Оценка окислительной и антиоксидантной способности биологических субстратов по хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона

Анализ связи между способностью к окислению и антиоксидантной активностью субстрата по результатам кинетики хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона. Исследование хемилюминесценции, возникающей в реакциях гидроперекисей с двухвалентным железом.

Рубрика Биология и естествознание
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 10.04.2018
Размер файла 1,8 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Оценка окислительной и антиоксидантной способности биологических субстратов по хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона

И.М. Пискарев

И.П. Иванова

Ключевые слова: реакция Фентона; кинетика хемилюминесценции; способность субстрата к окислению; антиоксидантная активность.

Цель исследования -- анализ связи между способностью к окислению и антиоксидантной активностью субстрата по результатам расчета кинетики хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона.

Материалы и методы. Измерения хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона, осуществляли с помощью биохемилюминометра БХЛ-07 (Россия) в 10-15 повторах. Время регистрации -- 30 с. Для реакции Фентона использовали реактивы: раствор FeSO4 (10-3моль/л в кислой среде, pH=2), раствор перекиси водорода (10-3 и 10-1 моль/л).

Исследовали индуцированную реакцией Фентона хемилюминесценцию альбумина, гемоглобина, смеси альбумина и гемоглобина, известных антиоксидантов: фенола C6H5OH, резорцина C6H4(OH)2, пирогаллола C6H3(OH)3, а также смеси антиоксидантов с гемоглобином и альбумином.

Для расчета кинетики процессов хемилюминесценции составляли схему реакций, описывающих процесс. На основе этой схемы составляли систему дифференциальных уравнений, где переменными являлись концентрации участвующих в процессе веществ. Число уравнений равнялось числу веществ, участвующих в реакции.

Результаты. Светосумма хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона, при концентрации [H2O2]=10-1 моль/л монотонно уменьшается с уменьшением концентрации субстрата (с разведением). Рассчитана зависимость S/S0 от концентраций окисляющихся фрагментов [RH], ингибитора [InH] и окисленного вещества [ROOH]. При [Fe2+]<[H2O2] отсутствует линейная зависимость между светосуммой S/S0 и концентрациями [RH], [ROOH] и [InH], поэтому получаемые результаты носят качественный характер.

Заключение. Хемилюминесценция, индуцированная реакцией Фентона, позволяет наблюдать продукты реакции, а не радикалы. Реакция Фентона протекает практически в любом субстрате. Уровень светосуммы хемилюминесценции, инициированной гидроксильными радикалами -- реакцией Фентона, -- определяется константами скорости реакций инициирования, продолжения и обрыва цепи. Увеличение или уменьшение светосуммы хемилюминесценции свидетельствует о разных значениях этих констант, но не указывает на антиоксидантную активность, т.е. на подавление цепной реакции путем образования неактивных продуктов. Поэтому по уровню хемилюминесценции, индуцированной гидроксильными радикалами, которые образуются в реакции Фентона, можно оценить способность субстрата к окислению в данных условиях.

Реакция Фентона применяется в практике биомедицинских исследований [1-3]. Основное преимущество метода -- в его оперативности, с которой он позволяет контролировать изменения окислительной способности биологических субстратов при патологических процессах и физико-химических воздействиях. В 2010 г. разработан прибор, ориентированный на измерение хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона, -- БХЛ-07 (Россия), который сейчас выпускается серийно. Общие особенности кинетики хемилюминесценции были рассмотрены нами ранее [4, 5]. Установлено, что в реакции Фентона, инициированной перекисью водорода, светосумма S пропорциональна способности субстрата к окислению гидроксильными радикалами.

При исследовании индуцированной реакцией Фентона хемилюминесценции можно выделить два режима работы, когда [Fe2+]>[H2O2] и [Fe2+]<[H2O2]. Впервом случае двухвалентное железо окисляется до трехвалентного, двухвалентное железо расходуется и время реакции определяется исходной концентрацией железа. Во втором случае окисленное трехвалентное железо регенерируется обратно в двухвалентное. На это расходуется перекись водорода. Время реакции оказывается существенно больше, чем в первом случае, и оно определяется концентрацией [H2O2] [6, 7].

Случай [Fe2+]>[H2O2] рассмотрен в работе [4]. Было предложено измерять хемилюминесценцию при последовательных разбавлениях пробы в 10 раз, начиная с исходной концентрации. Рассмотрена также зависимость светосуммы хемилюминесценции от концентрации (разведения) исходной пробы и от содержания в пробе гидроперекисей и антиоксидантов при концентрации реагентов [Fe2+]=[H2O2]=10-3 моль/л. Светосумма достигает максимума при определенном разведении. Показано, что способность субстрата к окислению характеризуют светосумма и концентрация субстрата, когда выход свечения максимален. Недостатком такого режима является необходимость измерения хемилюминесценции при последовательных разведениях пробы, что занимает длительное время, и метод уже нельзя назвать экспресс-методом.

Представляет интерес исследовать характеристики светосуммы хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона, для случая [Fe2+]<[H2O2] и сравнить их с характеристиками при [Fe2+]>[H2O2].

Цель исследования -- анализ связи между способностью к окислению и антиоксидантной активностью субстрата по результатам расчета кинетики хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона.

Материалы и методы. Измерения хемилюминесценции осуществляли с помощью биохемилюминометра БХЛ-07 (Н. Новгород, Россия) в 10-15 повторах. Чувствительность прибора составляла ~200 фотонов/с. Непосредственно перед началом работы проводили калибровку прибора по эталонному источнику света [5]. Время измерения светосуммы S -- 30 с. Фон (шумовой ток фотоэлектронного умножителя) вычитался автоматически. Прибор регистрировал амплитуду сигнала (интенсивность излучения I) и вычислял светосумму хемилюминесценции за весь период измерения. Непосредственно измеряемой прибором величиной хемилюминесценции является напряжение, поэтому показатели S и I измеряли в милливольтах (относительных единицах).

