Влияние окислительного стресса in vitro на показатели сыворотки крови и эритроцитов представителей Amphibia, Aves и Mammalia

Размещено на http://www.allbest.ru

ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА IN VITRO НА ПОКАЗАТЕЛИ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ЭРИТРОЦИТОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ AMPHIBIA, AVES И MAMMALIA

Никольская В.А.,

кандидат биологических наук,

Черетаев И.В.,

кандидат биологических наук,

Крымский федеральный университет

им. В.И. Вернадского

Аннотация

Статья посвящена изучению влияния окислительного стресса, инициированного средой Фентона, на биохимические показатели cыворотки крови и эритроцитов Rana ridibunda, Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus. По сравнению с исходным состоянием при окислительном стрессе наблюдается увеличение суммарного содержания молекул средней массы в сыворотке крови всех трёх представителей, а также увеличение молекул средней массы и значительный расход АТФ в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus.

Ключевые слова: сыворотка крови, эритроциты, Amphibia, Aves, Mammalia.

окислительный биохимический сыворотка кровь эритроциты

Abstract

The article is devoted study the influence of oxidative stress, initiated by the Fenton medium, on biochemical parameters of blood serum and erythrocytes of Rana ridibunda, Gallus Gallus domesticus and Sus scrofa domesticus. In comparison with the initial state under oxidative stress, there is an increase of the total content of average weight molecules in blood serum of all three members, and the increase in the average molecular weight and the considerable expense of ATP in the erythrocytes hemolysate of Gallus Gallus domesticus and Sus scrofa domesticus.

Keywords: blood serum, erythrocytes, Amphibia, Aves, Mammalia.

Структурно-функциональные изменения в организме, возникшие в процессе эволюции, отражаются как на клеточном, так на субклеточном уровне, а конечный этап адаптационных изменений приводит к усилению полученных модификаций [1]. Можно предположить, что и реакция на окислительный стресс представителей разных классов существенным образом отличается. Поэтому, несомненный интерес с точки зрения эволюции представляет анализ изменений биохимических показателей представителей разных таксонов в условиях окислительного стресса, инициированного средой Фентона.

Актуальность данного исследования основывается на данных [2], позволяющих считать уровень молекул средней массы не только показателем интенсивности процессов свободнорадикального окисления, но и в целом функционального состояния организма в стрессорных условиях. Это, наряду с данными об АТФ как показателе энергетических затрат в важнейших клеточных метаболических процессах [3], предоставляет возможность использовать данные показатели для выявления биохимических и физиологических особенностей реакции организма различных животных на окислительный стресс.

Таким образом, целью исследования явилось изучение воздействия модели окислительного стресса (среды Фентона) на уровень молекул средней массы и АТФ в сыворотке крови и эритроцитах представителей Amphibia, Aves и Mammalia.

Материалы и методы. В качестве материала для исследований использовали сыворотку и гемолизат эритроцитов крови лягушки озёрной (Rana ridibunda), курицы (Gallus gallus domesticus) и свиньи (Sus scrofadomesticus). Эти виды животных выбраны для изучения, так как являются типичными представителями классов земноводных (Amphibia), птиц (Aves) и млекопитающих (Mammalia), соответственно.

Забор крови у животных проводили в 9.00 утра из сонной артерии.

Сыворотку крови получали центрифугированием крови при 3000 об/мин. в течение 15 минут, отделяя полученный супернатант.

Гемолизат эритроцитов крови получали по методу Д. Драбкина [4].

Сыворотку и гемолизат эритроцитов крови указанных представителей земноводных, птиц и млекопитающих анализировали на содержание молекул средней массы (МСМ) до (в исходном состоянии) и после 15 минутной инкубации в среде Фентона, содержащей 10 мМ FеSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂.

