Размещено на http://www.allbest.ru/

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Спонтанная нейронная активность в энторинальной коре новорожденных крыс

Шерозия Максим Георгиевич

Москва - 2009

Работа выполнена в лаборатории синаптической пластичности (заведующий - д.б.н., профессор Л.Л. Воронин ) и в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий - д.б.н., профессор П.М. Балабан) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - д.б.н., профессор П.М. Балабан).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук В.И. Майоров

доктор биологических наук А.А. Фролов

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится 17 декабря 2009 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета (Д.002.044.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (117865, Москва, ул. Бутлерова, д. 5А).

Факс: (495) 338-85-00 E-mail: admin@ihna.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (ул. Бутлерова, д. 5а).

Автореферат разослан 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор В.В. Раевский

Общая характеристика работы

Спонтанная активность является отличительной чертой развивающейся нервной системы. Спонтанная активность наблюдается уже у нейронных предшественников (Spitzer, 2006). Обычно такая активность регистрируется как флуктуации концентрации внутриклеточного кальция или кальциевые спайки (Spitzer, 2006; Crepel et al., 2007). С формированием первых контактов между нейронами, электрических синапсов, появляется синхронизированная спонтанная активность. Далее с развитием в онтогенезе химических синапсов появляются новые виды синхронной спонтанной активности (Crepel et al., 2007; Allene et al., 2008). Начиная с момента появления химических синапсов синхронную активность нейронов можно считать сетевой в обычном смысле слова. Синхронизированная спонтанная активность нейронов в период эмбрионального и постнатального развития достаточно интенсивно изучалась во многих структурах нервной системы позвоночных как in vitro, так и in vivo, в особенности, на гиппокампе, коре, сетчатке и спинном мозге. Предполагается, что спонтанная активность играет ключевую роль при формировании нейросети и созревании нейронов (Katz and Shatz, 1996). Показано, что спонтанная активность сетчатки в период эмбрионального развития необходима для формирования топографической организации связей в формирующейся зрительной системе (Sretavan et al., 1988; Grubb et al., 2003; McLaughlin et al., 2003; Chandrasekaran et al., 2005; Mrsic-Flogel et al., 2005; Torborg et al., 2005). Спонтанная активность мотонейронов спинного мозга у эмбрионов влияет на путь роста аксонов к их целям (Hanson and Landmesser, 2004, 2006). В гиппокампе новорожденных животных так называемые гигантские деполяризационные потенциалы способны вызывать долговременную потенциацию формирующихся “молчащих” синапсов (Kasyanov et al., 2004; Mohajerani and Cherubini, 2006; Mohajerani et al., 2007). Понимание механизма генерации спонтанной активности в развивающихся нейросетях представляется фундаментальной научной задачей, поскольку, как было показано, явление не является особенностью какой-то одной структуры, а отражает общую тенденцию. В большинстве работ на срезах коры и гиппокампа изучались, главным образом, синаптические механизмы генерации спонтанной активности и соответствующие возрастные особенности синаптической передачи (Ben-Ari et al. 1989; Bolea et al. 1999; Gaiarsa et al. 1991; Hollrigel et al. 1998; Khazipov et al. 2001; Lamsa et al. 2000; Allene et al., 2008). Например, было показано, что у эмбриональных и новорожденных животных глицин и ГАМК обладают необычным деполяризующим действием (Ben-Ari et al. 1989; Ben-Ari, 2002; Ben-Ari et al., 2007). При этом электрофизиологические свойства созревающих нейронов и их роль в генерации спонтанной активности остаются мало исследованными.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной целью данной работы являлось изучение спонтанной активности и свойств созревающих нейронов в энторинальной коре новорожденных животных с использованием электрофизиологических и фармакологических методов, а также методов математического моделирования.

В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие задачи:

1. Сравнить свойства нейронов энторинальной коры новорожденных и взрослых животных в экспериментах с регистрацией внутриклеточных потенциалов.

2. Исследовать возможную роль пачечных пейсмекерных нейронов в генерации спонтанной активности в энторинальной коре новорожденных животных.

3. На основе экспериментальных данных построить математическую модель собственной пачечной активности нейронов в энторинальной коре новорожденных животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Пирамидные нейроны в третьем слое энторинальной коры у новорожденных животных обладают собственной пачечной активностью. Собственная пачечная активность нейронов третьего слоя энторинальной коры новорожденных крыс (Р5-Р13) представлена короткими (до 1 сек) и длинными (до 20 сек) пачками спайков. Короткие пачки спайков полностью пропадают к десятому дню жизни, а количество клеток генерирующих длинные пачки достигает максимума на Р8-Р10 и затем значительно уменьшается. Изменение электрофизиологических свойств с возрастом отражает созревание нейронов.

