Биологически активные вещества Anabasis aphylla L.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биологически активные вещества Anabasis aphylla L.

В обзоре обобщены литературные сведения по проблеме биосинтеза пиперидиновых гетероциклов Ananasis aphylla L. Лизина является дериватом амин кадаверина, который является непосредственным предшественником цитизина, анабазина, лупинина, спартеина и других алкалоидов. В настоящее время активно изучается биохимические механизмы биосинтеза вторичных метаболитов пиперидиновых гетероциклов, клонируются генетические детерминанты ответственные за биосинтез. Осуждается возможность создания на основе культуры клеток Ananasis aphylla L. штаммов-продуцентов анабазина

Пиперидиновые алкалоиды - относятся к группе азотсодержащих гетероциклических соединений растительного происхождения, с выраженными антифидантными и токсичными свойствами [1]. Однако до настоящего времени физиологическая роль этих соединений в растениях не выяснена. Согласно одной из наиболее обоснованных гипотез, пиперидиновые алкалоиды являются аллелохимическими токсинами и антифидантами для неадаптированных видов насекомых-фитофагов [2]. На млекопитающих и человека эти соединения оказывают действие на уровне ганглионарных ядов [3-13]. Многие пиперидинсодержащие растения используются в медицине разных народов. В частности, анабазин в малых дозах возбуждает центральную нервную систему, рефлекторно усиливает дыхание, повышает артериальное давление, возбуждает ганглии вегетативной нервной системы. В больших дозах оказывает угнетающее и парализующее действие. [3-5, 14]. Анабазин может служить сырьем для получения никотиновой кислоты. Применяется также для лечения вшивости и стригущего лишая у животных. Для борьбы с вредителями сельского хозяйства применяется анабазин-сульфат, содержащий, кроме анабазина, и другие алкалоиды [11-15].

Анабазин, был открыт А.П. Ореховым в 1929г в среднеазиатском растении Анабазис безлистный Anabasis Aphylla L [14]. Строение его установлено А.П. Ореховым и Г.П. Меньшиковым в 1931г. Строение анабазина было получено при его окислении, при этом образовалась никотиновая кислота. Это показывает, что в анабазине имеется пиридиновый остаток.

Анабазин и лупинин, являются главной частью оснований технического анабазин-сульфата, который вырабатывался Чимкентским химико-фармацевтическим заводом как средство борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Алкалоиды-- доступные исходные продукты для разнообразных синтезов. Неодревесневшие зеленые побеги (трава) A. aphylla содержат 2,0-4,0% (до 12,0%) алкалоидов: анабазин, афиллин, афиллидин, лупунин, оксиафиллин, оксиафиллидин и др.

Необходимо подчеркнуть, что большинство алкалоидов A. aphylla нашли широкое применение и разнообразное применение в медицине, сельском хозяйстве и ветеринарной практике. Учитывая серьезные проблемы в организации и восстановлении сырьевой базы A. aphylla, как алкалоидоноса предлагается использовать биотехнологический метод получения анабазина в суспензионной культуре клеток. Это является важным не только в плане теоретических исследований, но и в практическом отношении.

Целью исследования, изучить метаболизм анабазина и регуляции уровня накопления его в условиях in vitro.

В связи с выше изложенным необходимо четко обозначить основные задачи обзора:

1. Теоретически обосновать биосинтез основных алкалоидов A. aphylla - анабазина в культуре клеток in vitro.

2. Рассмотреть роль органических добавок, на образование предшественников указанного соединения с целью активизации биосинтетических процессов;

3. Сформировать эмпирическую схему получения детерминированного каллуса с высокой степенью компетенции и образования биосинтетического аппарата de novo в массе изолированных клеток A. aphylla.

Для развития биопроизводства анабазина и сопутствующих алкалоидов, был проведен анализ биосинтетических реакций. В 1978 г. Ловкова М.У. и Нуримов Е. опубликовали результаты исследования биосинтеза основных алкалоидов A. аphylla в условиях in vivo. Была раскрыта роль предшественников алкалоидов- лизина, аспарагиновой кислоты, метионина, ацетата, и кадаверина, четко обозначена их функция. Исследования проводились в течение 40 лет, что позволило ученым детально разобраться в метаболизме пиперидиновых гетероциклов. Биосинтез анабазина, лупинина и афилиновой кислоты, был проанализирован выявлен механизм их взаимопревращения. [16-24]. С целью определения метаболической активности алкалоидов A.aphylla и изучения возможности их взаимопревращения в побеги опытных растений вводили полученные биосинтетически анабазин, лупинин и афиллиновую кислоту, меченные ¹⁴С. Полученные результаты показали, что суммированные в соединения-предшественники, введенные в растения, в течение опыта подвергаются активным превращениям (возврат радиоактивности в них не превышает 6,0%), при этом метаболиты каждого из экзогенных алкалоидов включаются в синтез всех остальных алкалоидов этого растения.