Уровень МСМ определяли при длинах волн 254, 272 и 280 нм на спектрофотометре по методу Н.И. Габриэлян и др. [5] и рассчитывали их суммарное содержание при трёх длинах волн регистрации. Аденозинтрифосфат в гемолизате эритроцитов определяли путём гидролиза в кислой среде по Т.А. Алейникову и Г.В. Рубцовой [6].

Условия окислительного стресса моделировали, используя среду Фентона, содержащую раствор 10 мМ сернокислого железа и 0,3 мМ перекиси водорода [7]. Инкубацию осуществляли в течение 15 минут. Среда Фентона является источником свободных радикалов кислорода по реакции:

Fe²⁺ + H₂O₂ > Fe³⁺ + ОН* + ОН- (1)

ОН* + H₂O₂ > H₂O + Н⁺ + О₂- ^* (2)

Результаты исследования и их обсуждение.

Представляло несомненный интерес оценить уровень МСМ в сыворотке крови, подвергнутой воздействию окислительного стресса, инициированного средой Фентона, у представителей разных классов. Результаты исследования представлены в таб. 1.

Таблица 1 - Суммарное содержание молекул средней массы при трёх длинах волн регистрации (254, 272 и 280 нм) в сыворотке крови лягушки озёрной, курицы и свиньи до и после инкубации в среде Фентона, ед. опт. плотности (Мm)

** - достоверные изменения показателя после воздействия среды Фентона по сравнению с исходным состоянием (p?0,01).

До инкубации в среде Фентона наименьшее суммарное содержание МСМ отмечено в сыворотке крови Rana ridibunda, а наибольшее - в сыворотке крови Gallus gallus domesticus. Это может быть обусловлено низкой скоростью обмена веществ, и, следовательно, регуляторных процессов в организме холоднокровных животных. В работах [8, 9] приведены аргументы, указывающие на регуляторные функции молекул средней массы. При этом состав МСМ включает в себя целый ряд классов химических веществ. Так же необходимо отметить, что при посредстве отдельных фракций МСМ происходит ингибирование таких метаболических путей как гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, а также нарушение ряда важнейших для животных физиологических и биохимических процессов (синтез гемоглобина и нуклеиновых кислот, тканевое дыхание и мембранный транспорт, эритропоэз, фагоцитоз, микроциркуляцию) [8, 9]. На основании указанного, можно сделать предположение о том, что представления об усилении роли МСМ как в антиоксидантной защите организма, так и в регуляции вышеуказанных метаболических путей с ростом уровня организации может являться основой для объяснения изначальных различий уровня их содержания среди указанных видов животных.

После инкубации в среде Фентона суммарное содержание МСМ при всех длинах волн регистрации в сыворотке крови изучаемых представителей позвоночных достоверно повышалось (р?0,01) по сравнению с исходным состоянием (до инкубации).

Таким образом, можно вести речь о выраженном ответе организма на окислительный стресс, что выражается в повышении содержания/концентрации МСМ в целом ряде случаев. Это касается роли исследуемых соединений как в качестве маркеров, свидетельствующих о состоянии широкого спектра метаболических процессов [11, 12], так и в качестве самостоятельных регуляторных соединений. Несомненно, что в качестве возможных регуляторных соединений МСМ могут оказывать влияние на интенсивность и направленность оксидативных процессов, что, тем не менее, не уменьшает их значимости в качестве индикаторов разнонаправленных изменений физиолого-биохимических процессов в организме, в том числе - патологических [9, 13]. По мнению ряда авторов [14, 15], будучи продуктами белкового распада, ряд МСМ вызывают разбалансировку физиологических процессов, действуя как вторичные эндотоксины в случае превышения уровня, соответствующего физиологической норме. Например, накопление веществ, относимых ко вторичным эндотоксинам наблюдается при активации процессов свободнорадикального окисления, которые активируются при подавляющем большинстве стрессовых состояний. Так, по мнению Карякина Е.В. и Белова С.В. среднемолекулярные олигопептиды могут служить надёжным маркером, отражающим на биохимическом уровне состояние патологического белкового обмена. С другой стороны, в работе [2] для среднемолекулярных пептидов показана антиоксидантная функция.