2. Генерация длинных пачек спайков происходит при активации неспецифического катионного кальций-зависимого CAN и медленного натриевого NaP токов. Терминация пачек спайков обусловлена активацией калиевых токов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В рамках настоящей работы впервые исследованы свойства нейронов в третьем слое энторинальной коры у новорожденных животных. Обнаружено, что большая часть пирамидных нейронов у новорожденных крыс обладает собственной пачечной активностью. Исчезновение этого свойства нейронов в энторинальной коре с возрастом животного отражает созревание нейронов. Определены основные ионные токи, лежащие в основе пачечной активности клеток в энторинальной коре новорожденных животных. Генерация пачек спайков происходит при последовательной активации де- и гиперполяризующих ионных проводимостей. Построена биофизическая модель пачечной активности нейронов, воспроизводящая все основные свойства реальных клеток. Посредством моделирования и литературных данных удалось объяснить эффект усиления пачечной активности нейронов при снижении концентрации экстраклеточного кальция.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Получены новые данные о созревании нейронов и нейросети в процессе постнатального развития, необходимые для понимания нейрофизиологических основ развития центральной нервной системы. Наши данные подтверждают идею о зависимости созревания нейронов и нейросети от спонтанной электрической активности клеток. Анализ свойств нейронов у новорожденных животных расширяет представления теоретической биологии о возможных механизмах самоорганизации нейронов в структурированные нейросети. Совокупность представленных данных может найти применение при конструировании искусственных нейронных сетей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты работы были доложены на международных форумах SFN (Атланта 2006, Сан Диего 2007, Чикаго 2009); XX Съезде российских физиологов (Москва, 2007); на конференциях молодых ученых ИВНД и НФ РАН (Москва, 2006, 2008). Диссертация апробирована 13 октября 2009 года на совместном заседании лаборатории клеточной нейробиологии обучения и лаборатории нейроонтогенеза Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 6 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (204 ссылки). Работа изложена на 131 странице, включает 27 рисунков и 8 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приготовление срезов

Эксперименты проводились на переживающих горизонтальных срезах энторинальной коры крыс линии Wistar возрастом с пятого по тринадцатый Р5-13 день жизни (Р0 - день рождения). После декапитации, мозг быстро перемещали в холодный перфузионный раствор (2-4 ^оС), предварительно насыщенный карбогеном (95% О₂, 5% CО₂). После охлаждения (1-2 мин) посредством электрического вибротома (Campden Instruments, Loughborough, UK) изготовлялись срезы толщиной 300-500 мкм. При регистрации сетевой активности использовали срезы толщиной в 500 мкм, в пэтч экспериментах с блокированной синаптической передачей использовали срезы толщиной 300 мкм. Затем срезы помещались в камеру для инкубации, где хранились при комнатной температуре в аналогичном растворе как минимум 1 ч. после приготовления, после чего по одному переносились в камеру для регистрации. В камере для инкубации перфузионный раствор постоянно насыщался карбогеном.

Растворы

Раствор для перфузии (искусственная спинномозговая жидкость) в мМ: 130 NaCl, 3.5 KCl, 1.2 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 1.3 MgCl₂, 2 CaCl₂ и 25 D-глюкоза. В части экспериментов использовался перфузионный раствор содержащий 1 мМ Са²⁺. Раствор насыщался карбогеном (95% О₂, 5% CО₂), pH раствора - 7.3-7.4.

Раствор для заполнения пэтч электрода-микропипетки в мМ: 115 K-глюконат (Sigma), 20 KCl, 10 Na₂-фосфокреатин (Sigma), 10 Hepes (Sigma), 4 MgАТФ (Sigma), 0.3 ГТФ (Sigma), pH 7.2 (KOH). В ряде экспериментов использовали внутриклеточный хелатор кальция BAPTA, раствор в мМ: 30 K₄-BAPTA, 50 сахароза, 20 KCl, 10 Na₂-фосфокреатин (Sigma), 10 HEPES (Sigma), 4 MgATP (Sigma), and 0.3 GTP (Sigma). Растворы хранились в замороженном виде при -20 ^оС. Перед использованием растворы размораживали и пропускали через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм.

Раствор для заполнения электрода-микропипетки при экстраклеточной фокальной регистрации в М: 2 K⁺-ацетат. Перед использованием раствор пропускали через фильтр с диаметром пор 0.2 мкм.

Экспериментальная установка

Для избежания механических колебаний, механическая часть (камера для регистрации, микроманипуляторы, микроскоп, проток перфузионного раствора) размещались на массивной металлической плите. Сама плита была помещена внутрь металлической коробки, которая служила экраном от электрических наводок. Параметры регистрации и стимуляции задавались с помощью компьютера. От компьютера через АЦП, командный сигнал подавался на стимулятор и далее на стимулирующий электрод. От регистрирующего электрода сигнал подавался на вход усилителя (Axopatch-1D или Axoclamp-2B, Axon Instruments, Union City, CA, USA) и затем через АЦП, записывался в компьютер. Частота оцифровки составляла 5-10 кГц. Регистрируемый сигнал выводился на монитор компьютера. Для подведения электродов использовались микроманипуляторы позволяющие перемещать электроды в трех плоскостях. В ходе эксперимента регистрировали разность потенциалов или протекающий ток между регистрирующим и индифферентным электродами. В качестве индифферентного электрода использовалась хлорированная серебряная проволока, опущенная непосредственно в камеру для регистрации.

При пэтч регистрации использовался метод погруженных срезов. Камера для регистрации представляла собой открытую сверху пластиковую емкость, имеющую входное и выходное отверстия и рабочий резервуар. Легкое прижатие среза стимулирующим электродом к дну камеры было достаточно для его фиксации. Температура поддерживалась с помощью термостата (Temperaturcontroller III, Luigs and Neumann, Germany). При фокальной экстраклеточной регистрации использовался поверхностный метод. Срез размещали на капроновой сетке, натянутой на границе раздела фаз раствор-воздух (Interface recording chamber, Fine Science Tools, Heidelberg, Germany). Над срезом создавалась атмосфера из теплого влажного карбогена. Скорость протока перфузионного раствора во всех случаях регулировалась посредством медицинской капельницы и составляла 2-3 мл/мин, температура - 31-32 ^оС. Раствор из камеры регистрации откачивался насосом.

