Реактивность и пластичность тканевых компонентов печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после гипертермии

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Реактивность и пластичность тканевых компонентов печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после гипертермии

АНТОНОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

Астрахань - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Мкртчан Офелия Завеновна

доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна

доктор медицинских наук, профессор Молдавская Анна Аркадьевна

доктор биологических наук, профессор Правоторов Георгий Васильевич

Ведущая организация:

Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова РАН, Москва

Защита диссертации состоится «18» декабря 2009 года в 1000 часов

на заседании Диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1 Естественный институт АГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан «______» __________________ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент Ю.В. Нестеров

Актуальность исследования

Изучение закономерностей становления в эволюции реактивности и пластичности функционально-аналогичных тканей с позиции теории параллелизма - фундаментальная задача современной биологии (J. C. Venter, 2001; J. B. Pritchard, 2002; H. Scholz, 2002).

В эволюции различных видов температура является одним из факторов, который обеспечивает развитие, рост, пролиферацию, функционирование и гибель клеток в системе целостного организма у экто- и эндотермных животных с различным содержанием ДНК (В. Г. Шахбазов, 2001; М. М. Калашникова, 2006; D. L. Bayne, 2004; A. E. Vinogradov, 2005; P. J. Verschure, 2005; M. Michelle, 2005; T. Ryan, 2005; M. Kelly, 2006; S. Harpreet, 2006; J. Frampton, 2006). Особенно актуальным становится изучение этого вопроса в свете глобального потепления климата (Всемирная метеорологическая организация, 2003; Изменения климата ..., 2002; Конвенция ООН об изменении климата, 2002). В свою очередь, изучение влияния гипертермии на биологические системы имеет адекватную как физиологическую (климато-географическая миграция, условия высокотемпературных технологий), так и клиническую актуальность (Н. В. Зеленина, 2002; М. А. Пальцев, 2004; S. C. Chen, 2001; A. V. Souvernev, 2001; H. Talbot, 2001; M. Muraca, 2002). При этом особое значение приобретает состояние органов, непосредственно участвующих в поддержании гомеостаза организма. Одним из таких органов является печень. Сложность структуры, полифункциональность, быстрота вовлечения печени в деструктивные и репаративные процессы - все это определяет неослабевающий интерес исследователей к проблемам ее регенерации: источники, масштабы, механизмы. Высокая интенсивность метаболических процессов у эндотермных животных, становление у них новых механизмов устойчивости к стрессу способствовали усложнению и совершенствованию морфологии печени, которая, по сути, является «периферическим интегратором метаболизма». Вместе с тем, многие реактивные и пластические аспекты выхода её из шоковых ситуаций эндо- и экзогенной природы даже у млекопитающих изучены недостаточно. Отрывочны сведения об экспериментальном изучении влияния гипертермии на организм других видов экто- и эндотермных позвоночных (М. М. Калашникова, 2000, 2001, 2006; Е. И. Яковлева, 2003; P. P. Warren, 2000; A. N. Rice, 2006). Это не позволяет в полной мере проанализировать закономерности эволюционного направления в развитии срочно реализуемых общих и частных структурных реорганизаций, модификаций активности ферментов печени в процессе развития реактивных и пластических реакций.

В рамках этой фундаментальной проблемы особый интерес вызывает исследование повреждения и восстановления печени в различных моделях гипертермии. Для детального анализа деструктивных и репаративных последствий, а также способов восстановления полноценной структуры и функций печени после экстремальной тепловой нагрузки представлялось целесообразным сравнительное морфофункциональное исследование этого органа у двух классов теплокровных животных -- млекопитающих и птиц, у которых терморегуляция складывалась в ходе эволюции самостоятельно.

Недостаточно работ, посвященных анализу становления в эволюции таких количественных и качественных показателей, как стромально-паренхимные соотношения клеток печени и пролиферативно-репликативные соотношения гепатоцитов, пути клеточной гибели и особенности клеточного цикла гепатоцитов в сравнительном ряду позвоночных. Спектр этих вопросов практически не изучен с позиций временнуй адекватности, степени выраженности, распространенности в пределах печеночного ацинуса как в норме, так и после воздействия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных (В.П. Скулачев, 2001; Д. Н. Маянский, 2002; Е. В. Малышева, 2007; М. Leist, et al., 2001; В. Levine, 2004; M. Artal-Sanz, 2005; Y. P. Yang, 2005; A. Kelekar, 2006, S. A. Lakhani, 2006; C. Indiani, 2006).