Состав пробы: 0,1 мл исследуемого субстрата; 0,4 мл растворителя (вода или раствор Хенкса); 0,4 мл раствора Fe2+. Последним реагентом вводили 0,2 мл перекиси водорода, после чего сразу начинали регистрацию излучения -- светосуммы S. Холостая проба-- светосумма S0 (реакция Фентона без исследуемого субстрата): 0,5 мл растворителя (вода или раствор Хенкса); 0,4 мл раствора Fe2+ и 0,2 мл перекиси водорода. Чтобы исключить влияние нестабильности аппаратуры, при анализе результатов использовали величину относительной светосуммы S/S0.

Кювета имела объем 2 мл и диаметр 1 см. Для реакции Фентона использовали следующие реактивы: раствор FeSO4 (10-3 моль/л в кислой среде, pH=2), раствор перекиси водорода (10-3 и 10-1 моль/л). Поскольку в нейтральной среде двухвалентное железо нестабильно, для растворов железа готовили кислую среду путем добавления серной кислоты в дистиллированную воду.

Регистрировали индуцированную реакцией Фентона хемилюминесценцию альбумина, гемоглобина, смеси альбумина и гемоглобина, а также известных антиоксидантов: фенола C6H5OH, резорцина C6H4(OH)2, пирогаллола C6H3(OH)3. Кроме того, изучали также хемилюминесценцию смеси антиоксидантов с гемоглобином и альбумином. Концентрации альбумина 50 г/л (7·10-4 моль/л) и гемоглобина 70г/л (1,1·10-3 моль/л) были близки их содержанию в крови. Концентрация антиоксидантов -- 50 г/л. Антиоксиданты (фенол, резорцин, пирогаллол) для растворов альбумина и гемоглобина вводили непосредственно в пробу перед добавлением перекиси водорода в количестве 0,1 мл. Использовали бычий сывороточный альбумин, фракция V, молекулярная масса -- 69 кДа, и гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный, молекулярная масса -- 64,5кДа (BioWest, Фанция). В обоих препаратах массовая доля белка составляла не менее 95%, массовая доля жира (липидов) -- не более 1%. Остальные реактивы были химически чистые: дважды дистиллированная вода, рН=6,5; стерильный раствор Хенкса («БиолоТ», Россия).

Измерения хемилюминесценции начинали с регистрации светосуммы S вещества c исходной концентрацией, далее последовательно разбавляли его раствором Хенкса или водой в 10 раз, получали светосуммы при концентрациях 1, 10-1, 10-2, …, 10-10 от исходной (разведения 0, -1, -2, …, -10).

Расчет кинетики изучаемых процессов осуществляли следующим образом [4]. Составляли схему реакций, которая описывает процесс. В схему включали все вещества, участвующие в реакции. Так как константы скорости всех реакций известны, кинетику процесса можно рассчитать. Для этого на основе схемы реакций составляли систему дифференциальных уравнений, где переменными являлись концентрации участвующих в процессе веществ. В каждое уравнение входят скорости накопления и расходования вещества, концентрация которого рассматривается как переменная. Число уравнений равно числу веществ, участвующих в реакции. Задаются начальные условия, т.е. концентрации всех веществ в начальный момент времени. Решением являются концентрации всех участвующих в реакции веществ через заданные интервалы времени после начала реакции. Длительность этих интервалов и полное время реакции задаются как условия. Для решения системы дифференциальных уравнений использовали пакет программ MathCad 14.

Результаты. Зависимость светосуммы хемилюминесценции S/S0 в реакции Фентона от концентрации (разведения) альбумина и гемоглобина водой (0, -1, -2, -3, -4) рассчитана при концентрации перекиси водорода 10-3 моль/л (рис. 1, а) и 10-1 моль/л (рис.1, б). Из рис. 1, а видно, что для обоих испытываемых веществ светосумма при [H2O2]=10-3 моль/л достигает максимума при определенном разведении: -1 -- для альбумина и -2 -- для гемоглобина. При [H2O2]=10-1 моль/л (рис. 1, б) светосумма монотонно уменьшается с уменьшением концентрации пробы.

Изучение зависимости светосуммы хемилюминесценции от концентрации антиоксидантов: фенол, резорцин, пирогаллол при [H2O2]=10-3 моль/л (рис. 2) показало, что фенол полностью гасит хемилюминесценцию, S/S0<1. Два других вещества, которые являются более слабыми антиоксидантами, чем фенол, окисляются гидроксильными радикалами и поддерживают цепную реакцию, для них в максимуме хемилюминесценции S/S0>1.

Для повышения статистической точности результатов анализировали средние значения светосумм в районе максимума хемилюминесценции (разведения от 0 до -4) и ниже максимума (разведения от -5 до -10). Средние значения для концентраций разных диапазонов (табл. 1) показывают, что для фенола при разведениях от 0 до -4 S/S0=0,78, т.е. с учетом ошибок измерений заметно меньше 1. Это означает, что фенол не позволяет развиваться цепной реакции перекисного окисления, инициируемой гидроксильными радикалами, образующимися в реакции Фентона. Резорцин и пирогаллол -- более слабые антиоксиданты, в них цепная реакция хоть и слабо, но развивается. При больших разведениях (от -5 до -10) средняя светосумма для всех испытанных веществ близка к единице.

Гемоглобин и альбумин окисляются гидроксильными радикалами, при этом возникает хемилюминесценция. Добавление фенола в пробы гемоглобина или альбумина полностью прекращает хемилюминесценцию, S/S0=1. Добавление более слабых антиоксидантов уменьшает светосумму хемилюминесценции, но не останавливает хемилюминесценцию полностью.