Регистрация

Внутриклеточную регистрацию проводили по методике “точечной регистрации от целой клетки” (patch clamp) в режиме фиксации тока или потенциала (Hamill et al., 1981). Для регистрации использовались стеклянные микропипетки, заполненные раствором (см. выше). Микропипетки вытягивали из боросиликатных стеклянных капилляров (Sutter Instruments, USA) с помощью пуллера (Brown-Flaming puller P-87, Sutter Instruments, Novato, CA, USA). Для уменьшения эффекта диализа использовались микропипетки с сопротивлением 10-14 МОм. В раствор, заполняющий микропипетку, была погружена хлорированная серебряная проволока, которая соединялась с входной головкой усилителя. Пэтч осуществляли под визуальным контролем с помощью микроскопа в режиме фиксации потенциала (0 мВ). В микропипетке создавали небольшое повышенное давление, так чтобы раствор постоянно вытекал через отверстие на кончике, благодаря чему он оставался чистым. Через усилитель на микропипетку подавали контрольную ступеньку потенциала (1-10 мВ, длительностью 100 мс, с интервалом 200 мс). По величине ответа на контрольную ступеньку определялось сопротивление микропипетки. При приближении к соме нейрона убирали давление в микропипетке. В случае образования плотного контакта (гигасил) между кончиком микропипетки и мембраной нейрона возрастало видимое сопротивление микропипетки. Обычно входное сопротивление микропипетки достигало максимального значения и стабилизировалось в течение 5-10 мин после контакта (до 10-20 ГОм). Получившаяся таким образом конфигурация носит название cell attached. В этой конфигурации с помощью усилителя компенсировали емкость микропипетки. Затем потенциал микропипетки фиксировали на значениях от -50 до -70 мВ. Далее в микропипетке на доли секунды создавали отрицательное давление и разрушали фрагмент мембраны под кончиком микропипетки (рвали внутрь). В случае удачного проникновения ответ клетки на контрольную ступеньку потенциала начинал соответствовать току перезарядки емкости клеточной мембраны. Неизменность формы ответа на контрольную ступеньку на протяжении всей записи свидетельствовала о хорошем качестве пэтча. Входное сопротивление нейронов определяли по ответу на гиперполяризующий импульс тока (5-10 пА, 1 сек) в режиме фиксации тока.

Для экстраклеточной регистрации использовались микропипетки с сопротивлением порядка 1 МОм. Кончик микропипетки постепенно погружали в срез и находили зону с максимальным отношением сигнал/шум.

Для просмотра данных и элементарного анализа использовали программу Spike 2 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Для точных расчетов файлы экспортировали в Excel или Origin60. Статистику рассчитывали в программах SigmaStat 3.1 и SigmaPlot 9.0.

Результаты и обсуждение

В первой серии экспериментов регистрировалась спонтанная нейронная активность на срезах энторинальной коры посредством экстраклеточных электродов. На Рис. 1 приведен пример фокальной экстраклеточной записи спонтанной активности. По форме и длительности, мы поделили сетевые разряды на два типа: 1) короткие (Рис. 1Аа), сходные с гигантскими деполяризационными потенциалами в гиппокампе новорожденных животных (длительность: 0.9 ± 0.36 сек; амплитуда: 0.16 ± 0.1 мВ; средняя частота: ~ 0.08 Гц). Короткие сетевые разряды наблюдались в 34 (64 %) из 53 срезов; 2) длительные сетевые разряды (Рис. 1Аб) наблюдались в 11 (21 %) срезах (длительность: 3.5 ± 1.2 сек; амплитуда: 0.1 ± 0.08 мВ; средняя частота: ~ 0.06 Гц). В 8 срезах (15 %) наблюдалась смешанная активность (Рис. 1Ав), представленная, как короткими, так и длительными сетевыми разрядами (длительность и амплитуда коротких разрядов: 1.19 ± 0.5 сек, 0.08 ± 0.05 мВ; длительность и амплитуда длинных разрядов: 3.5 ± 2 сек, 0.09 ± 0.06 мВ).

Удаление гиппокампа не приводило к исчезновению или существенным изменениям спонтанной активности в энторинальной коре (25 срезов), что говорит о локальном происхождении активности.

Рис. 1. Фокальная экстраклеточная регистрация спонтанной активности в энторинальной коре новорожденных крыс. Срезы содержат энторинальную кору и гиппокамп. А) примеры спонтанной активности: а) короткие сетевые разряды; б) длительные сетевые разряды; в) смешанная активность. Б) усиление спонтанной активности при увеличении [K⁺]_ex: появление длительных разрядов.

Поскольку спонтанная активность зависит от общей возбудимости клеток, мы исследовали влияние тонической деполяризации всех клеток среза посредством увеличения концентрации экстраклеточного калия [K⁺]_ex с 3.5 до 8 мМ (Sipila et al., 2005). Увеличение [K⁺]_ex приводило к усилению спонтанной сетевой активности в энторинальной коре (Рис. 1Б). В 11 из 12 срезов в контроле генерировавших только короткие сетевые разряды, увеличение [K⁺]_ex приводило к появлению длительных сетевых разрядов.