Литературные данные позволяют с уверенность, утверждать, что в состав алкалоидов A. aphylla в качестве структурной единицы входит пиперидиновое кольцо. Этот гетероцикл при биосинтезе пипеколиновой кислоты и ее производных, а также при биосинтезе большого числа алкалоидов, относящихся к различным группам, происходит за счет лизина [25, 26]. Высказывалось предположение, согласно которому, при биосинтезе пиперидина за счет лизина прежде всего происходит декарбоксилирование последнего. Долгое время вопрос о промежуточных соединениях производных лизина, и его предшественников оставался открытым. Известно, что образование пиперидиновых колец алкалоидов может происходить не только за счет лизина или кадаверина, но также за счет ацетата. Поскольку при расщеплении как анабазина, так и лупинина может образоваться только по одной молекуле пиперидина, эффективность использования этих двух алкалоидов при ресинтезе родственных им соединений должна быть выражена близкими величинами, что и доказано экспериментально Ловковой М.У. и Нуримовым Е.. Таким образом, при расщеплении афиллина, лупинина и анабазина, очевидно, образуется один и тот же компонент-пиперидин, который и используется при ресинтезе алкалоидов данного растения [16, 24].

Сукцинилдиаминопимелатдесукцинилазой гидролизуется с отщеплением сукцината и образуется L-Е-диаминопимелат, который после декарбоксилирования 8. диаминопимелатдекарбоксилазой дает лизин [27].

анабазин биосинтез токсин

Лизин (Lys), Ь-,Э- диаминокапроновая кислота (6) СН₂NH₂ - (СН₂)₃ - NH₂СН - СООН

В связи с вышеизложенным в качестве предшественников алкалоидов при изучении их биосинтеза использовали «лизиновый путь». Исходными веществами для образования гетероциклов, содержащих азот, являются аминокислоты или продукты их декарбоксилирования - амины.

Как видно, из метаболической карты, лизин превращается в амин кадаверин, который является непосредственным предшественником цитизина, анабазина, лупинина, спартеина и других алкалоидов (рис.1)[28-37].

Высшие растения и бактерии синтезируют лизин в результате декорбоксилирования мезо-2,6-диаминопимелиновую кислоту, катализируемого диаминопимелинатдекарбоксилазой.

Таким образом, метаболизм алкалоидов разного химического строения, относящихся к различным группам, но одновременно присутствующих в одном и том же растении, вообще может происходить через так называемые «общие» метаболиты в качестве промежуточных соединений. Такое предположение, по нашему мнению, вполне обоснованно в свете полученных результатов, а также в свете известной гипотезы Юнусова, согласно которой первичный биосинтез алкалоидов в растениях такого рода происходит через «общие» метаболиты, названные автором «полупродуктами» [38].

Метод культуры клеток, тканей и органов является в настоящее время общепризнанным и широко применяется во всем мире для решения фундаментальных и прикладных вопросов биологии растений. Растительные клетки формируют «алкалоидоносные фабрики» из апикальных меристем стерильных проростков. Способность меристем к дедифференциации позволяет растительному организму гибко изменять свое строение в зависимости от условий внешней среды. Меристематическая ткань являются источником всех специализированных структур каллуса и ее роль в развитии растительных штаммов-продуцентов очень высока. Поэтому, говоря о каллусной массе вообще и о скорости развития в частности, необходимо помнить, что все эти процессы напрямую связаны с состоянием и функциональной активностью первичных меристем. Модификационные преобразования состава питательной среды и других параметров культивирования ведет к изменению не только количественного, но и качественного состава продуктов биосинтеза, в результате чего могут быть получены совершенно новые соединения с принципиально другим типом действия. Принимая во внимание тонкие механизмы биосинтетических реакций, и их взаимосвязь с клеточной компетенцией принимается попытка получения алкалоидоносных клеток в суспензионной культуре.

В основе культивирования живых клеток находится клеточный цикл, сохранение фаз и регуляторных механизмов позволяет стабилизировать биохимические процессы, а в некоторых случаях и активизировать их. В фазе экспоненциального роста в культуре растительных клеток удвоение числа клеток может происходить примерно за 1 сутки. Культивирование суспензионной культуры позволяет использовать крупномасштабное промышленное оборудование (ферментеры) для получения продуцирующих клеток, перейти от периодического к проточному культивированию [2, 39-48].

Возможность увеличивать количество делящихся и синтезирующих клеток сопровождается удорожанием состава питательной среды. За скорость, достигаемую при размножении клеток in vitro необходимо увеличивать затраты на производство: углеводное питание, органические вещества, минеральные соли, ауксины и цитокинины [44, 49]. Кроме того, весь процесс производства в ферментерах идет в стерильных условиях (дополнительные затраты). Поэтому основной задачей, которую необходимо решить при масштабном культивировании растительных клеток A. aphylla - это вопрос рентабельности биопроизводства. Рентабельность биопроизводства находится в прямой зависимости от квалификации персонала и использования современного технического парка. Все это будет способствовать разработке полноценного на всех этапах сбалансированного производственного регламента получения целевого продукта.

