Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Зацепина Ольга Георгиевна

Москва 2009 г.

Работа выполнена в , в Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научный консультант

д. б. н. проф. М. Б. Евгеньев

Официальные оппоненты:

д. б. н. проф. Б. А. Маргулис, Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН.

д. б. н. Н. А. Чуриков, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии РАН.

д.б. н. А. М. Сапожников, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится 27-го октября 2009 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан ________________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат химических наук Крицын А. М.

тепловой шок молеклярный

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Повышенная температура или тепловой шок (ТШ) при воздействии на все известные организмы, от бактерии до человека, активирует гены теплового шока (бтш), представляющие собой эффективную защитную систему как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Гены теплового шока кодируют специфические белки (БТШ).

Гены ТШ и их продукты, сразу после открытия в 1974 г., стали объектом пристального исследования. Оказалось, что БТШ индуцируются не только теплом, но и целым рядом других повреждающих факторов как физического, так и химического происхождения.

Система генов ТШ очень быстро реагирует на внешний стимул. Гены ТШ высоко консервативны. Наиболее консервативными являются гены бтш70. Аминокислотные последовательности БТШ70 у человека и E. сoli гомологичны на 50%, а ряд доменов - на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов свидетельствует об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса (Lidquist, 1986; Feder and Hoffman, 1999).

Основная функция БТШ при стрессе - предотвращение агрегации и восстановление нативной третичной структуры денатурированных белков, концентрация которых резко увеличивается при повышении температуры (Fink 1999; Hartl and Hayer, 2002).

Со времени открытия БТШ были подробно исследованы их структура и функции, а также молекулярные механизмы их экспрессии.

Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма в течение длительного времени оставался неисследованным. Наиболее актуальным в этом направлении является изучение молекулярных механизмов адаптации организмов и возможной роли БТШ в этом процессе у разных географических популяций одного и того же вида, а также у близких видов, живущих в условиях, резко отличающихся по средней температуре обитания. Такой подход, впервые предложенный М.Б. Евгеньевым, дает возможность не только исследовать молекулярно-физиологические функции БТШ при стрессе, но и понять их значение в экологии, адаптации и эволюции популяций.

Первые работы такого плана были выполнены в России на различных видах шелкопряда и на девяти видах ящериц, отличающихся по температуре обитания (Шейнкер и др., 1987; Ulmasov et al., 1992). В этих исследованиях были обнаружены различия в уровне синтеза БТШ70 у разных видов, в зависимости от температуры района их обитания. Однако, в то время было неясно, какие механизмы регуляции экспрессии БТШ лежат в основе этих различий.

В частности, не было известно, имеются ли какие-нибудь различия в ответе на ТШ у теплокровных организмов, тысячелетиями проживавших в контрастных по температурному режиму районах (например, пустыни Средней Азии и северные районы России).

Основным механизмом термоустойчивости у пустынных видов ящериц (Ulmasov et al., 1992) и муравьев (Gehring and Wehner, 1995) является, по-видимому, конститутивный синтез БТШ в нормальных условиях, обусловливающий готовность организма пережить резкий подъем температуры. У мух рода Drosophila синтез БТШ70 в норме репрессирован. Было актуально узнать, существует ли взаимосвязь между уровнем индукции БТШ70 и термоустойчивостью у разных видов мух рода Drosophila. Важно было выяснить, какие молекулярные механизмы лежат в основе вариабельности уровня индукции БТШ70, обеспечивающей адаптацию мух и других организмов к различным условиям обитания.

Устройство кластера генов бтш70 у D. melanogaster хорошо изучено, известна также и структура промоторной области генов бтш у этого вида. Было интересно провести сравнительный анализ локуса генов бтш70 у видов Drosophila группы virilis, отделённых от группы melanogaster десятками миллионов лет дивергентной эволюции. Следовало также выяснить, имеются ли различия в устройстве кластера генов бтш70 и внутри самой группы virilis, у контрастных по температуре обитания видов, таких как D. virilis, D. lummei. Такого плана исследования могут прояснить пути эволюции и адаптации у родственных видов, обитающих в разных температурных нишах.

В последние десятилетия накоплено много фактов, говорящих о важной роли мобильных генетических элементов (МЭ) в адаптации и эволюции самых различных видов животных. Однако, возможный вклад МЭ в адаптацию видов к определенным температурным режимам обитания не был изучен. Встраивание МЭ в регуляторную область генов бтш может иметь весьма важные последствия, способные повлиять на тонкие механизмы регуляции и эволюции этой важнейшей адаптационной системы. Соответственно, актуальность изучения закономерностей встраивания МЭ в промоторную область генов бтш и влияние таких встраиваний на термоустойчивость организмов не вызывает сомнения.

Цель работы. Выявление основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания.

Основные задачи исследования

1. Провести анализ кинетики и уровня синтеза БТШ70 в норме и после ТШ у ящериц, резко различающихся по температуре среды обитания.

2. Выявить молекулярные механизмы регуляции экспрессии БТШ70 у изучаемых модельных видов. В частности изучить:

а) число копий бтш70 у сравниваемых видов,

б) регуляцию транскрипции бтш.

3. На примере первичной культуры фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России, изучить возможные различия в термоустойчивости у теплокровных.

4. Провести детальное исследование ответа на ТШ на примере рядов видов и линий Drosophila (D. melanogaster, D. lummei, D. montana, D. texana, D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis), различающихся по температуре экологической ниши обитания. Для этого исследовать:

а) базальную и индуцируемую термоустойчивость,

б) уровень экспрессии БТШ70,

в) паттерн белкового синтеза после ТШ,

г) регуляцию транскрипции бтш.

5. Исследовать механизмы эволюции генов бтш70 у группы видов с хорошо изученной филогенией (на примере группы virilis). Для этого изучить:

а) строение кластера генов бтш70 у D. virilis и D. lummei.

б) клонировать и секвенировать гены бтш70 с фланкирующими последовательностями у изучаемых видов и линий.

6. Оценить вклад других групп БТШ в термоустойчивость организмов.