Известно, что у новорожденных животных ГАМК обладает необычным деполяризующим действием, что связано с относительно высокой концентрацией ионов хлора во внутриклеточной жидкости клеток новорожденных животных. Деполяризующее действие ГАМК рассматривается, как одна из основных причин генерации спонтанных осцилляций в гиппокампе новорожденных животных - гигантских деполяризационных потенциалов (Ben-Ari et al., 1989; Ben-Ari, 2005; Ben-Ari et al., 2007). В гиппокампе новорожденных животных блокировка ГАМКергической передачи может привести к исчезновению гигантских деполяризационных потенциалов, откуда и следует, что возбуждающее действие ГАМК - основное условие генерации гигантских потенциалов (Ben-Ari et al., 1989). Однако, в энторинальной коре крыс возрастом Р5-7 блокировка ГАМК А рецепторов пикротоксином приводила к развитию гиперактивности: короткие сетевые разряды по амплитуде в десятки раз превосходящие разряды в контроле (фокальная экстраклеточная регистрация, 4 среза). Отсюда следует, что уже на 5-й - 7-й день жизни ГАМК частично выполняет свои тормозные функции в энторинальной коре.

С другой стороны, действие блокаторов быстрой глутаматной синаптической передачи (АМПА/каинатные и НМДА рецепторы) на срез приводило к исчезновению спонтанной активности (3 среза), в том числе, в условиях дополнительно повышенной возбудимости среза за счет увеличения концентрации экстраклеточного калия (13 срезов). Следовательно, глутаматергическая система необходима для генерации спонтанной активности в энторинальной коре новорожденных животных.

Собственная активность нейронов в энторинальной коре

В большинстве работ на срезах коры и гиппокампа изучались, главным образом, синаптические механизмы генерации спонтанной активности и соответствующие возрастные особенности синаптической передачи (Ben-Ari et al. 1989; Bolea et al. 1999; Gaiarsa et al. 1991; Hollrigel et al. 1998; Khazipov et al. 2001; Lamsa et al. 2000; Allene et al., 2008). Например, было показано, что у эмбриональных и новорожденных животных глицин и ГАМК обладают необычным деполяризующим действием (Ben-Ari et al. 1989; Ben-Ari, 2002; Ben-Ari et al., 2007). При этом электрофизиологические свойства созревающих нейронов и их роль в генерации спонтанной сетевой активности остаются практически не исследованными. Однако, было высказано предположение, что паттерн спонтанной активности в гиппокампе новорожденных животных может зависеть от собственной пачечной активности пирамидных нейронов поля СА3 (Sipila et al., 2005, 2006; Safiulina et al., 2008; Sipila and Kaila, 2008). В связи с этим, мы исследовали собственные свойства пирамидных нейронов в третьем слое энторинальной коры у новорожденных животных. Из литературы известно, что у взрослых крыс ни один тип нейронов в энторинальной коре собственной пачечной активностью не обладает (Jones and Biihl, 1993; Gloveli et al., 1997a; Frank et al., 2001; Egorov et al., 2002b; Hamam et al., 2002; Tahvildari and Alonso, 2005; Cunningham et al., 2006; Kumar and Buckmaster, 2006).

Рис. 2. Основные типы собственной активности пирамидных нейронов III слоя энторинальной коры новорожденных крыс. А) длинные пачки спайков; Б) регулярная спайковая активность; В) короткие пачки спайков. Справа распределения мембранного потенциала по времени. Два пика на распределениях для длинных пачек соответствуют активному и неактивному состояниям.

В режиме фиксации тока (patch clamp) при заблокированной быстрой синаптической передаче (пикротоксин 100 мкМ и кинуреновая кислота 2 мМ или CNQX 30 мкМ, APV 60 мкМ) регистрировали активность пирамидных нейронов III слоя энторинальной коры крыс возрастом Р5-7. Мы обнаружили три типа собственной активности клеток (Рис. 2). В обычном перфузионном растворе содержащем 2 мМ Са²⁺ 22 из 88 клеток (25 %) генерировали длительные пачки спайков, 3 клетки из 88 (3 %) генерировали короткие пачки (2-4 спайка) и 63 клетки из 88 (72%) проявляли регулярную спайковую активность. Справа на Рис. 2 показаны распределения мембранного потенциала по времени для пачечной активности обоих типов. Распределения мембранного потенциала по времени для длинных пачек спайков имеют два пика, соответствующие активному и неактивному состояниям.

Рис. 3.

Короткие пачки спайков описаны в литературе на пирамидных нейронах в коре взрослых животных и на пирамидах гиппокампа новорожденных. Согласно литературным данным, генерация коротких пачек происходит за счет активности медленного натриевого NaP и калиевых токов (Sipila et al., 2005). Поэтому, мы подробно исследовали только длинные пачки спайков. Частота появления пачек составляла примерно 2-4 в минуту. Длительность пачек колебалась от 5 до 20 секунд. После терминации пачки спайков мембранный потенциал опускался ниже потенциала в момент инициации пачки, т.е. развивалась гиперполяризация (afterhyperpolarization, AHP).

Влияние экстраклеточного кальция на собственную пачечную активность нейронов

Согласно литературным данным в первую неделю жизни у крыс происходят значительные изменения ионного состава экстраклеточной жидкости (Math and Davrainville, 1979; Jones and Keep, 1988). Это связано с формированием гематоэнцефалического барьера. У новорожденных крыс ионный состав экстраклеточной жидкости близок к составу плазмы крови и, с формированием гематоэнцефалического барьера в первую неделю жизни крыс, ионные составы этих двух жидкостей постепенно расходятся. Особенно сильные изменения претерпевает концентрация экстраклеточного кальция ([Са²⁺]_ex): у новорожденных [Са²⁺]_ex = 2.2 мМ, у крыс в возрасте пяти дней [Са²⁺]_ex = 0.8 мМ (Math and Davrainville, 1979). Физиологичная концентрация [Са²⁺]_ex в экстраклеточной жидкости взрослых крыс составляет примерно 1 мМ, однако, в большинстве работ на срезах мозга взрослых крыс используют перфузионные растворы с концентрацией ионов кальция 1.5-2.5 мМ. Причем в большинстве работ на срезах мозга новорожденных крыс физиологичные изменения ионного состава экстраклеточной жидкости также не учитывают. В связи с этим мы исследовали влияние [Са²⁺]_ex на пачечную активность в энторинальной коре крыс возрастом Р5-Р7.