Любопытен случай, когда смешиваются два вещества, дающие разнуюсветосумму: альбумин и гемоглобин. Средняясветосумма раствора альбумина -- 12,4±2,1 -- существенно превышает светосумму раствора гемоглобина -- 4,0±0,5. Для их смеси светосумма оказалась равной 4,4±0,7 (см. табл. 1).

Светосуммы хемилюминесценции альбумина, гемоглобина и их смеси для разных концентраций перекиси водорода -- 10-3 и 10-1 моль/л (табл. 2) показали, что оба вещества не являются идеальными антиоксидантами, они окисляются гидроксильными радикалами в цепной реакции. Следует отметить, что светосумма в максимуме хемилюминесценции при [H2O2]=10-3 моль/л существенно больше, чем максимальная светосумма при [H2O2]=10-1моль/л. Светосумма, регистрируемая при окислении гемоглобина для обеих концентраций перекиси водорода, оказывается меньше, чем при окислении альбумина. В смеси гемоглобина и альбумина светосумма больше, чем для гемоглобина, но меньше, чем для альбумина.

Обсуждение

Механизм цепного окисления в реакции Фентона в присутствии антиоксидантов и гидроперекисей. Схема реакций, происходящих при цепном окислении органического вещества RH в реакции Фентона, представлена в табл. 3. Константы скорости реакций были проанализированы в работе [8].

В реакции с перекисью водорода (реакция 1, табл. 3) образуется гидроксильный радикал, имеющий наибольший окислительный потенциал Eox(OH*)=2,8 В. Этот потенциал относится к реакции OH*+H++e->H2O, в которой предполагается, что концентрация ионов водорода равна 1 моль/л, что соответствует кислой среде, pH=0. В нейтральной среде окислительный потенциал меньше в соответствии с уравнением Нернста: он уменьшается на 0,059 В с увеличением pH на 1 единицу. Потенциалы других окислителей, относящихся к активным формам кислорода, в кислой среде существенно меньше: Eox(O*)=2,42 В; Eox(O3)=2,07 В; Eox(H2O2)=1,76 В; Eox(HO2*)=1,5 В; синглетный кислород Eox(1O2)=0,94 В [9].

В реакции с гидроперекисью (реакция 2, табл. 3) образуется существенно менее активный органический радикал RO*, окислительный потенциал которого определяется природой радикала R и составляет около 0,7 В. Радикалы OH* и RO* могут инициировать цепной процесс, начало которому дают реакции 3, 4. В обоих случаях цепной процесс развивается при наличии окисляющегося вещества RH.

Хемилюминесценция, индуцированная реакцией Фентона, обусловлена свечением димерасинглетного кислорода, образующегося в процессе реакций, инициируемых гидроксильными радикалами [4]. Кроме синглетного кислорода в реакции Фентона образуются гидроперекиси, которые не дают свечения и не могут быть непосредственно зарегистрированы.

Сами радикалы, образовавшиеся при первичном взаимодействии перекисей с двухвалентным железом, могут гибнуть во взаимодействиях между собой, образуя неактивные продукты (реакции 5, 6). Продолжение цепи -- реакции 7, 8, 9. Скорость цепного процесса определяется константой скорости реакции 8 с окисляющимся веществом RH, величина которой мала и в большинстве случаев составляет от 1 до 60 л(моль·с)-1. В процессе цепной реакции образуются гидроперекиси (реакция 8) и синглетный кислород (реакция 9) [5]. Свечение димерасинглетного кислорода регистрируется биохемилюминометром, при этом измеряется выход реакции 9. Несмотря на малую константу скорости реакции 8, она может давать решающий вклад, если концентрация [RH]>>[ROO*]. При большой концентрации [RH] свечение в реакции 9 может вообще не возникать, так как все радикалы ROO* будут расходоваться в реакции 8. На основании выхода реакции 9 можно судить о скорости цепного окисления гидроксильными радикалами с образованием только светящихся продуктов. Полная скорость цепного окисления определяется выходом реакций 8 и 9, в которых образуется гидроперекись и синглетный кислород.

Обычно в схемах окислительно-восстановительных процессов рассматриваются прооксиданты (вещества, которые поддерживают цепную реакцию) и антиоксиданты (вещества, которые тормозят цепную реакцию). Под действием антиоксидантов свободные радикалы переводятся в неактивную форму, в результате чего инициирование цепной реакции замедляется или полностью прекращается. Особенность цепной реакции заключается в том, что она не ограничивается только первым актом инициирования. В силу закона сохранения свободной валентности, который выполняется в большинстве случаев, один радикал не может погибнуть, радикалы образуются и гибнут парами. В результате первичной реакции с радикалом образуется вторичный радикал, который может снова вступить в реакцию, если его активность достаточно велика. Свободный радикал может инактивироваться только в результате взаимодействия с другим радикалом, либо цепная реакция может замедлиться или практически остановиться, если вторичный радикал окажется малоактивным.

Вещество, которое полностью предотвращает как инициирование, так и развитие цепной реакции, называется ингибитором InH. Ингибирование цепного окисления заключается в том, что применяется вещество, которое с высокой скоростью взаимодействует с радикалом. Взаимодействуя с первичным радикалом (инициатором, например OH*) или со вторичным радикалом, образующимся в процессе цепной реакции ROO*, ингибитор InH дает малоактивный вторичный радикал In* (реакции 10, 11, табл. 3).

В реакции 10 ингибитор перехватывает первичный радикал OH*, предотвращая начало цепной реакции, а в реакции 11 -- вторичный радикал ROO*, образовавшийся после инициирования реакции гидроксильным радикалом, и предотвращает продолжение цепи. Цепное окисление испытываемого вещества RH инициируется и продолжается в реакциях 3-9.