7. Изучить роль МЭ в адаптации организмов к изменяющимся условиям среды обитания. Для этого на модельной системе исследовать частоту и локализацию внедрения Р элемента в гены бтш70 D. melanogaster, а также описать функциональные последствия таких внедрений.

Научная новизна

1. В ходе исследования на примере нескольких видов ящериц было показано, что основную защитную роль при ТШ у южных видов играет конститутивный синтез БТШ70, отсутствующий у северных видов. Впервые выявлена корреляция между естественными колебаниями температуры в течение дня и уровнем синтеза БТШ70 в клетках животных. Впервые показано, что конститутивный синтез БТШ70 обусловлен особенностями связывания фактора транскрипции ТШ с промотором. Выявлены характерные различия в пороге индукции БТШ и длительности их синтеза, в зависимости от температуры среды обитания сравниваемых видов.

2. Впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных, на примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России.

3. Впервые у видов Drosophila группы virilis изучен паттерн индукции ряда групп БТШ в ответ на различные температурные воздействия. Выявлен преимущественный синтез низкомолекулярных БТШ и БТШ40 у термоустойчивых видов, по сравнению с более термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

3. Методом масс-спектрометрии достоверно определены основные члены семейства БТШ70 у видов группы virilis.

4. Впервые обнаружены различия в числе генов бтш70 у разных линий и видов данной группы.

5. Подробно изучена структура кластера генов бтш70 у группы видов virilis; предложена модель, объясняющая эволюцию этого кластера в роде Drosophila.

6. На примере видов Drosophila показаны сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Впервые выявлено встраивание МЭ Jockey в промоторную область терморезистентной линии D. melanogaster (ТТ), способной размножаться при повышенной температуре (32єС). Показано снижение экспрессии генов бтш70 и изменение паттерна синтеза БТШ в этой линии.

7. На модельной системе, разработанной для D. melanogaster, методом направленного Р-мутагенеза выявлено специфическое встраивание конструкции на основе Р элемента исключительно в промоторную область генов бтш70. Найдены горячие точки встраивания.

Положения, выносимые на защиту

1. Адаптационная эволюция ответа организма на стрессирующее воздействие окружающей среды может существенно различаться в зависимости от вида и/или группы организмов.

2. Важную роль в термоустойчивости организмов играет БТШ70.

3. Пластичность индукции БТШ в значительной степени определяется фактором теплового шока (HSF). Как правило, у пустынных теплолюбивых видов температурный порог индукции белков теплового шока выше, чем у видов средней полосы.

4. Терморезистентные виды при физиологически нормальной температуре часто характеризуются наличием определенного базального уровня БТШ70 в клетках.

5. Базальный уровень синтеза БТШ может быть обусловлен свойствами HSF и промотора генов бтш.

7. В большинстве случаев адаптация организма к гипертермии достигается без изменения числа генов теплового шока, хотя у некоторых видов вариабельность в числе генов в популяции может иметь адаптивный характер.

8. Низкомолекулярные БТШ вносят существенный вклад в термоустойчивость организмов.

9. Мобильные элементы играют важную роль в регуляции активности и эволюции генов теплового шока.

Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты важны для понимания механизмов адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. В условиях глобального изменения климата и загрязнения окружающей среды, эти знания могут быть полезными для сохранения вымирающих видов. Полученные данные представляют ценность для создания практически важных трансгенных животных и растений, способных жить и размножаться в экстремальных условиях внешней среды.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (29 июня - 5 июля 2003 г., Санкт-Петербург - Москва); 11-й Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» в сессии «Молекулярные и клеточные аспекты биологии стресса» (6 - 10 октября 2003 г., Санкт-Петербург); 1-м Международном Конгрессе по роли ответа на стресс в биологии и медицине (Квебек, Канада, 2003 г.); на международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Ереван, 8 - 11 сентября 2005 г.); на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.); на конференциях «Динамика генофондов» 2006, 2007 гг., на 13 Международной Конференции по молекулярным механизмам старения (Квебек, Канада, май 2009 г.).

Вклад автора. Основные результаты получены лично и совместно с Евгеньевым М.Б., Ульмасовым Х.А., Гарбузом Д.Г., Молодцовым В.Б., Шиловой В.Ю., Зеленцовой Е.С.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 статей в научных рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, описания материалов и методов, пяти глав, посвященных выявлению основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит _____ ссылки. Работа изложена на_____страницах, сдержит ______ рисунков и _____ таблицы.

Благодарности. Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации за помощь и поддержку в работе, особенно д.б.н. проф. М.Б. Евгеньева, который инициировал весь проект и все годы активно участвовал в экспериментах, во всех обсуждениях и анализе результатов. Автор весьма признателен за активное участие в работе Ульмасову Х.А, Ляшко В.Н., Караванову А.А., Зеленцовой Е.С., Мяснянкиной Е.Н., Гарбузу Д.Г., Шиловой В.Ю., Молодцову В.Б., Шостак Н.Г. Автор благодарит за поддежку и дружеское участие сотрудников Лаборатории подвижности генома во главе с акад. Ильиным Ю.В.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре экологических ниш

1.1. Экспрессия БТШ70 и HSF у ящериц. Для изучения роли БТШ в адаптации целого организма к определенным условиям обитания, в качестве объекта исследования мы использовали разные виды ящериц, населяющих пустыни Средней Азии. Для сравнения с ними мы выбрали вид из средней полосы, живущий в условиях холодного и умеренного климата (живородящая ящерица - Lacerta vivipara). Среди пустынных видов для подробных исследований выбрали ящериц, активных в дневное время суток (песчаная круглоголовка -Phrynocephalus interscapularis) и в ночное (каспийский геккон - Caspian gecko).

Проведенное нами сравнение уровня синтеза БТШ70 у видов ящериц трех указанных выше категорий показало, что активные днем пустынные ящерицы характеризуются заметным уровнем БТШ70 в клетках и при нормальной температуре, у ночных уровень БТШ70 при нормальной температуре значительно ниже, а у видов ящериц средней полосы БТШ70 в клетках в норме почти полностью отсутствует (рис. 1).