При использовании перфузионного раствора, содержащего 1 мМ Са²⁺, количество клеток с собственной пачечной активностью значительно увеличилось (Рис. 3). Так, длинные пачки спайков генерировали 53 % клеток, короткие - 24 %, регулярные спайки - 23 %. Таким образом, часть клеток с регулярной спайковой активностью при уменьшении [Са²⁺]_ex с 2 до 1 мМ переходят в группу пачечных. Усиление (появление) пачечной активности при уменьшении экстраклеточного кальция можно объяснить двумя причинами: изменением свойств медленного NaP тока и/или меньшей активностью калиевых кальций-зависимых токов (см. ниже). В целом, можно заключить, что физиологичное снижение [Са²⁺]_ex в первую неделю жизни крыс, связанное с формированием гематоэнцефалического барьера, должно приводить к усилению собственной пачечной активности клеток в энторинальной коре.

Изменение количества пачечных клеток с пятого по тринадцатый день жизни крыс

Поскольку нейроны в третьем слое энторинальной коры взрослых крыс не обладают собственной пачечной активностью, мы выяснили, каким образом меняется процент пачечных клеток в критический период развития с пятого по тринадцатый день жизни (Р5-Р13), поскольку приблизительно к тринадцатому дню жизни у крыс ГАМК становится полностью тормозным медиатором. Перфузионный раствор содержал 1 мМ Са²⁺, т.к. к этому времени физиологичная концентрация ионов кальция в экстраклеточной жидкости опускается приблизительно до 1 мМ. Процент клеток генерирующих длинные пачки спайков составлял 53% (n=49) на Р5-Р7, 81% (n=36) на Р8-Р10 и 29% (n=14) на Р11-Р13. Процент клеток с короткими пачками спайков: 24% (n=22) на Р5-Р7, 5% (n=2) на Р8-Р10 и 0% (n=0) на Р11-Р13 (Рис. 4). Таким образом, к одиннадцатому дню жизни крыс короткие пачки спайков в третьем слое энторинальной коры полностью пропадают. Количество клеток генерирующих длинные пачки спайков достигает максимума на Р8-Р10 и значительно уменьшается на Р11-Р13. Поскольку у взрослых крыс ни один тип нейронов в энторинальной коре не обладает собственной пачечной активностью, можно заключить, что собственная пачечная активность клеток является особенностью развивающейся энторинальной коры у новорожденных животных и может быть вовлечена в процессы созревания нейронов. Помимо этого собственная пачечная активность нейронов может играть важную роль в генерации сетевой активности. энторинальный пейсмекерный нейрон

Рис. 4. Изменение количества пачечных клеток с возрастом крыс. К одиннадцатому дню жизни крыс короткие пачки спайков в третьем слое энторинальной коры полностью пропадают. Количество клеток генерирующих длинные пачки спайков достигает максимума на Р8-Р10 и значительно уменьшается на Р11-Р13. У взрослых крыс нейроны третьего слоя энторинальной коры собственной пачечной активностью не обладают.

Помимо изменения процента пачечных клеток, происходили изменения паттерна собственной активности нейронов. С возрастом достоверно увеличивалась частоты следования длинных пачек спайков (P5-7: 2.9±1.2 n/мин vs. P8-10: 6.4±3.5 n/мин; p < 0.005), что, видимо, связано с уменьшением длительности AHP. Помимо этого происходило уменьшение длительности пачек (P5-7: 9.9±6.5 сек vs. P8-10: 2.9±1.4 сек; p < 0.005) и увеличение частоты спайков в пачках (P5-7: 4.7±1.7 Гц vs. P8-10: 10.9±6 Гц; p < 0.005). Достоверное уменьшение входного сопротивления с возрастом, очевидно, связано с ростом нейронов (P5-7: 1.2 ± 0.3 ГОм vs. P8-10: 0.6 ± 0.1 ГОм; p < 0.005 vs. P11-13: 0.4 ± 0.06; p < 0.005). Таким образом, быстрые (в течение нескольких дней) изменения паттерна собственной пачечной активности отражают созревание нейронов в энторинальной коре новорожденных крыс.

Плато потенциала пачечных нейронов

В ответ на короткий деполяризующий импульс тока (0.2-1 сек, 5-10 пА) длиннопачечные нейроны генерировали плато потенциала (ПП), длительностью до 10 сек (Рис. 5). Часто для инициации ПП требовался импульс тока определенной силы и длительности, при уменьшении которых инициации ПП не происходило. Так же как и в случае пачек, после терминации ПП развивалась гиперполяризация (AHP). Параметры плато потенциала сопоставимы с параметрами пачек спайков, что свидетельствует о сходстве механизмов генерации пачек и плато. С увеличением возраста крыс происходило достоверное уменьшение длительности плато потенциала (P5-7: 4.8 ± 1.8 сек vs. P8-10: 2.8 ± 1.7 сек; p < 0.05) и увеличение частоты спайков (P5-7: 4.4 ± 1.3 Гц vs. P8-10: 14.8 ± 10.6 Гц; p < 0.01) на плато, что также коррелирует с возрастными изменениями параметров пачек спайков.