Вызывают интерес результаты, полученные при изучении уровня молекул средней массы в гемолизате эритроцитов представителей разных классов (таб. 2).

Таблица 2 - Суммарное содержание молекул средней массы при трёх длинах волн регистрации (254, 272 и 280 нм) в гемолизате эритроцитов лягушки озёрной, курицы и свиньи до и после инкубации в среде Фентона, ед. опт. плотности (Мm)

** - достоверные изменения показателя после воздействия среды Фентона по сравнению с исходным состоянием (p<0,01).

Так, выявлено, что суммарное содержание МСМ в гемолизате эритроцитов Rana ridibunda и Gallus gallus domesticus в исходном состоянии превышает данный показатель Sus scrofa практически в 2 раза. Возможно, это связано с тем, что у представителей Amphibia и Aves сохраняется ядро с полностью или частично функционирующим синтетическим аппаратом в эритроцитах, в то время как у представителя класса Mammalia зрелые эритроциты представляют собой постклеточные структуры.

После инкубации наблюдается достоверное (p<0,01) повышение суммарного содержания МСМ в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus и снижение - у Rana ridibunda. Можно предположить, что такого рода изменения изученных показателей связаны с тем, что в организме с более высоким уровнем организации увеличивается специализация клеточных структур, в том числе и эритроцитов крови, снижается диапазон их возможной адаптации и уменьшается их устойчивость к стрессорным воздействиям [17, 18].

Переход к иному уровню организации, сопровождающийся повышением метаболических показателей, с высокой вероятность будет сопровождаться ростом значимости выявленных изменений, поскольку увеличение количества веществ, обладающих регуляторной активностью, влечёт за собой рост гибкости и общего потенциала регуляторной системы, в том числе при изменениях стрессорного характера.

В исходном состоянии (до инкубации в среде Фентона) наименьшее суммарное содержание АТФ отмечено в гемолизате эритроцитов крови Rana ridibunda, а наибольшее - у Gallus gallus domesticus (таб. 3). По-видимому, изначально высокий уровень АТФ в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus обусловлен высокой потребностью в запасании энергии, необходимой для нормального протекания быстрых метаболических процессов у птиц в покое и, особенно, в условиях полёта, при котором происходит интенсификация химических реакций, связанных с дыханием, в частности процессов окислительного фосфорилирования. Более высокое содержание АТФ в гемолизате эритроцитов Sus scrofa domesticus по сравнению с Rana ridibunda также можно объяснить высокой потребностью в накоплении энергии у теплокровных животных в связи с ускоренными процессами метаболизма.

Таблица 3 - Содержание АТФ в гемолизате эритроцитов (мг%) лягушки озёрной, курицы и свиньи до и после инкубации в среде Фентона, ед. опт. пл. (М±m)

** - достоверные изменения содержания АТФ в гемолизате эритроцитов при воздействии среды Фентона по сравнению с исходным состоянием (p?0,01).

После инкубации в среде Фентона в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus и Sus scrofadomesticus наблюдается достоверное снижение (p?0,01) содержания АТФ, а в гемолизате эритроцитов Rana ridibunda отмечена тенденция к увеличению данного показателя. Возможно, что у Rana ridibunda в условиях окислительного стресса при воздействии АФК происходит компенсаторное вовлечение макроэргических соединений, в частности АТФ, в поддержание резервных возможностей мембраны эритроцитов лягушки [19], однако, расходуемый АТФ может восстанавливаться за счёт существующих механизмов синтеза этого метаболита до исходного уровня. Следовательно, мембрана эритроцитов лягушки в большей степени подвергается воздействию АФК, поскольку подвижность липидной фазы представляет собой совокупность характеристик, одной из которых согласно [20] является включение ненасыщенных жирных кислот - биомишеней для АФК. В частности, полиненасыщенные жирные кислоты мембран, богатая кислородом окружающая среда, а также гемоглобин делают эритроциты восприимчивыми к перекисному повреждению АФК, например, супероксидным анион-радикалом, который может генерироваться клетками как эндогенно, так и из экзогенных источников. Также АФК способны непосредственно взаимодействовать с мембраной эритроцитов и вызывать нарушения как липидного бислоя, так и в структуре мембранных белков. Однако синтез АТФ в ядерной мембране эритроцитов Rana ridibunda компенсирует его затраты на сохранение резервных возможностей клеточной мембраны эритроцитов в условиях окислительного стресса.