Рис. 1 Иммуноблот-анализ уровня БТШ70 для круглоголовки (1), живородящей ящерицы (2), каспийского геккона (3) в нормальных условиях (25С)

Интересно было выяснить, колеблется ли уровень синтеза БТШ70 у одного из самых термофильных на земле животных, песчаной круглоголовки, в норме в течение дня, в связи с естественными колебаниями температуры воздуха, почвы и тела животного. Мы показали, что тепловой шок у ящериц вызывает активный синтез двух изоформ БТШ70: БТШ68(-) и БТШ68(+). Одна изоформа, БТШ68(+), синтезируется преимущественно при ТШ, а другая, БТШ68(-), при нормальных условиях, при умеренном ТШ, а также при критических для жизни температурах, когда синтез всех других белков подавлен (Ulmasov et al., 1999).

Для выявления возможных колебаний в синтезе БТШ70 в зависимости от изменения температуры тела ящериц, в течение дня in vivo вводили 35S-L-метионин в тело песчаных круглоголовок, отловленных в различное время светового периода суток. Через час после введения метки из печени выделяли белки. После разделения методом двумерного электрофореза выделенных из печени белков, из геля вырезали зоны, соответствующие БТШ68(-) и БТШ68(+), и определяли уровень включенного 35S-L-метионина. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 2.

Рис. 2 Динамика колебаний: температуры тела - 1; синтеза БТШ68(+) - 2 и БТШ68(-) - 3 у песчаной круглоголовки в светлый период суток

Из графика видно, что уровень синтеза БТШ70 в клетках этого вида ящериц имеет положительную корреляцию с колебаниями температуры тела животного, достигающей максимума в середине дня, во время дневной жары. Следует отметить, что высокий уровень синтеза БТШ сохраняется даже после снижения температуры тела до 30 - 35°С. (Ульмасов и др., 1997; Ulmasov et al., 1999).

Чтобы выяснить, обеспечивается ли высокий уровень накопления БТШ70 на стадии транскрипции, или же он достигается за счет высокой стабильности самих БТШ70, мы провели анализ экспрессии мРНК бтш70 в норме и после ТШ у живородящей ящерицы и круглоголовки. Проведенный Нозерн-анализ показал примерно одинаковый уровень накопления мРНК бтш70 после ТШ (42°С 1 ч) для обоих видов, при значительно более высоком конститутивном (при 25°С) уровне синтеза мРНК у круглоголовки (рис. 3).

Различия в уровне мРНК бтш70 и БТШ70 в норме могут достигаться с помощью разных молекулярных механизмов. Одним из них, возможно, является изменение числа генов бтш70 в ходе эволюции у южных и северных видов ящериц. Для проверки этой гипотезы был проведен анализ по Саузерну геномной ДНК, выделенной из песчаной круглоголовки и живородящей ящерицы. При обработке геномной ДНК ферментами рестрикции с последующей гибридизацией с меченым зондом (ген бтш70 Xenopus laevis), получена идентичная картина как по паттерну, так и по интенсивности полос гибридизации.

Исходя из полученных результатов, можно предположить сходную организацию генов бтш70 и равное число (вероятно 2 - 3) их копий у сравниваемых видов. То есть, наблюдаемые нами различия в уровне экспрессии БТШ70 у этих видов, скорее всего, обусловлены различиями в системе регуляции синтеза этих белков.

На стадии транскрипции регуляцию осуществляют факторы транскрипции ТШ (HSF - позитивный регулятор и CHBF - негативный). Было интересно выяснить, имеются ли различия в уровне мРНК hsf и соответствующего белка у изучаемых видов ящериц. Нельзя было исключить и вероятность того, что организация и число копий самих генов hsf различно. Для выяснения этого вопроса был проведен Саузерн-анализ с меченой пробой hsf L. vivipara. Паттерн гибридизации ДНК круглоголовки и живородящей ящериц, обработанных ферментами рестрикции, с пробой к гену hsf, совершенно различен. Это свидетельствует в пользу сильной дивергенции этих генов, а также о возможном их количественном различии, в отличие от изученных у этих же видов генов бтш70. Для выяснения имеющихся различий в уровне мРНК hsf и, соответственно, белка у контрастных по термоустойчивости видов ящериц до и после ТШ были проведены Нозерн- и Вестерн-анализы.

Рис. 4 Анализ уровня экспрессии HSF (А и Б). А. Нозерн анализ РНК (1, 2 - контроль, круглоголовка и живородящая ящерица. 3, 4 - ТШ, круглоголовка и живородящая ящерица (см. рис. 3) с меченой пробой первого экзона гена hsf L. vivipara. Б. Иммуноблот-анализ уровня HSF для круглоголовки (1, 2), живородящей ящерицы (3, 4), каспийского геккона (5, 6) при 25 С (1, 3, 5) и после шока в 42 С в течение 1 ч (2, 4, 6)

Из рисунка 4А видно, что у круглоголовки уровень синтеза мРНК hsf значительно ниже, чем у живородящей ящерицы. Для подтверждения результатов Нозерн-гибридизации был проведен сравнительный анализ содержания общего количества HSF методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к HSF1 человека (рис. 4Б). Для каспийского геккона характерна единственная полоса иммунопреципитации с антителами к HSF в районе 75 кДа, для живородящей ящерицы, кроме сходной по молекулярной массе полосы, обнаружена вторая в 77 кДа. Обе полосы характеризуются большей интенсивностью у живородящей ящерицы в сравнении с полосами у круглоголовки. Таким образом, данные Нозерн- и Вестерн-анализа подтверждают предположение, сделанное на основе Саузерн-анализа о возможности существования различий в количестве и организации генов HSF у данных видов.