Импульс тока непосредственно после (5-10 сек) терминации ПП не приводил к генерации повторного ПП, т.е. развивалась рефрактерность, предположительно, обусловленная AHP (Рис. 5). Генерация ПП происходила потенциал-зависимым образом. Уменьшение МП примерно до -70 мВ приводило к исчезновению ПП (Рис. 5). Аналогично пачкам, увеличение концентрации Ca²⁺ в перфузионном растворе с 1 до 2 мМ приводило либо к исчезновению, либо к уменьшению длительности ПП (Рис. 5).

Рис. 5. Плато потенциала пачечных нейронов. А) Спонтанная пачечная активность; Б) та же клетка в ответ на короткий деполяризующий импульс тока генерирует плато потенциал-зависимым образом; В) рефрактерность плато потенциала, предположительно, обусловленная AHP; Г) исчезновение плато при увеличении [Ca²⁺]_ex c 1 до 2 мМ.

Плато потенциала можно было вызвать не только внутриклеточным импульсом тока, но и синаптической стимуляцией. Последнее показывает, что нейроны, генерирующие длинные пачки спайков способны не только инициировать, но и усиливать сетевую активность. Помимо этого, очевидно, что нейроны, способные генерировать пачки спайков, после которых развивается длительный рефрактерный период, могут навязывать свой паттерн активности окружающим клеткам. Например, именно таким образом происходит при генерации спонтанной активности в сетчатке глаз у эмбриональных и новорожденных животных (Zheng et al., 2006).

Ионные механизмы генерации пачек спайков

Для исследования ионных механизмов генерации длинных пачек спайков использовали ряд фармакологических блокаторов. Неспецифический блокатор кальциевых токов кадмий Cd²⁺, блокатор L кальциевых каналов нифедипин и внутриклеточный кальциевый хелатор BAPTA оказывали на длинные пачки спайков схожее действие: значительно сокращали длину пачек. Таким образом, можно заключить, что генерация длинных пачек зависит от внутриклеточного кальция, причем вход ионов кальция в клетку, как минимум частично, происходит через L каналы. Поскольку действие BAPTA совпадало с действием блокаторов, можно предположить, что опосредованно блокировались и кальций-зависимые токи.

Катионный неспецифический кальций-зависимый CAN ток часто лежит в основе способности клеток генерировать пачки спайков (Bal and McCormick, 1993; Beurrier et al., 1999; Del Negro et al., 2005; Derjean et al., 2005; Hughes et al., 2002; Pace et al., 2007; Zhu et al., 2004). В ряде случаев, пачечные нейроны способны генерировать ADP (afterdepolarization) или длительное плато потенциала, также обусловленные активностью CAN тока (Bal and McCormick, 1993; Beurrier et al., 1999; Derjean et al., 2005). Согласно работе (Shiller, 2004), активация CAN тока пирамидных нейронов может приводить к развитию судорожной активности на срезах коры мозга взрослых животных, и при этом нейроны также генерируют длительное плато потенциала. Хорошо известно, что CAN ток в нейронах энторинальной коры взрослых животных активируется в условиях метаботропной стимуляции, обычно, в присутствии в перфузионном растворе агонистов мускариновых или метаботропных глутаматных рецепторов, что приводит к способности нейронов генерировать плато потенциала (Andrade, 1991; Fraser and MacVicar, 1996; Congar et al., 1997; Haj-Dahmane and Andrade, 1998) и плато потенциала с несколькими уровнями активности (graded persistent activity, Egorov et al., 2002). По этим причинам, мы исследовали действие блокатора CAN тока (флуфенамовая кислота) на длинные пачки спайков и плато потенциала. Флуфенамовая кислота в концентрации 50 мкМ блокировала длительные пачки спайков (n=7). Очевидно, что кальций-зависимый CAN ток опосредованно блокировался и в экспериментах с Cd²⁺, нифедипином и BAPTA. Аналогично пачкам спайков, флуфенамовая кислота блокирована и вызванное плато потенциала (n=5). Плато потенциала также блокировалось действием BAPTA (n=8). Таким образом, у новорожденных животных CAN ток в нейронах третьего слоя энторинальной коры активен в контроле, т.е. без дополнительной метаботропной стимуляции, что приводит к генерации клетками длинных пачек спайков.

Помимо CAN тока, медленный натриевый NaP ток также часто определяет способность пирамидных клеток коры генерировать пачки спайков, ADP и повышает возбудимость мембраны (Agrawal et al., 2001; Su et al., 2001; Traub et al., 2003; Yue et al., 2005), в том числе, у новорожденных животных (Sipila et al., 2006). В связи с этим, мы исследовали действие рилузола (блокатор NaP тока) на длинные пачки спайков и плато потенциала. Рилузол в концентрации 5-10 мкМ сильно подавлял пачечную активность. Частота спайков в пачках достоверно уменьшалась с 3.9 ± 2 Гц в контроле до 1.9 ± 0.9 Гц в присутствии рилузола (n=7, p < 0.02). Рилузол также подавлял и плато потенциала у пачечных нейронов, видимо, за счет снижения спайковой активности клетки (n=4). Таким образом, CAN и NaP токи - основные деполяризующие ионные проводимости при генерации пачек спайков и плато потенциала в энторинальной коре новорожденных крыс.

