеева)	12	0.237 ± 0.021	10	0.183 ± 0.015
Bacillus coagulans К2 (б. Киевка)	8	0.187 ± 0.006	6	0.124 ± 0.011
Bacillus pumilus К6 (б. Киевка)	6	0.106 ± 0.014	6	0.098 ± 0.006

Из коллекции бактерий, выделенных из трепангов б. Киевка, способность расщеплять казеин продемонстрировали 2 штамма: Bacillus coagulans К2 и Bacillus pumilus К6. Представители рода Bacillus активно разлагали субстрат, при этом размеры зон просветления среды составили 8 и 6 мм соответственно.

Дальнейшая количественная оценка активности протеаз указанных выше штаммов подтвердила высокие способности данных микроорганизмов расщеплять казеин. Активность Bacillus coagulans К2 составила 0.187 ед., а Bacillus pumilus К6 - 0.106 ед.

Исследования способности микрофлоры трепанга расщеплять желатин показали схожие результаты (табл. 6). Активность фермента на плотных средах, содержащих указанный субстрат, проявили те же микроорганизмы, что и на среде с казеином - Pseudomonas stutzeri А8 из б. Алексеева и Bacillus coagulans К2, Bacillus pumilus К6 из б. Киевка. Значения протеолитической активности на среде с желатином оказались несколько ниже показателей, полученных на среде с казеином, однако, статистически значимые различия в уровнях ферментативной активности отсутствуют (U=2, зона незначимости). Так, максимальную активность разлагать желатин показал штамм Pseudomonas stutzeri А8 с величиной зоны гидролиза субстрата равной 10 мм и протеазной активностью 0.183 ед. В то же время бациллы б. Киевка разлагали желатин с активностью в 0.124 и 0.98 ед. при одинаковой величине зон гидролиза субстрата - 6 мм.

Проанализировав результаты, полученные в ходе исследования ферментативной активности бактерий трепанга и сравнив их с имеющимися литературными данными по активности ферментов микроорганизмов из других источников, мы пришли к выводу, что полученные нами штаммы являются активными продуцентами различных пищеварительных гидролаз. Значения активности ферментов изучаемых бактерий оказались на уровне или выше значений, полученных другими авторами, что делает нашу коллекцию микроорганизмов весьма перспективной для использования не только в марикультуре, но и для различных биотехнологических целей. Возможность применения штаммов бактерий с биологически активными свойствами имеет большое практическое значение при решении широкого спектра задач в промышленности, сельском хозяйстве и здравоохранении: в процессах модификации и переэтерефикации жиров, синтеза сложных эфиров, для очистки сточных вод от органических загрязнений, для улучшения усвояемости кормов, для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и др.

ВЫВОДЫ

1. Кишечная микрофлора трепанга имеет определенный таксономический состав, который формируется за счет микрофлоры грунтов соответствующих районов.

2. В состав кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга входят представители следующих родов факультативно анаэробных культивируемых бактерий: Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Halomonas и Vibrio. Бактерии родов Acinetobacter, Flexibacter и Arthrobacter, относящиеся к строгим аэробам и населяющие грунты в местах обитания голотурии, не характеры для микробных сообществ кишечника гидробионта.