Совокупность полученных результатов указывает на возможную взаиморегуляцию различных компонентов системы ТШ у сравниваемых видов. Суммарное содержание HSF позитивно коррелирует с уровнем индукции синтеза БТШ70 при ТШ и негативно - с внутриклеточным уровнем БТШ70 при нормальной температуре. Биологическое значение установленного феномена может состоять в том, что виды южного происхождения, с исходно высоким внутриклеточным содержанием БТШ70, регулярно подвергающиеся ТШ, не испытывают необходимости в резком увеличении количества этих белков при незначительном повышении температуры. При этом спасающую функцию берут на себя конститутивно присутствующие БТШ70. Виды северного происхождения, редко испытывающие в процессе жизнедеятельности резкие колебания температуры, имеют исходно низкий уровень БТШ70, но высокий конститутивный уровень HSF. Высокий уровень HSF в клетках этих видов обеспечивает быструю и интенсивную индукцию БТШ при ТШ. Из рис. 5 видно, что у живородящей ящерицы интенсивность включения метки в БТШ70 при температурах 37 - 42С значительно выше, чем у каспийского геккона. Также видно, что у северного вида индукция БТШ происходит при более низкой температуре, а у южного - при более высоких температурах. Иными словами, у северных видов порог индукции БТШ ниже, а уровень индукции выше, чем у южных.

Известно, что интенсивность транскрипции зависит от эффективности связывания факторов транскрипции с промоторным участком генов БТШ при ТШ, которая определяется сродством факторов транскрипции к элементам теплового шока (HSE). При этом возможна конкуренция между позитивным фактором транскрипции HSF и негативными регуляторами транскрипции (CHBF). Для исследования взаимодействия факторов транскрипции с промотором у контрастных по теплоустойчивости видов ящериц было проведено исследование комплексов белок - ДНК (HSE).

1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами теплового шока. Активация HSF сопровождается его тримеризацией и связыванием с HSE. Анализировали связывание HSF и других факторов транскрипции с HSE, используя метод электрофореза в неденатурирующих условиях. При этом образцы белковых экстрактов различных видов ящериц до и после ТШ инкубировали с меченым 32P HSE-содержащим олигонукдеотидом. Анализ эффективности связывания HSE с факторами транскрипции в суммарных белковых экстрактах ящериц при нормальных условиях и сразу после ТШ (30 мин) представлен на рис.6.

Из рисунка видно, что в условиях опыта существуют три различных комплекса: I - комплекс характерен для южных видов в нормальных условиях; II - комплекс присутствует в

Рис. 6 Анализ связывания факторов транскрипции с HSE



Каспийский геккон (1, 2); круглоголовка (3 - 6); живородящая ящерица (7 - 8); контроль 25°С (1, 3, 7); после ТШ 42°С (4, 8); 45°С (2, 5); 49° С (6). Стрелки указывают расположение HSE-связывающих комплексов (I, II, III).

нормальных условиях у всех видов, при этом его содержание заметно выше у живородящей ящерицы; III - комплекс появляется после ТШ. При ТШ наблюдается уменьшение связывания для комплекса II и его полное исчезновение при критических для жизни ящериц температурах (круглоголовка - 49°С 20 минут). Важно отметить, что у южных видов (особенно ярко это выражено у геккона) в контроле (25°С) наблюдается комплекс III. Присутствие HSF в изучаемых комплексах можно доказать замедлением подвижности рассмотренных выше комплексов после инкубации их с антителами к HSF (рис. 7).

Резкое замедление подвижности комплексов (2 и 4) после инкубации c антителами к HSF ясно показывает, что самый медленный комплекс - III появляется в результате связывания транскрипционного фактора HSF с HSE.

У контрастных по температуре среды обитания ящериц могут различаться пороговая температура индукции БТШ, кинетика накопления БТШ, а также продолжительность их синтеза. Изучая динамику связывания HSF и CHBF с HSE после ТШ, можно установить эти характеристики (рис. 8).

Видно, что температурный порог активации HSF и его связывания с HSE для живородящей ящерицы наступает уже при 34С, а при шоке 42С 15 мин наблюдается более мощное связывание, чем у круглоголовки. Процесс возврата в нормальное состояние у живородящей ящерицы также продолжается значительно дольше, чем у круглоголовки (6 ч против 1 ч).

Рис. 8 Анализ интенсивности связывания факторов транскрипции с HSE при ТШ и в период восстановления. Круглоголовка (1 - 6); живородящая ящерица (7 - 13). Контроль (1 и 7); ТШ 34С 15 мин (2 и 8); ТШ 42С 15 мин (3 и 9); ТШ 42С 30 мин (4); ТШ 42С 60 мин (5 и 10); ТШ 42С 60 мин и восстановление в течение 60 мин (6 и 11); 3 ч (12); и 6 ч (13)

Другой характеристикой эффективности функционирования системы ТШ может быть степень сродства HSF и CHBF к HSE. Были поставлены эксперименты по конкурентному связыванию HSF и CHBF с HSE, которые выявили большее сродство HSF к HSE для пустынных видов в сравнении с обитателем средней полосы (L. viviparа).

Таким образом, в экспериментах по связыванию белковых экстрактов с HSE были обнаружены следующие закономерности.

Повышенная экспрессия БТШ70 у южных видов в норме (геккон и круглоголовка) контролируется на уровне транскрипции и обусловлена, по-видимому, присутствием незначительного количества активной формы фактора транскрипции генов ТШ в нормальных физиологических условиях, что приводит к «подтеканию» транскрипции.

Северные виды характеризуются более низким порогом индукции и значительно более продолжительным временем связывания HSF с HSE после ТШ (6 ч против 1 ч), что обусловливает более длительное время транскрипции бтш после ТШ, и, соответственно, значительное накопление БТШ после ТШ.

Показана бьльшая степень сродства HSF к промоторной части генов бтш у круглоголовки, по сравнению с живородящей ящерицей. Возможно, благодаря этому, южным видам требуется меньшее количество HSF для активации транскрипции.

Для северных видов выявлена более значительная роль негативного фактора в регуляции транскрипции генов ТШ, чем, возможно, обусловлено отсутствие связывания HSF с HSE в нормальных условиях.