Активный биосинтез целевого продукта - анабазина наблюдается на втором этапе культивирования, когда каллусная масса имеет определенную специализацию и дифференциацию. При стимулировании процессов биосинтеза анабазина, рекомендуется добавить в состав питательной среды дрожжевой экстракт (лизин 8,2 г. на 100г.), кукурузный экстракт и гидролизат казеина [49].

Таким образом, данные о контроле биосинтеза вторичных метаболитов клеточной дифференциацией неоднозначны. Если в ряде случаев синтез вторичных веществ начинается с появлением в культуре морфогенных структур, то в других опытах высокий выход искомых веществ наблюдался в недифференцированной каллусной ткани.

Занимаясь исследованиями соединений вторичного синтеза, важно определить место и характер биосинтеза, связь с метаболическими реакциями растительных клеток. Знание о пути биосинтеза позволит углубить фундаментальные теоретические знания в области биохимии растительных клеток и прогнозировать накопление их, учитывая единый биогенетический путь синтеза.

На первом этапе, будет использована классическая пропись среды МС. Оптимизация условий культивирования будет касаться содержания фитогормонов, макро- и микроэлементов. Следует помнить, что основным недостатком биотехнологии растений является гетерогенность и физиологическая асинхронность (клетки находятся в разных фазах клеточного цикла) клеток популяции. Корректное управление попляцией клеток высших растений проходить фазы клеточного цикла одновременно, т.е. синхронизировать их, почти не возможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению составляет 2-4 % [53.]. Для синхронизации фаз клеточного делений используют метод индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, или химических соединений. Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК - тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина (ОМ), колхицин. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл продолжается только до G₁ - периода, и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению [50]. Однако эффективность синхронизации фаз клеточного деления, основана на действии химических ингибиторов и зависит от исходной дифференциации клеток. Так, использованный метод синхронизации делений клеток суспензионной культуры пшеницы Тимофеева Triticum timopheevii с помощью последовательной обработки ОМ и колхицином, показал, что степень синхронности зависела от исходной пролиферативной активности клеток и была тем значительнее, чем выше был исходный митотический индекс культуры. Максимальный эффект синхронизации наблюдался при обработке клеток 1мМ ОМ и 0,05%-ным колхицином. ОМ в более высоких концентрациях токсична для клеток и вызывала значительное снижение митотического индекса по сравнению с контрольным уровнем [51]. Таким образом, применением химических ингибиторов деления клеток можно добиться достаточно высокого уровня синхронности фаз клеточного деления.

Таким образом, введение в культуру растительные экспланты, требуют согласованности химических и физических условий. Это определяет продуктивность штаммов синтезирующих анабазин. Регуляция тонких биохимических механизмов, рассматривается как многоэтапный процесс, со специфическими претензиями к внешним факторам. Метаболический путь: аспартат-лизин, идет с большими затратами углеводов, макро и микроэлементов, первостепенное значение отдается витаминам. Роль витаминов рассматривается как «лимитирующий» фактор при регулировании активности ферментных систем. На втором этапе большая роль принадлежит органическим добавкам, которые, включаясь в анабазин, принимает практически равное участие в образовании как пиридинового, так и пиперидинового колец алкалоида, однако в целом величина их включения невелика. Невысокую степень использования органических добавок в образовании анабазина можно объяснить тем, что «добавки» занимают одно из центральных мест в азотистом обмене растительной клетки и активно используется в биосинтезе свободных аминокислот и белков.

Литература

1. Кунаева Р.А., Сапко О.А. Мападилова А.М. Биологически активные вещества растений Казахстана // Биотехнология. Теория и практика. - 1997.- № 3. - С. 77.

2.Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М, Наука, 1991. - С. 5 - 18.

3.Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М, Медицина, 1987. Т. - 1.- С. 132 - 133.

4.Эллинов Н.П. Громова Э.Г. Современные лекарственные препараты. - СПб. 2000. - С. 260.

5.Государственная фармакопея СССР. - М, 1968. - С. - 229.

6.Мелентьева Г.А. Фармацевтическая химия. - М, 1976. - Т. 2. - С. 492.

7.Сенов П.Л. Курс фармацевтической химии. - М, 1952. - С. 443.

8.Байкенов М.С. Флора Казахстана: Иллюстрированный определитель семейств и родов.- Алматы, 1999. - 428 с.

9.Иллюстрированный определитель растений семейства бобовых Казахстана. - Алма-Ата, 1962. - 389 с.

10.Федоров Т., Тахтаджян А.Л. Жизнь растений: В 6-ти т. - Т.5. - Ч.1. - Цветковые растения. - М, Просвещение, 1980. - С. 374.

11.Садыков А.С. Химия алкалоидов Anabasis aphylla. - Ташкент, 1950. - 160 с.

12.Саргин К.Д. К фармакологии анабазина // Хим.-фарм. пром. - 1933. - №3. - С. 20 - 22.

Размещено на Allbest.ru