Анализ схемы цепной реакции с участием ингибитора (реакции 3-11) позволяет сделать вывод, что есть два способа подавлять цепную реакцию: применять ловушку для первичных радикалов, инициирующих реакцию (реакция 10), либо ловушку для вторичных радикалов, образующихся на стадии продолжения цепи (реакция 11). Так как свойства первичных и вторичных радикалов разные (в рассмотренном примере первичным является радикал OH*, а вторичным -- радикал ROO*), то и ловушки для них в общем случае могут быть разные. Таким образом, можно говорить, что ловушки для первичных радикалов, инициирующих цепную реакцию, обладают антирадикальной активностью, а ловушки для вторичных радикалов, образующихся на стадии продолжения цепи, обладают антиоксидантной активностью.

Однако схема ингибирования на основе реакций 10 и 11 является сильно упрощенной. Каждый ингибитор (антиоксидант) имеет свою, характерную только для него схему превращения в неактивный продукт после первичного взаимодействия с радикалами. Примером служит схема окисления аскорбиновой кислоты, рассмотренная в работе [10]. К тому же ингибитор может взаимодействовать только с определенными радикалами.

Процессы ингибирования цепных реакций детально были изучены для защиты полимерных материалов от термоокислительной деструкции [11]. В этом случае защищается одно определенное соединение от радикалов известной природы. В биологии задача существенно усложняется [12, 13]. Например, в пробах крови присутствуют разные вещества, точный состав которых не известен, поэтому природа первичных радикалов, которые инициируют окисление, также может быть различной.

Когда в составе пробы обнаруживаются несколько веществ, возможны два варианта интерпретации результатов. Если одно вещество -- антиоксидант и не поддерживает цепную реакцию, то все или бульшая часть гидроксильных радикалов расходуются на окисление этого вещества и цепная реакция окисления других веществ сильно подавляется. Практически полное подавление хемилюминесценции при добавлении в пробу конкретного вещества может означать, что это вещество обладает сильной антирадикальной активностью и поглощает все гидроксильные радикалы.

Если все вещества могут участвовать в цепной реакции, то первичные гидроксильные радикалы инициируют окисление всех веществ. Соотношение выходов продуктов окисления этих веществ определяется концентрацией самих веществ и соотношением констант скоростей реакций инициирования, продолжения и обрыва цепи.

Может оказаться, что окисляться будет преимущественно одно из этих веществ. Тогда можно говорить, что это вещество будет обладать антиоксидантным эффектом по отношению к другим. Эффект можно считать установленным, если мы будем наблюдать продукты цепной реакции. На основании только величины светосуммы многокомпонентного субстрата сделать однозначный вывод об антиоксидантных свойствах какого-либо вещества практически невозможно. Такая ситуация иллюстрируется данными по смеси альбумина и гемоглобина (см. табл. 2). Светосумма смеси оказалась больше светосуммы гемоглобина, но меньше -- альбумина. Сделать отсюда вывод, что гемоглобин обладает антиоксидантными свойствами по отношению к альбумину, нельзя. Анализ продуктов окисления и расходования исходных веществ показывает, что антиоксидантными свойствами по отношению к другим компонентам крови обладает именно альбумин [14].

Особенности протекания реакции Фентона при разных концентрациях перекиси водорода

Случай 1: [Fe2+]>[H2O2], [Fe2+]=10-3 моль/л, концентрация перекиси водорода -- 10-3 моль/л. Зависимость светосуммы хемилюминесценции при последовательных разведениях пробы в 10 раз исследована экспериментально. Эта зависимость для альбумина (разбавления lg[C]/[C0]=0, -1, -2, -3, -4) представлена на рис. 1, кривая 1. Видно, что светосумма достигает максимума при разбавлении -1, для исходной концентрации (разбавление 0) светосумма меньше, а при более сильных разбавлениях (-2, -3, -4) светосумма также уменьшается. Для гемоглобина ситуация аналогична (рис. 1, кривая 2), но максимум хемилюминесценции наблюдается при разбавлении -2. Эффект уменьшения хемилюминесценции при большой концентрации [RH] в обоих случаях связан с расходованием ROO* в реакции 8, так что реакция 9 оказывается подавленной [4]. Молекулярная масса альбумина -- 69 кДа, гемоглобина -- 64,5 кДа, их содержание в исходном растворе -- 50 и 70 г/л, что соответствует концентрации ~10-3 моль/л. Расчеты показали, что подавление хемилюминесценции в реакции 8 возможно при концентрации [RH] ~1 моль/л и более [5]. Наблюдение эффекта подавления хемилюминесценции может означать, что в реакциях 3 и 8 (табл. 3) участвует не весь белок как целое, а его фрагменты RH. При концентрации белковых молекул ~10-3 моль/л концентрация окисляющихся фрагментов может быть существенно больше и составлять 1-10 моль/л, поэтому мы наблюдаем подавление свечения при концентрациях белковых молекул ~10-3 моль/л.

Расчет зависимости параметров хемилюминесценции от концентрации реагентов выполнен в работе [15]. Показано, что концентрация окисляющихся фрагментов [RH] определяет положение максимума хемилюминесценции (разведение пробы). Ингибитор InH и гидроперекись ROOH, которые могут входить в состав пробы, уменьшают светосумму хемилюминесценции, и величина светосуммы в максимуме определяется отношением [InH]/[RH] и [ROOH]/[RH].

Особенность рассмотренного режима заключается в том, что хемилюминесценция определяется только выходом светящихся продуктов в реакции 9. Гидроперекиси, которые также являются продуктом цепной реакции, не дают вклада в хемилюминесценцию, и получаемая информация является не полной.