Проводимые нами исследования реакции на ТШ и синтеза БТШ у пустынных организмов не ограничились пойкилотермными (холоднокровными) организмами. Следовало выяснить, справедливы ли обнаруженные нами корреляции между синтезом БТШ и термоустойчивостью у теплокровных животных.

2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни и области с умеренным климатом

На следующем этапе наших исследований мы решили сравнить характер синтеза БТШ у двух этнических групп людей: русских, проживающих в центральных районах России, и туркмен, живущих в Средней Азии. Проведенный сравнительный анализ показал, что фибробласты туркмен после длительного ТШ 42.5°С в течение 6 ч способны в полной мере синтезировать весь набор белков, в то время как фибробласты русских полностью прекращают синтез всех белков после такого воздействия (рис. 9). При сравнении выживаемости фибробластов (способности образовывать клоны) после длительного ТШ,

Рис. 9 Флюорограммы двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в фибробластах кожи человека (А - туркмены; Б - русские). Белки метили 14С-аминокислотами (37°С, 1 ч после теплового шока 42,5°С, 6 ч). Стрелками показана индукция БТШ70 (ас - актин)

оказалось, что, как и ожидали, фибробласты туркмен характеризовались значительно более высокой частотой выживания, по сравнению с фибробластами русских (Lyashko et al., 1994).

Ранее в работе Ульмасова (Ulmasov et., 1993) на лимфоцитах верблюда (Camelus dromedaries) было показано, что они способны синтезировать БТШ при более высоких температурах, по сравнению с лимфоцитами человека.

В сумме, результаты этих исследований свидетельствуют о том, что и у теплокровных организмов, обитающих в условиях жарких пустынь, выработались молекулярные механизмы для обитания в экстремальных условиях.

3. Внутривидовые различия по термоустойчивости на примере Drosophila melanogaster

При исследовании механизмов адаптации к высокой температуре у ящериц приходилось вести сравнение между филогенетически весьма отдалёнными видами, резко отличающимися по температуре экологических ниш. В связи с этим возникал вопрос: не обусловлены ли найденные различия в системе ответа на ТШ у видов, контрастных по температуре обитания, простой дивергенцией между видами (Garland and Adolph, 1994), либо они действительно вызваны адаптацией к высоким температурам среды обитания. С этой точки зрения наиболее корректно изучать эволюцию генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структуру и характер экспрессии у близкородственных видов, различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды или популяции рода Drosophila.

Адаптация к ТШ у мух рода Drosophila, по-видимому, шла отличным путем, чем у ящериц. У разных видов ящериц мы обнаружили одинаковое число генов бтш70. У всех видов мух рода Drosophila произошла амплификация индуцибельного гена бтш70. Так, у D. auraria в единственном локусе находятся 3 копии бтш70, а виды D. simulans и D. mauritiana содержат в двух локусах по 2 тандемные копии БТШ70. У D. melanogaster произошла дальнейшая амплификация копий гена бтш70. При этом в локусах 87В и 87А расположено по 3 - 4 и 2 копии, соответственно. Структура кластера генов бтш70 у группы D. virilis не была изучена вовсе. В начале наших исследований мы остановили свой выбор на мухах вида Drosophila melanogaster. Для сравнения взяли хорошо изученную линию Oregon R (OR) и линию, обозначенную нами как Termotolerance (TT). Линия ТТ была отловлена в начале 70-х годов в центральном Чаде (Африка). В данной местности в марте-июне наблюдается колебание дневных температур в диапазоне 20 - 38 С. Как оказалось, мухи линии ТТ остаются фертильными и способными к развитию при 32С. Отловленные мухи линии ТТ в течение последних 20 лет велись в лабораторных условиях как при температуре 25С (линия Т25), так и при температуре 32С (линия Т32). При температуре выше 29С мухи OR, так же, как и все другие линии D. melanogaster, становятся стерильными. Ответ на ТШ у мух линии OR, в отличие от линий ТТ, подробно изучен. В связи с этим интересно было выяснить, отличается ли линия ТТ от OR только способностью развиваться при более высоких температурах, либо она характеризуется также более высокой устойчивостью к экстремальным шоковым воздействиям и отличается по уровню синтеза БТШ от OR.

3.1. Сравнение линий по термоустойчивости. Для ответа на этот вопрос были проведены опыты по определению критической температуры выживания (рис.10). Под критической мы понимаем температуру, при которой количество выживших мух составляет менее 1% от числа подвергнутых ТШ. Из рисунка 10A видно, что для OR критической является температура 40С, а для линий Т25 и Т32 - 40.5, 41С, соответственно. Примечательно, что при 40С выживает 75% мух линии Т32 и 25% - Т25. Известно, что предварительный слабый ТШ (35 - 37С) ведет к увеличению количества выживших мух после сильного ТШ и повышает на 1.5 - 2С критическую температуру выживания (индуцированная термотолерантность) (Krebs, 1999). Из рисунка видно (рис. 10Б, В, Г), что при индуцированной термотолерантности критическая температура выживания остается неизменной для всех рассматриваемых линий. С другой стороны, явно увеличивается количество выживших мух при температурах, близких к критической. Таким образом, установлено различие рассматриваемых линий по критической температуре выживания при схожести в динамике проявления индуцированной термотолерантности.



Рис. 10 Выживаемость мух в зависимости от ТШ (A) и индуцированной термотолерантности (Б, В, Г). По оси абсцисс указаны температуры теплового воздействия, по оси ординат - процент выживших мух через сутки после ТШ.

3.2. Сравнение уровня содержания БТШ70. Мы предположили, что основной причиной повышения термоустойчивости линий ТТ может являться повышенное содержание белков-членов семейства БТШ70. Для точного количественного определения содержания БТШ70 был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА - ELISA). На рис. 11 представлено содержание БТШ70, накопленного в течение 1 ч восстановления после 30 мин ТШ. Представлено процентное содержание от стандарта БТШ70, выделенного из 20 нг белков, полученных из клеток Drosophila Schneider 2 после ТШ 36.5С и восстановления в течение 1 ч (25С). Результат анализа показывает, что в данных условиях OR, и ТТ достигают относительного пика индукции БТШ70 после ТШ 37С, причем у OR уровень накопления БТШ70 значительно больше, чем у ТТ.