При терминации пачек развивалась AHP, следовательно, можно предположить, что терминация пачек происходит за счет активации одного или нескольких гиперполяризующих калиевых токов. Тетраэтиламмоний (TEA) в концентрации 1 мМ (блокатор кальций-зависимых калиевых BK каналов) приводил к увеличению длительности, амплитуды пачек спайков и количества спайков в пачках (n=4), что свидетельствует об участии BK каналов в терминации пачек. Аналогичным образом тетраэтиламмоний действовал на вызванное плато потенциала (n=3). Т.к. терминация пачек и плато потенциала все-таки происходила при блокированных BK каналах, можно предположить, что помимо BK каналов, активны также и другие калиевые каналы, например М-каналы. Таким образом, генерация длинных пачек спайков происходит при последовательной активации деполяризующих (CAN и NaP) и гиперполяризующих калиевых (BK) токов.

Математическое моделирование пачечной активности

Для моделирования пачечной активности использовали программу NEURON (Hines and Carnevale, 1997), в которой построили простейшую модель нейрона: сома клетки с набором ионных токов. В модель были включены быстрые натриевый и калиевый токи, калиевый кальций-зависимый ток, калиевый М ток, кальциевый L ток, CAN и NaP ток. Уравнения для каждого ионного тока были взяты из литературы. Подробное описание модели приведено в тексте диссертации. Основной смысл любого моделирования - дополнить и объяснить экспериментальные результаты. Согласно нашим данным при уменьшении концентрации экстраклеточного кальция [Са²⁺]_ex с 2 до 1 мМ часть клеток исходно с регулярной спайковой активностью начинает генерировать пачки. Однако, мы выяснили, что генерация пачек прямым образом зависит от входа кальция в клетку и, таким образом, происходить должно прямо противоположное, т.е. ослабление пачечной активности с уменьшением [Са²⁺]_ex с 2 до 1 мМ. Разрешить противоречие удалось с помощью построенной модели и литературных данных (Yue et al., 2005).

Рис. 6. Усиление собственной пачечной активности при уменьшении концентрации экстраклеточного кальция можно объяснить усилением медленного натриевого NaP тока: модель. Слева: ослабление пачечной активности при уменьшении [Са²⁺]_ex с 2 до 1 мМ. Здесь зависимость NaP тока от [Са²⁺]_ex в модель НЕ включена. В данном случае эффект объясняется ослаблением кальциевого и кальций-зависимых токов. Справа: зависимость NaP тока от [Са²⁺]_ex в модель включена. Исходно регулярная спайковая активность при уменьшении [Са²⁺]_ex с 2 до 1 мМ трансформируется в пачечную. Таким образом, моделирование пачечной активности подтверждает предположение о том, что усиление/появление собственной пачечной активности при уменьшении [Са²⁺]_ex можно объяснить свойствами медленного натриевого NaP тока.

Модельный кальциевый ток задавался следующим уравнением:

I_HVA = g_HVA (V - E_Ca).

Потенциал реверсии для кальция E_Ca рассчитывался по формуле Нернста:

E_Ca = 12.5 ln([Ca²⁺]_ex / [Ca²⁺]_in),

где [Ca²⁺]_ex - экстраклеточная концентрации ионов кальция. [Ca²⁺]_ex задавалась как константа - 2 или 1 мМ. Исходно именно таким образом в модель вводилась зависимость от экстраклеточного кальция. Как и предполагалось, модельное уменьшение [Ca²⁺]_ex с 2 до 1 мМ приводило к ослаблению модельной пачечной активности (Рис. 6). В данном случае эффект объясняется ослаблением кальциевого тока. Для того, чтобы уменьшение [Ca²⁺]_ex могло вызывать усиление или появление пачек спайков, должен быть еще какой-то кальций-зависимый механизм, действующий обратным образом. Согласно литературным данным (Yue et al., 2005), таким механизмом может быть влияние экстраклеточного кальция на натриевые токи.

Известно, что дивалентные катионы в экстраклеточной жидкости уменьшают поверхностный потенциал мембраны, что приводит к сдвигу I/V зависимости (I - ток, V - мембранный потенциал) натриевых токов к более низким значениям (McLaughlin et al., 1971). Другими словами, чем больше в экстраклеточной жидкости дивалентных катионов, например катионов кальция, тем менее активны натриевые токи, в частности NaP ток и наоборот. Это означает, что медленный натриевый NaP ток не является кальций-зависимым в обычном смысле, т.е. не зависит от внутриклеточного кальция, однако, на активность NaP тока влияют дивалентные катионы кальция в экстраклеточной жидкости. Согласно работе (Yue et al., 2005) зависимость проводимости NaP каналов от мембранного потенциала V при разных концентрациях экстраклеточного кальция можно представить в виде функций Больцмана:

G(V) = G_max/ (1+exp[(V₅₀ - V)/7]),

где G(V) - проводимость, V₅₀ = -50 мВ для [Ca²⁺]_ex = 2 мМ; V₅₀ = -56 мВ для [Ca²⁺]_ex = 1 мМ (с небольшими изменениями). Иначе говоря, в диапазоне потенциалов покоя (от -70 до -60 мВ) при снижении концентрации [Ca²⁺]_ex с 2 до 1 мМ медленный NaP ток усилится примерно в 2 раза. Здесь модельная зависимость NaP тока от экстраклеточного кальция вводится через параметр V₅₀. При включении в модель этого нового механизма, модельное уменьшение [Ca²⁺]_ex с 2 до 1 мМ приводило к усилению или появлению пачек спайков (Рис. 6). Таким образом, мы показали, что усиление пачечной активности при уменьшении [Ca²⁺]_ex объясняется свойствами NaP тока.