Случай 2: [Fe2+]<[H2O2], [Fe2+]=10-3 моль/л, концентрация перекиси водорода -- 10-1 моль/л. Когда концентрация перекиси водорода больше концентрации железа, двухвалентное железо, окисленное до трехвалентного в реакции Фентона, регенерируется (восстанавливается) в двухвалентное. При этом расходуется перекись, и процесс будет продолжаться до тех пор, пока перекись полностью не израсходуется [7]. Продолжительность реакции определяется концентрацией перекиси водорода, и она будет превышать 30 с (выбранное время измерения хемилюминесценции). Но основное количество актов реакции происходит в первые доли секунды, после чего хемилюминесценция уменьшается [4]. Накопления органических гидроперекисей не происходит, так как они сразу расходуются в реакции с двухвалентным железом (реакция 2, табл. 3). Возникающее при этом свечение пропорционально выходам реакций 8 и 9. Концентрация двухвалентного железа не падает быстро, как в случае 1, а за счет регенерации поддерживается на почти постоянном уровне [7]. Из-за ограниченного быстродействия регистрирующей аппаратуры часть информации (часть светосуммы, высветившейся во время переднего фронта импульса хемилюминесценции) теряется, но зато зарегистрированная светосумма пропорциональна сумме выходов реакций 8 и 9, т.е. полному выходу продуктов цепной реакции. При стабильном воспроизведении условий эксперимента в разных опытах светосумма будет пропорциональна полной окислительной способности пробы.

Расчет кинетики хемилюминесценции для случая [Fe2+]<[H2O2]. В рамках схемы из 25 реакций, описанной ранее [4], в которую дополнительно включены реакции с ингибитором и реакция гидроперекиси с гидроксильным радикалом (реакции 10-12, табл. 3), рассчитана зависимость относительной светосуммы S/S0 от концентрации в пробе окисляющихся фрагментов [RH]. Для расчета кинетики решалась система из 15 дифференциальных уравнений. При этом предполагалось, что константа скорости реакции гидроксильных радикалов с ингибитором составляла 109 л(моль·с)-1, а с веществом RH -- 107 л (моль·с)-1. Константы скорости остальных реакций выбраны наиболее характерными для биологических субстратов [8]. Под концентрацией [RH] в случае высокомолекулярного соединения (белка) подразумевалась концентрация фрагментов этого соединения, способных независимо окисляться. Концентрация белков в крови, также как в рассмотренном выше случае 1 ([Fe2+]>[H2O2]), составляла порядка 10-3 моль/л, в то время как концентрация окисляющихся групп [RH] могла достигать 1 моль/л и более. Результаты расчета представлены на рис. 3. Видно, что светосумма S/S0 монотонно растет с ростом концентрации [RH]. Следует подчеркнуть, что эта зависимость -- нелинейная. Это видно как из расчета, так и из экспериментальных данных (рис. 1, б).

При концентрации окисляющихся фрагментов [RH], равной 10 моль/л, рассчитана зависимость S/S0 от концентраций ингибитора [InH] и окисленного вещества [ROOH] (рис. 4). С ростом концентрации ингибитора и гидроперекиси светосумма уменьшается. Видно, что при равных концентрациях ингибитора и гидроперекиси гидроперекись сильнее уменьшает светосумму, чем ингибитор. Связано это с тем, что гидроперекись взаимодействует с железом (реакция 2, табл. 3), расходует его, уменьшая выход радикалов в реакции Фентона. Концентрация железа в реакции 2 больше, чем концентрация радикалов ROO*, с которыми взаимодействует ингибитор (реакция 11). Поэтому влияние гидроперекисей на величину светосуммы оказывается сильнее, несмотря на большую разницу величины констант реакций 2 и 11.

Таким образом, при наличии в пробе гидроперекиси она будет расходовать двухвалентное железо, уменьшая тем самым выход гидроксильных радикалов и светосумму хемилюминесценции, индуцированной реакцией Фентона. Подчеркнем, что гидроперекись не является антиоксидантом. Взаимодействие гидроперекиси с гидроксильным радикалом (реакция 12) поддерживает цепную реакцию. Однако гидроперекись уменьшает количество первичных гидроксильных радикалов путем снижения концентрации реагентов и тем самым уменьшает светосумму хемилюминесценции. Если в исходной пробе много гидроперекисей, проба сильно окислена, то хемилюминесценция будет подавлена. Уменьшение хемилюминесценции окисленной пробы по сравнению с пробой того же состава, но не окисленной, не будет означать, что в пробе есть антиоксиданты. Это будет только означать, что окислительная способность предварительно окисленной пробы меньше, чем неокисленной. Это является особенностью протекания реакции Фентона, а не свойством субстрата.

Случай 2 ([Fe2+]<[H2O2]) позволяет более оперативно оценивать способность субстрата к окислению, но случай 1 ([Fe2+]>[H2O2]) дает возможность получать дополнительную информацию о составе пробы [15].

Линейной зависимости между какой-либо характеристикой испытываемого вещества и регистрируемой светосуммой хемилюминесценции не существует. Это видно как из экспериментальных данных (см. рис. 1), так и из расчетных (см. рис. 3, 4). Во всех случаях при [Fe2+]<[H2O2] светосумма уменьшается с ростом концентрации антиоксиданта [InH], гидроперекиси [ROOH] и увеличивается с ростом [RH]. Линейная зависимость имеется только при [Fe2+]=[H2O2]=10-3 моль/л (случай 1) между концентрацией [RH] и разведением, при котором наблюдается максимум хемилюминесценции. Таким образом, при [Fe2+]<[H2O2] отсутствует линейная зависимость между светосуммой S/S0 и концентрациями [RH], [ROOH] и [InH], поэтому получаемые результаты носят качественный характер.

