Гигиеническая оценка промышленных отходов с использованием альтернативных тест-моделей на примере гидролизного лигнина

Размещено на http://www.allbest.ru/

Гигиеническая оценка промышленных отходов с использованием альтернативных тест-моделей на примере гидролизного лигнина

Котеленец А.И., Войтович А.М.

Химический анализ показал присутствие в пробах лигнина фенолов, фенантрена, метанола. Наибольшее суммарное содержание органических соединений отмечено в пробах лигнина, взятых непосредственно на производстве. В пробах складированного лигнина верхних слоев преобладают фенолы, в нижних - метанол. По результатам исследований на инфузориях Tetrahymena pyriformis наиболее токсичны пробы свежего лигнина. Ряд проб оказал выраженный цитотоксический и генотоксический эффект при исследовании на моллюсках Limneae stagnalis и эмбриональных фибробластах мыши.

The chemical analysis has shown the presence of phenols, phenanthrene, methanol in lignin samples. The highest total content of organic compounds was noted in lignin samples taken directly at the manufacturing plant. Phenols dominate in the upper layers of the stored lignin samples and methanol does in the lower ones. As for the results of examining infusorians Tetrahymena pyriformis, the samples taken of fresh lignin were the most toxic. Several of the samples have exerted a pronounced cytotoxic and genotoxic effect when examining molluscs Limneae stagnalis and embryonic fibroblasts of mouse.

Для решения проблемы охраны окружающей среды большое значение имеет использование отходов производства в качестве вторичного сырья и энергетических ресурсов. Одним из альтернативных видов топлива в Республике Беларусь является технический гидролизный лигнин - экологически вредный материал непостоянного состава. Выход лигнина при гидролизе древесины составляет около 30% ее массы [5].

Лигнин является естественным трехмерным полимером ароматической природы. В окружающей среде он, как правило, деградирует под воздействием ферментативных систем многочисленных микроорганизмов с образованием широкого спектра органических соединений [7]. Поэтому для его безопасной утилизации необходимо проведение ряда санитарно-химических и токсикологических исследований. Токсикологическая оценка лигнина, как и других промышленные отходов с использованием только теплокровных лабораторных животных вызывает ряд вопросов методического свойства. Существует точка зрения, что оценка токсичности отходов при их пероральном введении не в полной мере отражает реальный риск для человека [8]. Поэтому является актуальным дополнение классических токсикологических методов альтернативными тест-системами.

Материалы и методы. Пробы лигнина были взяты непосредственно на Бобруйском гидролизном заводе и на полигоне «Титовка», функционирующем более 50 лет. Для характеристики 10 горизонтальных уровней на полигоне из 12 скважин отобрали 98 проб. Они послужили основой для приготовления усредненных проб. Такое условное разделение на слои использовано для упрощения интерпретации результатов.

Было проведено изучение миграции органических соединений в воду и воздух. Стандартными методами определяли вещества, характеризующие процессы разложения органических соединений природного происхождения. Моделирование условий миграции в водную среду проводили при комнатной температуре в течение 5 суток, в воздух - при температуре 40єС в течение 3 суток.

В качестве тест-объектов для экспрессной оценки влияния лигнина на объекты окружающей среды использованы эмбриональные фибробласты мыши, инфузории и моллюски. Пробы высушивали до сухо-воздушного состояния, растирали в ступке и просеивали через сито. Навеску каждой пробы массой 20 г доводили дистиллированной водой до объема 100 мл (200 мг/мл). лигнин токсикологический миграция биологический

В культуру эмбриональных фибробластов мыши вносили надосадочную жидкость водных вытяжек в объеме 1% от среды, проба свежего лигнина была исследована также при 5% концентрации. Цитотоксический эффект оценивали по пролиферативному потенциалу [2].

При однократном внутрижелудочном введении гидролизного лигнина белым крысам DL50 составила больше 5000 мг/кг, поэтому согласно ГОСТ 12.1.007-76 он был отнесен к IV классу опасности.

Исследования на Tetrahymena pyriformis W. проводили в остром, подостром и хроническом экспериментах. Лигнин испытывали на популяции, находящейся в стационарной фазе роста, в диапазоне концентраций 10 - 200 мг/мл. В остром и подостром экспериментах токсичность учитывали по летальным эффектам. В хроническом эксперименте биологическое и токсическое действие лигнина на популяцию оценивалось на протяжении жизненного цикла Tetrahymena pyriformis W. Принцип метода заключается в анализе характера роста популяции в среде культивирования, содержащей лигнин в концентрации 10-6 - 102 до мг/мл [1, 4].

Эксперименты in vivo проведены на моллюсках Limneae stagnalis [3]. В среду обитания вносили по 5% вытяжек от объема, животных содержали в таких условиях 5 суток. Мантийную жидкость получали путем раздражения ноги, пробу фиксировали этанолом, через сутки добавляли ледяную уксусную кислоту [6]. Объемное соотношение спирта и кислоты составляло 3:1. Клеточную суспензию наносили на замороженные предметные стекла, окраску проводили по Гимза. Учитывали клетки с микроядрами, признаками повреждения ядра и апоптотические тела.

Результаты и обсуждение. Установлено, что влажность проб складированного лигнина составила от 51 до 60 %, а свежего - 67%, самые низкие значения pH (4,4-4,6) отмечены на глубине залегания лигнина 6-16 м. Валовое содержание тяжелых металлов и миграция их в водную среду были незначительны.