Рис. 11 Количественный анализ содержания индуцибельного БТШ70 в зависимости от температуры ТШ

При более высоких температурах у OR индукция БТШ70 резко падает (до нуля при 39 С), при сохранении детектируемых данным методом количеств белка у линии Т32. После шока 38С индукция БТШ70 примерно одинакова для всех линий, поэтому данная температура была выбрана для изучения кинетики накопления БТШ70 во время восстановительного периода. Максимальное содержание БТШ70 достигается у обеих линий после 3 ч восстановления. В этом случае, у OR и Т25 накапливается белка примерно в три раза больше, чем после 1 ч. Падение до исходного уровня происходит между 5 и 6 ч. Таким образом, кинетика накопления индуцибельного БТШ70 в период восстановления после ТШ у разных линий одинакова, и различается по количеству синтезируемого БТШ70.

3.4. Анализ геномной ДНК линий ТТ и Oregon R. Обнаруженные различия в уровне индукции БТШ70 могут быть обусловлены отличиями в числе копий гена бтш70 и (или) в системе регуляции синтеза БТШ70. Для проверки первого предположения был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК (рис. 12). Была получена идентичная картина гибридизации с пробой к гену HSF. При обработке ДНК ферментами рестрикции BamHI и HindIII и гибридизации с фрагментом гена бтш70 D. melanogaster для ДНК OR наблюдается 5 фрагментов гибридизации, каждый из которых совпадает с определенной копией гена (один с двумя копиями). При этом для линий Т25 и Т32 видно также 5 полос, но 3 из них отличаются по подвижности от полос гибридизации у OR. В случае использования других рестриктаз картина гибридизации для OR и ТТ также различна. На основании примерно одинаковой интенсивности полос гибридизации можно предположить равное число копий гена бтш70 в сравниваемых линиях (у Oregon R - шесть копий).

Рис. 12 Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК c XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70 D. Melanogaster

Важно было выяснить, вызваны ли различия в картине гибридизации рестрикционным сайт-полиморфизмом, либо произошли какие-то существенные изменения в структуре генов бтш70, приведшие к изменению уровня экспрессии БТШ70. Методом ПЦР у линии ТТ в 5'-районе одной из копий гена бтш70 была выявлена вставка. Оказалось, что в Ва-копию гена бтш70 между первым и вторым HSE произошло внедрение ретротранспозона Jockey (Zatsepina, 2001; Lerman, 2003). Последовательность депонирована в GeneBank под номером AY032740. Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания МЭ между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, существенно (по нашим данным, примерно на 75%) снижают уровень транскрипции гена. Таким образом, снижение уровня экспрессии БТШ70 в линии ТТ можно объяснить внедрением МЭ в промотор одного из генов бтш70.

Сейчас убедительно показано, что повышение количества БТШ70 у D. melanogaster выше определенного уровня приводит к повышенной смертности во время развития (Feder, 1999). Таким образом, возможно, число генов и, соответственно, уровень индукции БТШ70 у D. melanogaster достиг оптимального уровня, а для дальнейшего повышения термоустойчивости вовлекаются другие механизмы.

3.5. Синтез белков при тепловом шоке. Картина синтеза БТШ70 для D. melanogaster до и после ТШ хорошо изучена. Наряду с белком с молекулярной массой 70 кДа, семейство БТШ70 включает также индуцируемый тепловым шоком белок с молекулярной массой 68 кДа, который кодируется уникальным геном, расположенным в локусе 95D (Palter et al., 1986). При этом, как индуцибельные (БТШ68 и БТШ70), так и конститутивно синтезируемые члены семейства БТШ70 имеют общие антигенные детерминанты, что обусловливает их совместное обнаружение методом иммуноблоттинга. Кинетику синтеза БТШ de novo после шока можно проследить, проанализировав включение in vivo 35S-L-метионина в белки слюнных желез личинок.

Из рис. 13 видно преимущественное включение метки после ТШ в белки семейства БТШ70, БТШ83 и низкомолекулярные БТШ (22 - 27кДа и 40 кДа). У линии ТТ повышена экспрессия низкомолекулярных БТШ (нмБТШ), по сравнению с OR, а также обнаруживается новая изоформа БТШ70 после ТШ. Чтобы однозначно определить, какие белки относятся к семейству БТШ70, был проведен иммуноблоттинг разделенных методом двумерного электрофореза белков с антителами 7.10.3 (Lindquist Lab.), узнающими индуцибельные и конститутивные члены семейства БТШ70. Результаты, отраженные на рис. 14, указывают на принадлежность рассматриваемых белков к семейству БТШ70.

Таким образом, анализ белков после ТШ методом двумерного электрофореза выявил следующие различия между линиями OR и ТТ: 1) снижение индукции БТШ68 у линии ТТ, по сравнению с OR; 2) при температурах ТШ, близких к критическим, у линии ТТ видна индукция дополнительных низкомолекулярных БТШ; 3) существование дополнительной изоформы БТШ69, принадлежащей семейству БТШ70, для линии ТТ. Таким образом, у линии ТТ повышение терморезистентности происходит не за счет увеличения накопления БТШ70, а, возможно, связано с индукцией дополнительного белка семейства БТШ70 (БТШ69), а также с повышенной экспрессией ряда низкомолекулярных БТШ.

4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов бтш70 у видов филады virilis, обладающих различной термальной адаптацией

Для дальнейших исследований были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis с мало изученной системой ответа на ТШ. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет исследовать возможные этапы эволюции генов бтш70 путём анализа их структуры и сравнения ее со структурой генов других видов (D. melanogaster). Время дивергенции видов D. virilis - D. melanogaster ~ 50 миллионов лет. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастные по уровню термальной адаптации: D. virilis (южный) - D. lummei (северный) и D. novamexicana (южный) - D. texana (северный). Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов virilis, в пределах которой хорошо изучены филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет ~ 4 - 5 млн. лет. Можно предположить, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у этих близких видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены изменениями в ходе эволюционной дивергенции. В качестве дополнительного объекта исследования был взят вид D. montana (филада montana), распространенный в пределах Северной Европы и США и, вероятно, близкий по термочувствительности к D. lummei.