Связь светосуммы в реакции Фентона с антиоксидантной активностью пробы. Реакция перекисного окисления органического вещества RH является цепной, и малое первичное воздействие приводит к большим конечным повреждениям в объекте. Задача антиоксиданта -- прервать цепь окисления или не допустить ее возникновения. Снижение скорости развития цепного окисления также имеет большое значение для поддержания равновесия в системе, баланса антиоксидантов и прооксидантов.

В биологии термин «антиоксидант», а в химии полимеров «ингибитор» -- это вещество, которое после взаимодействия с радикалом образует малоактивный радикал, который не может участвовать в продолжении цепи. После введения в систему антиоксидант расходуется, и когда он израсходуется, цепная реакция продолжится.

Применительно к биологии термин «антиоксидант» можно определить следующим образом: это вещество, которое, присутствуя в малых концентрациях относительно окисляющегося субстрата, значительно замедляет или предотвращает окисление последнего. Окислителями являются активные формы кислорода и азота, в большинстве случаев это радикалы. Однако существуют активные частицы разного типа. Они могут не быть радикалами, к таким частицам относятся пероксинитрит, азотистая и пероксиазотистая кислота. Антиоксидант может перехватывать активную частицу (взаимодействовать в первую очередь с ней) либо предотвращать ее образование. Таким образом, антиоксидант должен быть ориентирован на объект, который необходимо защищать.

Для характеристики антиоксидантной способности используют разные понятия [16-18]: полная антиокислительная способность (totalantioxidantcapacity, TAC), полная реакция антиоксидантов (totalantioxidantresponse, TAR). Поскольку антиоксиданты ориентированы на определенный вид радикалов, то используют понятия, ориентированные на вид поглощаемых радикалов: способность поглощать кислородные радикалы (oxygenradicalabsorbancecapacity, ORAC). Характеристики испытываемых веществ связывают с характеристиками известных антиоксидантов, например эквивалентная Тролоксу антиокислительная способность (Trolox-equivalentantioxidantcapacity, TEAC). Наиболее общим является параметр, характеризующий способность антиоксиданта поглощать все радикалы (totalradicaltrappingantioxidantparameter, TRAP). Величина TRAP равна сумме концентраций всех антиоксидантов, умноженной на стехиометрический коэффициент каждой реакции. При этом содержание каждого антиоксиданта определяется отдельно. Характеристики радикалов, возникающих в биологических объектах, и их реакции рассмотрены в работах [19, 20].

Для биологических субстратов важным является баланс «прооксидант-антиоксидант» (prooxidantantioxidantbalance, PAB). Были выполнены работы, в которых такой баланс определялся в одном опыте [21, 22]. Для оценки баланса использовалась способность реагента TMB (3,3'.5,5'-tetramethylbenzidine.2HCl, T-3405) в водном растворе менять цвет: при окислении TMB раствор окрашивается, измеряется оптическая плотность при л=450 нм относительно оптической плотности линий 620 или 570 нм. При восстановлении раствор обесцвечивается. Метод не работает, если восстановительная способность пробы превышает окислительную способность, раствор будет все время бесцветным.

При исследовании антиоксидантной активности всегда используется искусственный источник свободных радикалов (инициатор окисления), воздействию которого подвергается испытываемое вещество. Затем регистрируются либо промежуточные продукты процесса окисления, либо снижение концентрации исходного вещества. Процесс окисления характеризуется также потреблением кислорода, который можно измерять. Для количественной характеристики антиоксидантной активности исследуемой пробы сравнивают антиоксидантные показатели пробы с показателями антиоксиданта, принятого за эталон. Разные инициаторы окисления генерируют разные свободные радикалы. Поэтому для конкретной задачи важно знать, для каких именно радикалов нужно исследовать антиоксидантную активность.

В качестве одного из экспресс-методов оценки антиоксидантной способности применяется наблюдение регистрируемой биохемилюминометром хемилюминесценции при введении в пробу двухвалентного железа [23, 24]. При наличии в пробе гидроперекиси двухвалентное железо позволяет длительное время генерировать радикалы ROO*, которые идентифицируются по образованию синглетного кислорода.

В качестве источника свободных радикалов ROO* в работе [24] использовали 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан)дигидрохлорид (АБАПД) или 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан) (АБАП), а возникающее при нагревании препарата излучение усиливали люминолом. При 37°С эти вещества разлагаются с образованием двух радикалов R* и газообразного азота. Период полураспада АБАП составляет 195 ч, поэтому после установления стационарного режима он представляет собой источник радикалов практически постоянной интенсивности. После соединения с кислородом воздуха (R*+O2) образуются радикалы ROO*, которые инициируют свечение люминола. В случае добавления вещества, которое обладает антиоксидантными свойствами, оно перехватывает радикалы ROO* и влияет на свечение: уменьшает, если цепь окисления прерывается, но может и увеличивать свечение, если радикалы ROO* инициируют продолжение цепной реакции. В реакции с радикалами антиоксидант расходуется. Антиоксидантная способность пропорциональна длительности периода индукции: чем он больше, тем больше антиоксидантная способность. Зависимость периода индукции от концентрации вводимого антиоксиданта оказывается линейной [23-25]. Метод наблюдения периода индукции не работает, если окислительная способность превышает восстановительную, так как свечение будет появляться сразу после введения железа.

Рассмотрим возможности применения реакции Фентона для оценки антиоксидантной активности. Реакция Фентона является источником гидроксильных радикалов, способных окислять практически любые вещества, в том числе и все антиоксиданты. Хемилюминесценцию вызывают продукты взаимодействия гидроксильных радикалов с веществами. Только очень сильные антиоксиданты, такие как фенол, полностью гасят хемилюминесценцию и не поддерживают цепную реакцию. Поэтому в реакции Фентона можно говорить о способности субстрата к окислению гидроксильными радикалами. При этом в связи с отсутствием строго линейной зависимости между характеристиками пробы (концентрациями [RH], [InH], [ROOH]) получаемые результаты являются качественными.