Выводы

1. Энторинальная кора новорожденных животных способна генерировать спонтанную активность независимо от гиппокампа и других структур мозга.

2. Спонтанная активность представлена короткими и длинными сетевыми разрядами, генерация которых происходит за счет активации как ГАМК-, так и глутаматергических синапсов.

3. Уже на пятый день жизни ГАМК частично выполняет тормозную функцию, поскольку блокировка ГАМК А рецепторов трансформирует спонтанную активность энторинальной коры в судорожную активность.

4. Для генерации спонтанной активности в энторинальной коре новорожденных животных необходима глутаматергическая система, поскольку блокировка АМПА/каинатных и НМДА рецепторов приводит к исчезновению активности, в том числе при повышенной возбудимости среза.

5. Пирамидные нейроны в третьем слое энторинальной коры у новорожденных животных обладают собственной пачечной активностью. У взрослых животных ни один тип нейронов в энторинальной коре таким свойством не обладает.

6. Собственная пачечная активность нейронов третьего слоя энторинальной коры новорожденных крыс (Р5-Р13) представлена короткими (до 1 сек) и длинными (до 20 сек) пачками спайков. Пачечные свойства клеток быстро меняются с возрастом, что отражает созревание нейронов. Короткие пачки спайков полностью пропадают к десятому дню жизни, а количество клеток генерирующих длинные пачки достигает максимума на Р8-Р10 и затем значительно уменьшается.

7. В ответ на короткий деполяризующий импульс тока длиннопачечные нейроны генерируют плато потенциала, длительностью до 10 сек, т.е. пачку спайков можно “включить” искусственной внутриклеточной деполяризацией.

8. Генерация пачек спайков и плато потенциала происходит при активации неспецифического катионного кальций-зависимого CAN и медленного натриевого NaP токов. Терминация пачек спайков и плато потенциала обусловлена активацией калиевых токов.

9. Количество пачечных клеток значительно увеличивается при уменьшении концентрации экстраклеточного кальция. Модельные исследования показывают, что это можно объяснить свойствами медленного натриевого тока.

Публикации по теме диссертации

Статьи:

1. Шерозия М.Г., Егоров А.В. Влияние экстраклеточного кальция на пачечную активность нейронов в энторинальной коре новорожденных крыс: компьютерное моделирование. Журн. высш. нерв. деят. 2008. Т. 58. № 5. С. 517-520.

2. Sheroziya M.G., von Bohlen und Halbach O., Unsicker K., Egorov A.V. Spontaneous bursting activity in the developing entorhinal cortex. J. Neurosci. 2009. V. 29. № 39. P. 12131-12144.

3. Шерозия М.Г., Егоров А.В. Спонтанная активность в развивающихся нейронных сетях. Журн. высш. нерв. деят. 2010 (принято в печать).

Список публикаций автора

4. Шерозия М.Г., Лемак М.С., Алтынбаев Р.Ш., Эзрохи В.Л. Глутамат и ГАМК являются медиаторами в синапсах мшистых волокон гиппокампа новорожденных крыс. ДАН. 2005. № 402. с. 195-196.

Тезисы конференций:

1. Алтынбаев Р.Ш., Хахалин А.С., Шерозия М.Г., Воронин Л.Л. (2004). "Молчащие синапсы: роль в синаптической пластичности". Рос. физиол. журн. им. Сеченова, Т. 90, № 8, С. 228. (Материалы 19 съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Екатеринбург).

2. Лемак М.С., Шерозия М.Г., Воронин Л.Л. Феномены синаптогенеза и долговременной потенциации: общие подходы. Рос. физиол. журн. им. Сеченова, Екатеринбург, 19-24 сентября 2004, т. 90(8), стр.231-232. (Материалы 19 съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Екатеринбург).

3. Шерозия М.Г. Синапсы мшистых волокон в гиппокампе неонатальных крыс наряду с глутаматом высвобождают ГАМК. Научная конференция молодых учёных, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, 6 октября 2004, стр. 31.

4. Шерозия М.Г. Развитие свойства бистабильности нейронов энторинальной коры в процессе онтогенеза. Научная конференция молодых учёных, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, 12-13 октября 2005, стр. 39-40.

5. Sheroziya M.G., von Bohlen und Halbach O., Unsicker K. and Egorov A.V. Flufenamic acid blocks the generation of giant depolarizing potentials in developing entorhinal cortex. Soc. Neurosci. Abstr. (2006) 42.1 (Abstract).

6. Шерозия М.Г., Балабан П.М., Егоров А.В. Спонтанные осцилляции в энторинальной коре новорожденных крыс. Рос. физиол. журн. им. Сеченова, Москва, 3-8 июня 2007 (Материалы 20 съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Москва).

7. Sheroziya M.G., von Bohlen und Halbach O., Unsicker K., Egorov A.V. Prolonged intrinsic bursting activity of pyramidal neurons underlies the spontaneous oscillatory activity in the developing entorhinal cortex. Soc. Neurosci. Abstr. (2007) 587.2 (Abstract).

8. Шерозия М.Г. Спонтанная пачечная активность нейронов в энторинальной коре новорожденных крыс. Научная конференция молодых учёных, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, 8-9 октября 2008, стр. 28.

9. Egorov A.V., Unsicker K., Sheroziya M.G. Prolonged intrinsic bursting activity in immature medial entorhinal cortex layer III neurons: experimental and modeling study. Soc. Neurosci. Abstr. (2009) 42.10/D18 (Abstract).

Размещено на Allbest.ru