Не в полной мере в сравнительном ряду изучена и систематизирована динамика биохимических маркеров пролиферации, путей клеточной гибели, взаимосвязи митохондриальных и цитоплазматических оксидоредуктаз. Не определены направления регуляции активности оксидоредуктаз в системе in vivo, в сравнении с in vitro. Отсутствуют схемы развития метаболических компенсаций в свете сопряженности метаболических процессов биоэнергетической системы позвоночных в модели in vivo и in vitro (Н. О. Бабич, 2000; М. Ю. Еропкин, 2000; С. Я. Проскуряков, 2002; М. В. Левенкова, 2004; Г. В. Ганусова, 2005; Н. С. Зыкина, 2007; S. Filosa, 2003; F. Gao, 2004; M. Camici, 2006). Отсутствуют работы, посвященные анализу реактивности и пластичности печени после действия гипертермии в прямом (система in vitro) и опосредованном (система in vivo) режиме (Животная клетка в культуре, 2000; Е. А. Завьялова, 2006; O.S. Bains, 2004; L. Sбez, 2005).

В силу известной полифункциональности печени особую трудность в исследовании представляет классификация наблюдаемых после теплового удара явлений раннего периода активации регенерации, а также зависимости путей гибели клеток паренхимы и принципов их восстановления. Для того чтобы обнаружить и выделить структуры печени и специфические механизмы «противостояния» тепловому стрессу, необходимо изучение последствий общего перегревания также и в ряду эктотермных позвоночных животных -- рыб, амфибий и рептилий. Прямое сопоставление структурных и функциональных событий, выявляемых в печени животных разных таксонов, которые обладают разнокачественными системами терморегуляции, детоксикации и различным содержанием ДНК, дало возможность значительно дополнить существующие представления о реактивности и пластичности печени в сравнительном ряду позвоночных.

Все вышеперечисленное определило проблему настоящего исследования, проводимого по федеральному плану (№ гос. регистрации 01 9 10 011014).

Цель работы - выявить гисто-энзиматические закономерности проявления реактивности и пластичности печени на кратковременную гипертермию в сравнительном ряду позвоночных.

Задачи исследования:

Изучить функциональную морфологию печеночного ацинуса, стромально-паренхимные соотношения клеток печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.

Выявить показатели биологии гепатоцитов (ультраструктура, клеточный цикл, пути гибели) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.

Исследовать источники физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов на клеточном и субклеточном уровне в норме и после острой гипертермии.

Изучить биохимические проявления реактивных и пластических реакций печени (оксидоредуктазы митохондриальной и цитозольной фракции, маркеры путей гибели и пролиферации гепатоцитов) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.

Проанализировать особенности биологии гепатоцитов in vitro в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии (ультраструктура, пути гибели), выделить спектр метаболических изменений гепатоцитов в показателях энергетического и пластического обмена, вызванных прямым действием гипертермии, от событий, обусловленных изменениями во внутриорганных взаимодействиях в условиях стресса в системе in vivo. печеночный ацинус гипертермия гепатоцит

Научная новизна работы

Впервые в сравнительном ряду позвоночных животных с различной системой терморегуляции установлена видовая специфичность функциональной морфологии печеночного ацинуса, реактивность и пластичность печени на органном, межтканевом, межклеточном, клеточном, субклеточном и биохимическом (молекулярном) уровне после кратковременного действия гипертермии.

Выявлены видовые общие и частные закономерности и клеточные особенности реакции сосудисто-тканевых компонентов печеночного ацинуса, особенности в динамике соотношения количества гепатоцитов и стромальных клеток печени через час после действия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных.

Результаты исследования расширяют представления о механизмах, способах и масштабах регенерации печени как показателях пластичности органа, сформированного у изучаемых видов эндо- и эктотермных позвоночных. Выявлена степень выраженности реактивности и пластичности с позиции гистотопографии печени эндо- и эктотермных животных согласно эволюционно обусловленным закономерностям в ответ на действие гипертермии в моделях in vivo и in vitro.

Установлены и сопоставлены особенности клеточного цикла, соотношения путей гибели гепатоцитов, определены морфобиохимические маркеры пролиферации, путях программируемой клеточной гибели гепатоцитов, энергетического и пластического обмена в сравнительном ряду позвоночных в клеточных культурах in vitro в норме и после острой гипертермии.