4.1. Изучение термоустойчивости. Для определения устойчивости к кратковременному интенсивному тепловому шоку использовали мух из популяции, поддерживаемой при 25°С.

Таблица 1 Значения LT50 и критической температуры для разных видов и линий группы virilis и вида D. mojavensis

Вид	Линия	Географическое происхождение, широта	LT50, °С	Т критическая
D. virilis	9 101 160 1433 T-53 T-61 Т-40	Батуми, Грузия (42°N) Япония (~ 32 - 36°N) Япония (~ 32 - 36°N) Южная Англия (53°N) Ташкент, Узбекистан (41°N) Ташкент, Узбекистан (41°N) Ташкент, Узбекистан (41°N)	41,3 41,2 40,8 41,1 41,2 41,1	42,5 42,5 41,5 42,0 42,5 42,0
D. lummei	200 202 207 1102 1109	Москва (55°N) Краснодар (45°N) Краснодар (45°N) Финляндия (60°N) Финляндия (60°N)	40,1 40,1 40,1 39,9 40,2	41,0 41,0 41,0 41,0 41,0
D. texana	423	Техас, США (32°N)	40,0	41,0
D.montana	1071.0	Финляндия (60°N)	39.7	41.0
D. novamexicana	424	Невада, США (32 - 37°N)	40,8	42,0
D. mojavensis		Мексика (30°N)	41,8	43,5

Определяли LT50 и критическую температуру. Число выживших мух определяли через 48 ч после ТШ. Из таблицы 1 видно, что все изученные линии D. lummei и D. montana характеризуются меньшей термоустойчивостью, чем линии D. virilis.

В целом, значения LT50 и критической температуры для D. virilis на 1,0 - 1,5°С выше, чем для D. lummei и D. montana. D. novamexicana - вид, обитающий в условиях аридной зоны, проявляет более высокую термоустойчивость, чем D. texana, и схож по этому показателю с D. virilis.

4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и линий группы D. virilis. В наших экспериментах по изучению индуцированной термоустойчивости мы подвергали мух предварительному ТШ интенсивностью 35,0, 36,0 и 37,0С в течение 30 мин. Тепловой шок высокой интенсивности давали через 1 ч, 3 ч или сразу после предварительного ТШ. У D. lummei индуцированная термотолерантность не обнаруживается. D. lummei - первый изученный вид Drosophila, у которого практически отсутствует индуцируемая термоустойчивость. Для D. virilis (предварительный ТШ 36 - 37С), была выявлена высокая индуцированная термотолерантность. Исходя из величины предварительного ТШ и данных по накоплению БТШ70 (см. ниже), можно предположить, что у D. virilis индуцированная термоустойчивость обусловливается индукцией и накоплением БТШ, предохраняющих клетки от более интенсивного ТШ.

4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D. virilis и D. lummei. Гибриды были получены путём реципрокных скрещиваний линии D. virilis 9 и линии D. lummei 200. Было интересно сравнить термоустойчивость родительских линий D. virilis и D. lummei с термоустойчивостью межвидовых гибридов для того, чтобы определить, существует ли доминирование термоустойчивого, либо термочувствительного фенотипа.



Рис. 15 Базовая и индуцированная термоустойчивость гибридов D. virilis и D. lummei. (pt 36,0єC - предварительный ТШ 36С)

Гибриды в обоих направлениях показывали приблизительно одинаковую базальную термоустойчивость. В отличие от D. lummei, гибриды проявляют достоверную индуцированную термоустойчивость при действии предварительного ТШ в обоих направлениях скрещивания (рис. 15).

4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei. Важнейшим показателем степени воздействия теплового шока на организм является уровень синтеза белка в клетках. Для определения воздействия ТШ на общий белковый синтез были поставлены эксперименты по определению включения 35S-L-метионина в общий пул синтезируемых белков в клетках слюнных желёз личинок третьего возраста. В эксперименте использовали линию D. virilis 9 и линию D. lummei 200. Полученные результаты суммированы на рис. 16. Видно, что интенсивность включения метки в белки через 1 ч после ТШ 37,5°С не отличается от контрольного значения (25°С), т. е., происходит интенсивное включение метки в БТШ. После восстановительного периода продолжительностью 3 ч, уровень включения метки в белки выше у D. lummei, чем у D. virilis. Это связано с тем, что, синтез БТШ у D. lummei протекает более интенсивно и в течение более длительного времени, чем у D. virilis. Кроме того, в клетках D. lummei после возвращения к нормальным условиям уровень синтеза клеточных белков для восстановления их пула в цитоплазме, вероятно, выше, чем у D. virilis. Это можно объяснить тем, что тепловой шок 37,5°С оказывает более выраженное повреждающее воздействие на D. lummei, чем на D. virilis. При температурах близких к критическим, после восстановительного периода продолжительностью 1 ч, достоверной разницы в количестве включившейся метки между D. lummei и D. virilis не наблюдается. Очевидно, у обоих видов, при температурах выше 40°С, синтез белка блокируется практически полностью. Совершенно иная картина наблюдается через 3 ч после ТШ.

Рис. 16 Интенсивность включения 35S-L-метионина в общий пул клеточных белков при ТШ разной интенсивности. По оси абсцисс - температура ТШ и время восстановления. По оси ординат - имп/мин

Интенсивность включения метки у D. virilis превышает интенсивность включения у D. lummei в 2 раза после ТШ 40,0°С и в 3 раза - после ТШ 40,5 и 41,0°С. Это свидетельствует о восстановлении функций аппарата трансляции у D. virilis и глубоких нарушениях в механизме синтеза белка у D. lummei. При ТШ 41,0°С интенсивность включения метки в белки у D. lummei падает практически до нуля, что коррелирует с данными по выживаемости.

4.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке.