Сходные процессы по поддержанию резервных возможностей мембраны за счёт энергии АТФ могут происходить и в эритроцитах Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus, поскольку данные о снижении осмотической стойкости эритроцитов в ряду земноводные - птицы - человек свидетельствуют об увеличении необходимости таких затрат [17]. В эритроцитах Sus scrofadomesticus отсутствие митохондрий делает невозможным дополнительный синтез АТФ. Поэтому высокая скорость протекания метаболических процессов в мембране эритроцитов теплокровных Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus не позволяет полностью восполнить затраты АТФ на сохранение её резервных возможностей в условиях окислительного стресса несмотря на то, что в молодых эритроцитах птиц присутствуют митохондрии и активно протекают процессы окислительного фосфорилирования [21].

Выводы

1. До инкубации в среде Фентона в сыворотке крови Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus отмечено повышенное по сравнению с Rana ridibunda (в 3 раза) суммарное содержание молекул средней массы. После инкубации в среде Фентона суммарное содержание МСМ при всех длинах волн регистрации в сыворотке крови Rana ridibunda, Gallus gallus domesticusи Sus scrofa domesticus достоверно увеличилось (р?0,01) по сравнению с исходным состоянием (до инкубации). Это служит свидетельством протекания неспецифических интоксикационных процессов в сыворотке крови изученных животных в ответ на стрессорное воздействие.

2. Обнаружено, что суммарное содержание МСМ в гемолизате эритроцитов Rana ridibunda и Gallus gallus domesticus в исходном состоянии превысило данный показатель Sus scrofa domesticusпрактически в 2 раза. После инкубации наблюдалось достоверное (p?0,01) повышение суммарного содержания МСМ в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus (на 17,74 %) и Sus scrofadomesticus (на 17 %) и снижение - у Rana ridibunda (на 5,08 %), по сравнению с исходным состоянием. Это показывает, что повышение специалиазации эритроцитов в процессе эволюции делает их менее устойчивыми к стрессорным воздействиям, что проявляется в росте МСМ в гемолизате эритроцитов у Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus - индикатора изменений функционального состояния в условиях стресса.

3. В исходном состоянии (до инкубации в среде Фентона) в гемолизате крови Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus отмечено повышенное по сравнению с Rana ridibundaсодержание АТФ на 65,57 % и 21,31 % соответственно. После инкубации в среде Фентона в гемолизате эритроцитов Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus наблюдалось достоверное снижение (p?0,01) содержания АТФ на 21,78 и 17,57 % соответственно, а в гемолизате эритроцитов Rana ridibunda отмечена тенденция к увеличению данного показателя, по сравнению с исходным состоянием. Это свидетельствует о значительном расходе АТФ эритроцитов Gallus gallus domesticus и Sus scrofa domesticus при окислительном стрессе.

Литература

1. Житенева Л.Д., Макаров Э.В., Рудницкая О.А. Эволюция крови. Ростов-на-Дону, 2001. 104 с.

2. Юдакова О.В., Григорьев Е.В. Интенсивность ПОЛ и АОА, уровень молекул средней массы как показателя эндогенной интоксикации при распространённом перитоните // Клин. лаб. диагн. 2004. № 10. С. 20-22.

3. Черетаев И.В., Коренюк И.И., Хусаинов Д.Р., Гамма Т.В., Колотилова О.И., Ноздрачёв А.Д. АТФ-зависимые и кальциевые механизмы влияния салицилатов на электрические потенциалы нейронов моллюска Helix albescens // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2015. Т. 101, № 3. С. 326-336.