Мультипараметрический принцип исследования реактивности и пластичности печени в модели in vivo и гепатоцитов в модели in vitro, в норме и после гипертермии позволили выявить в сравнительном ряду направление, в котором формировались особенности реорганизации структур печени, обеспечивающих выживание и последующие этапы репаративной регенерации в восстановительном периоде.

Теоретическая и практическая значимость

Показаны сравнительно-гистологические аспекты биологии гепатоцитов: особенности клеточных циклов, соотношения путей гибели гепатоцитов, способов репарации печени. Полученные данные расширяют представления о развитии реактивных и пластических процессов печени в зависимости от системы терморегуляции организма.

Выявлены источники восстановления эпителия печеночного ацинуса, определен диапазон реактивных и пластических структурных компонентов печени у животных с различной системой терморегуляции и различным количеством ДНК.

Показана топография реактивных и пластических изменений печеночного ацинуса в сравнительном ряду позвоночных, динамика биохимических процессов печени и гепатоцитов.

Выявлена связь реактивных изменений ультраструктуры гепатоцитов с изменениями активности внутриклеточных ферментов, особенности этих корреляций в сравнительном ряду позвоночных.

Результаты исследований представляют практический интерес для уточнения показаний к использованию гипертермии, позволяют обосновать механизмы нарушений, развивающихся в организме животных при тепловом ударе, а применение предложенных методов исследования - оценить тяжесть воздействия.

Полученные результаты могут быть использованы для научных исследований с использованием модельных систем in vivo/in vitro для выявления эволюционных механизмов реализации структурно-функциональных компенсаций и их регуляции.

Полученные нами первичные культуры гепатоцитов различных видов животных являются оптимальными модельными системами для решения таких фундаментальных и прикладных проблем, как исследование процессов пролиферации, дифференциации и межклеточных взаимодействий и предоставляют возможности для изучения управляемых модификаций метаболизма в условиях физиологической нормы и в эксперименте. Отработанная схема получения и культивирования обеспечивает возможность использования культур гепатоцитов для изучения размножения, выявления спектра чувствительности к различным вирусам в данных культурах.

Внедрение в учебный процесс.

Полученные результаты пополнили разделы общих лекционных курсов: "Цитология", "Гистология с основами эмбриологии", "Генетика", «Биология клетки», "Молекулярная биология", спецкурсов: "Частная сравнительная гистология", "Основы современной биологии и экологии", «Общая биология» - в Омском государственном педагогическом университете, Омской государственной медицинской академии, Ханты-Мансийском государственном медицинском институте, Тюменской государственной медицинской академии, Новосибирской государственной медицинской академии, Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета, Московского государственного медико-стоматологического университета, Саранском государственном университете.

Внедрение в практическую деятельность. Получен номер государственной регистрации заявки на изобретение «Способы выделения гепатоцитов животных с различной системой терморегуляции (амфибии, черепахи, птицы)» Рег. № 2008132219 от 08.08.2008.

Результаты исследования внедрены в практику научно-исследовательского учебного центра Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета с 20.01.2007 года.

Первичные культуры гепатоцитов in vitro изучаемых животных нашли применение в практике Федерального государственного учреждения науки Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в качестве объекта для вирусологических исследований в рамках проводимых исследований биологических и генетических характеристик флави-, тога- и хантавирусов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сравнительном ряду позвоночных определено становление структурно-функциональных единиц печени, а также морфометрические показатели хроматина, источники физиологической регенерации, соотношения путей гибели гепатоцитов, стромально-паренхимные соотношения клеточных типов печени, апоптоз/некрозные соотношения и ряд общих и отличительных ультраструктурных показателей гепатоцитов.

2. Однократная гипертермия в группах животных «амфибии/птицы», и «рыбы/рептилии/млекопитающие» вызывает видоспецифичные изменения морфометрических показателей сосудистого русла печеночного ацинуса, увеличение количества стромальных клеток печени с изменением их топографии в пределах ацинуса; изменения показателей клеточного цикла, состояния фракций хроматина гепатоцитов; смену источников физиологической регенерации и путей гибели гепатоцитов.

3. Ультраструктурные изменения ядра и цитоплазмы гепатоцитов носят мозаичный характер, зависят от степени биологической и функциональной зрелости, топографии в пределах ацинуса и видовой принадлежности. В зависимости от развития либо гипо-, либо гиперметаболических реакций эти изменения отражают увеличение количества двуядерных или PCNA-позитивных гепатоцитов, или обеих популяций гепатоцитов. Выявлена активация стромальных клеток печени.