Традиционно применяемые методы определения антиоксидантной активности основаны на том, что в них определяется количество радикалов, вырабатываемых реагентом, генерирующим радикалы. Далее регистрируется уменьшение их концентрации после введения антиоксиданта, связанное с поглощением радикалов. Если антиоксидант сильный и сразу поглощает все радикалы, то радикалы исчезают и наблюдается период индукции, т.е. время, через которое антиоксидант израсходуется, и радикалы снова появятся. В этих методах происходит поглощение радикалов антиоксидантами, что является прямым доказательством наличия антиоксиданта и его активности.

В отличие от этого в реакции Фентона наблюдаются продукты реакции, а не сами радикалы. Притом реакция возникает практически с любым веществом. Выход продуктов реакции, инициированной гидроксильными радикалами, определяется константами скорости реакций инициирования, продолжения и обрыва цепи. Увеличение или уменьшение выхода свидетельствует о разных значениях этих констант, но не указывает на подавление цепной реакции путем образования неактивных продуктов. Поэтому нельзя доказать, как способность субстрата к окислению гидроксильными радикалами связана с антиоксидантной способностью пробы.

Можно указать на возможность определения антиоксидантной активности с использованием реакции двухвалентного железа с гидроперекисью (реакция 2, табл. 3). После реакций 4 и 7 образуется радикал ROO*. Этот радикал идентифицируется в реакции 9 по свечению димерасинглетного кислорода. При введении в пробу испытываемого вещества, являющегося антиоксидантом и расходующим радикалы ROO*, свечение, возникающее в реакции 9, будет уменьшаться. Если вещество является прооксидантом и поддерживает цепную реакцию, свечение будет увеличиваться. Используемая в такой реакции гидроперекись должна быть сильным окислителем. Например, можно использовать гидропероксидтрет-бутила. Поэтому исследование хемилюминесценции, возникающей в реакциях гидроперекисей с двухвалентным железом, может представлять интерес для дальнейших исследований.

хемилюминесценция гидроперекись антиоксидантный фентон

Заключение

Гидроксильные радикалы, генерируемые в реакции Фентона, инициируют протекание в субстрате цепной реакции. Продуктами цепной реакции являются гидроперекись и синглетный кислород. Характеристики хемилюминесценции, возникающей в реакции Фентона, определяются соотношением концентраций двухвалентного железа и перекиси водорода.

При [Fe2+]>[H2O2] двухвалентное железо расходуется, светосумма хемилюминесценции определяется выходом светящихся продуктов (синглетного кислорода). Время реакции определяется концентрацией двухвалентного железа. Образующиеся в цепной реакции гидроперекиси остаются неидентифицированными.

При [Fe2+]<[H2O2] окисленное до трехвалентного состояния железо регенерируется в двухвалентное. Время реакции определяется концентрацией перекиси водорода. Светосумма хемилюминесценции пропорциональна суммарному выходу гидроперекиси и синглетного кислорода. Светосумма увеличивается с ростом концентрации окисляющихся групп [RH] и уменьшается с ростом концентрации ингибитора [InH] и гидроперекиси [ROOH], уже накопленной в пробе. Линейной зависимости между светосуммой и характеристиками пробы нет, поэтому получаемые результаты носят качественный характер.

Светосумма в реакции Фентона характеризует способность субстрата к окислению и в общем случае никак не связана с антиоксидантной способностью пробы.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Литература

Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г., Иванова И.П., Кузнецов С.С., Сазанов А.И. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте. Современные технологии в медицине 2010; 4: 27-32.

Иванова И.П. Изменение эндогенной токсичности и уровня хемилюминесценции в крови животных-опухоленосителей после воздействия некогерентным световым излучением. Нижегородский медицинский журнал 2006; 2: 183-188.

Масленникова А.В., Щербатюк Т.Г., Лазарева В.А., Давыденко Д.В. Прогностическое значение параметров прооксидантного-антиоксидантного статуса больных местно-распространенным раком полости рта и глотки. Медицинский альманах 2009; 3: 110-113.

Ivanova I.P., Trofimova S.V., Piskarev I.M., Aristova N.A., Burhina O.E., Soshnikova O.O. Mechanism of chemiluminescence in Fenton reaction. JournalofBiophysicalChemistry 2012; 3(1): 88-100, http://dx.doi.org/10.4236/jbpc.2012.31011.

Иванова И.П., Трофимова С.В., Пискарев И.М. Хемилюминесценция, индуцированная реакцией Фентона, -- математическое моделирование процесса; особенности, параметры и условия применения для биомедицинских исследований. Современные технологии в медицине 2014; 6(4): 14-25.

Ermolin S.V., Ivanova I.P., Knyazev D.I., Trofimova S.V., Piskarev I.M. Mechanism of water luminescence upon radiolysis under the effect of background radiation. Russian Journal of Physical Chemistry A 2012; 86(6): 1029-1032,http://dx.doi.org/10.1134/s003602441206009x.

Аристова Н.А., Иванова И.П., Трофимова С.В., Князев Д.И., Пискарев И.М. Люминол-зависимое свечение, сопровождающее реакцию Фентона. Электронный научный журнал «Исследовано в России» 2011; 77-86, https://istina.msu.ru/publications/article/1108350/.

Ivanova I.P., Piskarev I.M., Trofimova S.V. Initial stage of lipid peroxidation with HO2· radicals. Kinetic study. American Journal of Physical Chemistry 2013; 2(2): 44-51,http://dx.doi.org/10.11648/j.ajpc.20130202.13.