4. Drabkin D. Asimplified technique for large crystallisation of haemoglobin in the enistalline // Fnn N. S. Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-407.

5. Габриэлян Н.И., Левицкий Э.Р., Дмитриев А.А. Скрининговый метод определения средних молекул в биологических жидкостях: метод. рекоменд. М., 1985. 18 с.

6. Алейников Т.А., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биохимии. М.: Высшая школа, 1988. 239 с.

7. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24-26.

8. Бондаренко Т.И., Калмыкова Ю.А., Шустанова Т.А, Михалева И.И. Фармакологическая активность дельта-сон индуцирующего пептида при экспериментальном остром панкреатите // Экспер. клин. фармакол. 2002. Т. 65, № 2. С. 44-48.

9. Никольская В.А., Данильченко Ю.В., Меметова З.Н. Биохимический аспект рассмотрения молекул средней массы в организме // Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». 2013. Т. 26 (65). С. 139-145.

10. Ковалевский А.Н., Нифантьев О.Н. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней массы // Лабораторное дело. 1989. №10. С. 35-39.

11. Абакумова Ю.В., Ардаматский Н.А. Свободнорадикальное окисление при атеросклерозе как патогенный фактор // Медико-биологический вестник им. Я.Д. Витебского. 1996. Т. 21, № 2. С. 15-21.

12. Ермаков В.А. Диагностические возможности использования метода определения уровня среднемолекулярных соединений в практической медицине // Проблемы экспертизы в медицине. 2005. Т. 5, № 17 (1). С. 27-29.

13. Шитов А.Ю. Молекулы средней массы как показатель «гипербарической интоксикации» у водолазов // Альманах клинической медицины. 2013. № 28. С. 48-52.

14. Владыка А.С., Левицкий Э.Р., Поддубная Л.П., Габриэлян Н.И. Средние молекулы и проблема эндогенной интоксикации при критических состояниях различной этиологии // Анестезиол. и реаниматол. 1987. № 2. С. 17-19.

15. Матвеев С.Б., Спиридонова Т.Г., Клычникова Е.В., Николаева Н.Ю., Смирнов С.В., Голиков П.П. Критерии оценки эндогенной интоксикации при ожоговой травме // Клин. лаб. диаг. 2003. № 10. С. 3-6.

16. Карякина Е.В., Белова С.В. Молекулы средней массы как интегральный показатель метаболических нарушений // Клин. лаб. диаг. 2004. № 3. С. 4-8.

17. Липунова Е.А., Скоркина М.Ю. Физиология крови. Белгород: Изд-во БелГУ, 2007. 324 с.

18. Игнатьев В.В., Кидалов В.Н., Хадарцев А.А., Сясин Н.И. Изменение некоторых физиологических функций в эритроцитах человека и млекопитающих по сравнению с эритроцитами других видов животных // Вестник новых медицинских технологий. 2007. Т. 10, № 1. Режим доступа к статье: vnmt.ru/Bulletin/E2007-1/E071.htm

19. Cкоркина М.Ю., Липунова Е.А., Зеленцова А.С. Структурная лабильность эритроцитарных мембран лягушек и регуляторные процессы при адреналиновой нагрузке in vitro // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Естественные науки. 2007. Т. 5, № 5. С. 68-70.

20. Борисова А.Г., Ильина Т.Н., Калинина С.Н., Баишникова И.В., Узенбаева Л.Б., Илюха В.А. О некоторых факторах, влияющих на внутри- и межвидовую гемолитическую устойчивость эритроцитов у млекопитающих // Труды Карельского научного центра РАН. 2009. № 3. С. 20-29.

21. Болотников И.А., Соловьёв Ю.В. Гематология птиц. Л.: Наука, 1980. 116 с.

Размещено на Allbest.ru