Исходя из имеющихся литературных данных (Ulmasov, 1992; Gehring and Winner, 1995), мы предполагали, что у терморезистентных видов Drosophila будет обнаружена корреляция между повышенной термоустойчивостью и уровнем накопления БТШ70.

Для проверки этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг белков, выделенных из мух исследуемых видов и линий, с использованием моноклональных антител 7FB к индуцибельному БТШ70 и антител 7.10.3, реагирующих со всеми членами семейства БТШ70 (рис. 17).

Мух подвергали ТШ продолжительностью 30 мин, с последующим восстановительным периодом продолжительностью 1 и 3 ч, затем получали белковые экстракты для иммуноблоттинга.

Выяснилось, что положительная корреляция между содержанием БТШ70 и терморезистентностью наблюдается в пределах филады D. virilis. Уровень накопления БТШ70 у D. virilis (линии 9, 101, 160) значительно превышает уровень накопления БТШ70 при соответствующих температурах у D. lummei (линия 200). У D. novamexicana (линия 424)

Рис. 17 Количественный анализ накопления индуцибельной формы БТШ70 у имаго разных видов и линий Drosophila в зависимости от ТШ. Значения даны относительно концентрации БТШ70 в линии Oregon R при 37,5°С после 1 ч восстановления

уровень накопления БТШ70 в два раза выше, чем у D. texana (линия 423) при 37,5С. Линия D. lummei 200, с северным ареалом распространения, характеризуется более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с более южными линиями 202 и 207. Особенно заметной разница в накоплении БТШ70 между парами контрастных по термоустойчивости видов становится при температурах, близких к критическим (40 - 41С). При ТШ выше 40С экспрессия БТШ70 практически полностью прекращается у D. lummei и D. texana, но сохраняется на достаточно высоком уровне у D. virilis и D. novamexicana. Эти показатели хорошо соотносятся с данными по термоустойчивости и включению радиоактивной метки в общий пул синтезируемых белков (рис. 16).

Однако, у термоустойчивой линии ТТ D. melanogaster уровень накопления БТШ70 после ТШ интенсивностью 37,5С почти в 2 раза ниже, чем у стандартной линии OR (рис.17). У D. mojavensis, наиболее термоустойчивого вида Drosophila, накопление БТШ70 значительно ниже, чем у OR, даже при максимальном уровне индукции (Krebs, 1999). По нашим данным, все линии D. virilis и изучаемая линия D. novamexicana также характеризуются более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с OR (см. рис. 17), которая является наиболее термочувствительной из всех изученных линий (критическая температура выживаемости - 40,0С). Таким образом, во многих случаях наблюдается отрицательная корреляция между содержанием БТШ70 при умеренных тепловых шоках (37 - 38С) и термоустойчивостью вида или линии. Однако, при более высоких температурах все линии термоадаптированных видов накапливают БТШ70 в количествах, многократно превышающих накопление у термочувствительных видов. Кроме того, максимум индукции БТШ70 у D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с D. lummei, D. texana и OR (см. рис. 17). Таким образом, можно сделать вывод о преимущественной защитной роли БТШ70 именно при высоких температурах.

4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70. Представляло интерес сопоставить данные по накоплению БТШ70 и кинетике синтеза мРНК бтш70. Сравнивали линию D. lummei 200 и линии D. virilis 9 и 160 (см. рис. 18). Видно, что у D. lummei полностью прекращается синтез мРНК бтш70 при 40,0 и 41,0С. Восстановление транскрипции происходит через час после ТШ 40,0С. Накопление белка при этом крайне незначительно даже после 3-х часов восстановительного периода (см. выше). У D. virilis 9 синтез мРНК бтш70 сохраняется как при 40,0, так и при 41,0С. Таким образом, через 1 ч после ТШ 40,0С у линии D. lummei 200 наблюдается уровень транскрипции, сравнимый с линиями D. virilis 9 и 160, тогда как накопления белка, судя по данным Вестерн-анализа, не происходит.

Рис. 18 Уровень индукции мРНК бтш70 при различных значениях ТШ. 1 - 25°С, 2 - 31,5°С, 3 - 37,5°С, 4 - 40,0°С, 5 - 41,0°С, 6 - 40,0°С, 1 ч восстановления. Внизу - гибридизация с зондом к гену актина D. melanogaster

Следовательно, отсутствие синтеза БТШ70 у D. lummei при сублетальных температурах можно объяснить подавлением или нарушением трансляции мРНК бтш70. Аналогичную картину (транскрипцию РНК без последующего синтеза белка у OR) мы наблюдали при сравнении ответа на ТШ 39°С линий D. melanogaster OR и ТТ.

4.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF. Методом связывания и торможения фрагмента ДНК в геле определяли температуру тримеризации HSF. У D. lummei 200 комплекс HSF-HSE образуется при 31С, а у D. virilis 160 - при 32С. Это отличие свидетельствует о более низком пороге индукции генов бтш у северного вида D. lummei, по сравнению с более южным видом D. virilis. При температурах 37,5 - 40,0С существенных отличий в связывании HSF с HSE не наблюдается. Следует отметить тот факт, что при ТШ 40 и 41С у D. lummei связывание HSF с ДНК имеет место, а транскрипции генов бтш70 не происходит. По-видимому, при столь высокой температуре ДНК-связывающая активность HSF сохраняется, но происходит нарушение функций других компонентов аппарата транскрипции. Транскрипционная активность генов бтш70 восстанавливается только через 1 ч после ТШ 40С (см. выше). Сходный характер связывания HSF с HSE у сравниваемых видов при высоких температурах позволяет предположить, что разница в накоплении белкового продукта у исследуемых видов объясняется не особенностями активации HSF, а, скорее всего, разницей в числе генов бтш70.

4.8. Анализ спектра изоформ БТШ70. Представляло интерес сравнить паттерн индукции БТШ70 у D. lummei и D. virilis. Для этого белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали методом окрашивания азотнокислым серебром, радиоавтографией радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Характер синтеза БТШ у видов группы virilis изучался Sinibaldi и Storti (Sinibaldi and Storti, 1982).