CRC handbook of chemistry and physics. 95th edition. Editor-in-Chief Haynes W.M. CRC Press; 2014.

Ivanova I.P., Trofimova S.V., Piskarev I.M. Evaluation of prooxidant properties of ascorbic acid. Biophysics 2013; 58(4): 453-456, http://dx.doi.org/10.1134/s0006350913040076.

Музафаров А.М., Кузнецов А.А., Заремский М.Ю., Зеленецкий А.Н. Введение в химию высокомолекулярных соединений. М: Изд. МГУ; 2010.

Augusto O., Miyamoto S. Chapter II. Oxygen radicals and related species. In: Principles of free radical biomedicine. Vol. 1. Pantopoulos K., Schipper H.M. (editors). NovaSciencePublishers; 2011; p. 1-23.

Мукменева Н.А., Бухаров С.В., Черезова Е.Н., Нугуманова Г.Н. Фосфорорганические антиоксиданты и цветостабилизаторы полимеров. Казань: КГТУ; 2010; 296 с.

Taverna M., Marie A.-L., Mira J.P., Guidet B. Specific antioxidant properties of human serum albumin. AnnalsofIntensiveCare 2013; 3(1): 4, http://dx.doi.org/10.1186/2110-5820-3-4.

Piskarev I.M., Trofimova S.V., Ivanova I.P., Burkhina O.E. Investigation of the level of free-radical processes in substrates and biological samples using induced chemiluminescence. Biophysics 2015; 60(3): 400-408, http://dx.doi.org/10.1134/s0006350915030148.

Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Методы исследования антиоксидантов. Химия растительного сырья 2004; 3: 63-75.

Kusano C., Ferrari B. Total antioxidant capacity: a biomarker in biomedical and nutritional studies. JournalofCellandMolecularBiology 2008; 7(1): 1-15.

Huang D., Ou B., Prior R.L. The Chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53(6): 1841-1856,http://dx.doi.org/10.1021/jf030723c.

Занозина О.В., Боровков Н.Н., Щербатюк Т.Г. Свободно-радикальное окисление при сахарном диабете 2-го типа: источники образования, составляющие, патогенетические механизмы токсичности. Современные технологии в медицине 2010; 3: 104-112.

Мартусевич А.А., Перетягин С.П., Мартусевич А.К. Молекулярные и клеточные механизмы действия синглетного кислорода на биосистемы. Современные технологии в медицине 2012; 2: 128-134.

Boskabadi H., Moeini M., Tara F., Tavallaie S., Saber H., Nejati R., Hosseini G., Mostafavi-Toroghi H., Ferns G.A.A., Ghayour-Mobarhan M. Determination of prooxidant-antioxidant balance during uncomplicated pregnancy using a rapid assay. JournalofMedicalBiochemistry 2013; 32(3): 227-232, http://dx.doi.org/10.2478/jomb-2013-0018.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Описание физического процесса хемилюминесценции. Его проявление у живых существ. Известные ученные, занимавшиеся исследованиями выделения света при химических реакциях. Использование данного явления в биологии и медицине и для диагностики заболеваний.

    презентация [1,0 M], добавлен 03.11.2014

  • Синтез флавоноидов в растениях. Биологическая активность флавоноидов и их классификация. Определение антиоксидантной активности ДГК методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Изучение перекисного окисления липидов в присутствии дигидрокверцетина.

    дипломная работа [2,4 M], добавлен 25.06.2009

  • Антиоксидантная активность растительных материалов. Описание растений, обладающих антиоксидантной активностью. Определение содержания витамина С в калине обыкновенной в период созревания, содержания полифенольных соединений в различных сортах чая.

    дипломная работа [309,8 K], добавлен 02.04.2009

  • Особенности развития, строения, химического состава, обмена веществ и функций эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Существующие типы гемоглобина. Токсичные формы кислорода в крови человека. Основные составляющие антиоксидантной системы организма.

    презентация [202,4 K], добавлен 18.05.2015

  • Понятие возбудимости и раздражимости, способность живых клеток воспринимать изменения внешней среды и отвечать на раздражения реакцией возбуждения. Скорость протекания циклов возбуждения в нервной ткани (лабильность). Свойств биологических мембран.

    реферат [1005,0 K], добавлен 31.12.2012

  • Сон как естественный физиологический процесс пребывания в состоянии с минимальным уровнем мозговой деятельности и пониженной реакцией на окружающий мир. Фазы сна: быстрая и медленная, их отличительные особенности и продолжительность. Причины нарушений.

    презентация [1,1 M], добавлен 22.05.2014

  • Антропогенная нагрузка на здоровье населения в условиях промышленного города. Активные формы кислорода. Антиоксидантная система. Определение содержания гемоглобина, количества и активности восстановленного глутатиона. Обсуждение результатов исследования.

    дипломная работа [96,2 K], добавлен 12.11.2008

  • Исследование количественных закономерностей развития биологических процессов на молекулярном уровне во времени. История химической кинетики. Системы подвижности эукариотических клеток: микротрубочки, микрофиламенты, мембраны, генерация движения.

    курсовая работа [11,4 M], добавлен 20.06.2009

  • Обзор изменения газообмена у животных под влиянием солнечного света. Анализ взаимосвязи между активностью Солнца, нервной системой человека и смертностью. Изучение связи холерных пандемий с увеличением процесса образования пятен на небесном светиле.

    презентация [523,1 K], добавлен 08.04.2012

  • Сущность полимеразной цепной реакции, ее сопоставление с реакцией атомного взрыва. Последовательность операций включения ДНК в плазмиду. Комплекс мер по умножению количества индивидуального белка и его подлинность. Физические основы электрофореза.

    реферат [62,1 K], добавлен 11.12.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.