Как видно из табл. 1, в воздушную среду из проб свежего лигнина мигрирует незначительное количество метана и метанола. В пробах лигнина, отобранных на полигоне «Титовка», в воздушную среду также выделяются метан и метанол. Однако, миграция метана по сравнению со свежим лигнином была в 2 - 6, а метанола почти в 3 раза выше независимо от глубины скважины. Миграция в воздух фенола, формальдегида, аммиака не отмечена.

Во всех пробах лигнина обнаружен фенантрен, при этом наибольшее его количество найдено в свежем лигнине и на глубине от 10 до 16 м, бенз(а)пирен не обнаружен. Миграция фенантрена и бенз(а)пирена в воду в пределах чувствительности метода не установлена. В пробах, начиная с глубины 6-8 м, наблюдается тенденция к снижению миграции фенолов, наиболее выраженная в нижнем горизонте. Представляют интерес особенности миграции формальдегида из проб лигнина в водную среду. Из проб верхних слоев она была крайне незначительной, далее возрастала в 3 - 5 раз и в целом соответствовала миграции его из проб свежего лигнина. Это обстоятельство позволяет предположить, что содержание органических соединений в различных пробах в значительной степени зависит от происхождения исходного сырья. Результаты химического анализа свидетельствуют об угрозе окружающей среде в результате проникновения формальдегида и фенолов из отходов лигнина в водоносные горизонты.

Начиная с концентрации 1 мг/мл, суспензии всех проб лигнина оказали выраженное угнетающее действие на динамику популяций Tetrahymena pyriformis W. по показателям мгновенной скорости роста, времени генерации, числу поколений, численности инфузорий. Биологическое действие лигнина на популяцию инфузорий проявилось в снижении адаптационных возможностей на 20% и более по отношению к контрольному уровню. Снижение кислотной устойчивости организмов свидетельствует о вероятном воздействии лигнина на клеточные мембраны.

По результатам хронического эксперимента на инфузориях (табл. 2) максимальная недействующая доза свежего лигнина составила 10-6 мг/мл, а в пробах, взятых на полигоне, от 10-1 до 10-3 мг/мл. Наибольшей токсичностью обладает свежий лигнин, а лигнин полигона был умеренно токсичным для инфузорий за исключением практически нетоксичных проб, взятых на глубине 10-14 метров.

При внесении в ростовую среду фибробластов надосадочной жидкости, полученной из суспензии проб свежего лигнина заметно торможение клеточной прогрессии, начиная с 9 суток опыта (рис. 1). Хорошо видно, что при увеличении концентрации до 5% цитотоксический эффект начинает сказываться, начиная с 5 суток. Были исследованы также пробы лигнина, отобранного на полигоне. Выраженное угнетение клеточной пролиферации, начиная с 15 суток опыта, оказала надосадочная жидкость, полученная на основе пробы лигнина с глубины 2-4 м. Проба с глубины 8-10 м характеризуется большим содержанием органических веществ, за исключением фенантрена. Однако она не оказала такого выраженного цитотоксического действия.

При тестировании проб лигнина на моллюсках было отмечено, что животные активно поедали лигнин, как донные отложения в живой природе. Вероятно, это явилось основной причиной отличия результатов экспериментов in vivo от предыдущих. Так, наибольшее число клеток мантийной жидкости с микроядрами и признаками апоптоза (табл. 3) наблюдали в серии, где в среду обитания добавляли суспензию лигнина, полученного с глубины 8-10 м. Содержание токсичных соединений в этой пробе не превышает средние значения. Обращает на себя внимание следующая проба (10 - 12 м), содержание вредных веществ в которой значительно выше, чем в пробах, взятых как на меньшей, так и большей глубине. Поэтому можно предположить, что именно на глубине 10 м содержится наибольшее количество токсичных соединений, в том числе не входивших в перечень веществ, выбранных для определения. Вместе с тем, близкий уровень апоптозных клеток мантийной жидкости был отмечен у животных, в среде обитания которых находился лигнин с глубины 16-18 м. Пробы с этой глубины характеризуются высоким содержанием формальдегида и метанола, кроме того, вышележащий горизонт отличается самым высоким содержанием фенантрена.

Таким образом, исследования на альтернативных тест-системах позволили дополнить токсикологическую характеристику гидролизного лигнина. Результаты, полученные при изучении химического состава отхода и в различных тест-системах, свидетельствуют об опасности гидролизного лигнина для окружающей среды.

ЛИТЕРАТУРА

1. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды/ Методическое пособие - М., 1999.

2. Елизарова О.Н., Рязанова Р.А. Клеточные культуры как биологическая модель в токсикологических исследованиях. - М., 1982.

3. Мещеряков В.Н. Прудовик (Lymnaea stagnalis L) // Объекты биологии развития. - М.: Наука. - 1975. - С.53-94.

4. Определение токсичности металлосодержащих отходов / Методические рекомендации. - Мн., 2004.

5. Чудаков М.И. Промышленное использование лигнина. - М.: Лесная промышленность, 1983.

6. Dixon D.R., Pruski A.M., Dixon L.R. et al. Marine invertebrate eco-genotoxicology: a methodological overview // Mutagenesis. - 2002. - Vol. 17, N6. - P. 495-507.

7. Higuchi T. Microbial degradation of lignin: role of lignin peroxidase, manganese peroxidase, laccase // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. - Vol. 80. - 2004. - N 5. - P. 204-214.

8. Risk-based waste classification in California. - Washington D.C.: Natl. Acad. Press, 1999.

Размещено на Allbest.ru