4. В сравнительном ряду выявлены видоспецифичные отличия активности изучаемых оксидоредуктаз митохондрий и цитозоля, биохимических маркеров гибели гепатоцитов, содержания ионов [Са2+]i, [К+]i и [Nа+]i. Гипертермия определяет дифференцированную модификацию активности оксидоредуктаз, содержания ионов, соответственно реализацию в большей мере программы гибели гепатоцитов по пути некроз/аутофагия и реализацию реакций как гипо-, так гиперкатаболизма.

5. В клеточных культурах гепатоцитов, в сравнении с in vivo, установлены видовые различия в индексе пролиферации, направлениях гибели и показателях энергетического и пластического обмена гепатоцитов. Гипертермия приводит к ультраструктурным изменениям гепатоцитов, смене путей клеточной гибели, разнонаправленному изменению активности оксидоредуктаз, биохимических маркеров клеточной гибели, отражая развитие реакции как гипо-, так и гиперкатаболизма гепатоцитов.

Апробация результатов научных исследований

Результаты исследований обсуждены на Международной конференции орнитологов «Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии», Казань, 2001; Международной научно-практической конференции «VI Царскосельские чтения», С-Петербург, 2002; VI конгрессе международной Ассоциации морфологов, г. Уфа, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики XXI века» и Международном симпозиуме «Пиридоксальфосфат - зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», С-Петербург, 2003; Всероссийской научной гистологической конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти Ф.М. Лазаренко, Оренбург, 2003; III Региональной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды, Челябинск, 2004; V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием, г. Казань, 2004; VII Международном конгрессе ассоциации морфологов, Москва, 2004; XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2004; Международном научном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2004; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», Сургут, 2004; II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2006» Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2006; Научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях», С.-Петербург, 2006; V Научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Таиланд (Паттайа), 2008; Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко, Оренбург 2008; Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» посвященной П.В. Дунаеву, Тюмень, 2008; IX Международной ассоциации морфологов и IV съезде ассоциации морфологов Узбекистана, Бухара, 2008.

Публикации. Основные положения диссертации представлены в 32 печатных работах. В изданиях, рекомендованных ВАК, - 11. Одно учебное пособие.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 397 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: обзор литературы, изложение материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждение полученных данных, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 187 фотографиями и схематичными рисунками, 18 таблицами. Список использованной литературы включает 768 работ, в том числе зарубежных 578 зарубежных авторов.

Выражаем благодарность профессору, д.м.н. член. кор. АНТ Киясову А.П., ст.н.с., доценту Вакулину Г.М., к.м.н. доценту Гумеровой А.А., к.б.н. Калашниковой М.М., д.в.н., профессору Плешаковой В.И., д.б.н., профессору Рябчиковой Е.И., д.м.н. Спиридонову В.К., д.м.н., профессору Семченко В.В., к.м.н Хижняк А.С, д.м.н., профессору Шурлыгиной А.В. за помощь, оказанную на всех этапах проведения исследования.

Объекты и методы исследований

Для решения поставленных задач по выявлению и оценки деструктивных и восстановительных процессов использованы две экспериментальные модели: in vivo и in vitro, которые включали 5 групп позвоночных животных:

1. Рыбы - вид Carassius auratus gibilio Bloch, 1782, карась серебряный (двухлетки - 2+).

2. Амфибии - вид Rana terrestris Andrzejewski, 1832 (Rana arvalis Nilsson, 1842), остромордые лягушки самцы (трехлетки).

3. Пресмыкающиеся (рептилии) - вид Pscudemia (Chrysemys scripta var. Elegans 1889, Trachemys scripta elegans) красноухие половозрелые черепахи самцы (пять лет развития).

4. Птицы - вид Columba livia (forma domestica) Gmelin, 1789, половозрелые сизые голуби самцы (6 месяцев развития).

5. Млекопитающие - вид Rattus norvegicus (var. alba) Berkcnhout, 1769, половозрелые беспородные крысы самцы (2 месяца постнатального развития).

Эксперимент перегревания поставлен на 180 животных (из них 75 служили контролем). Острого перегревания в системе in vivo эндотермных животных достигали путем пребывания животных в течение 30 минут в воздуховентилируемой камере «Chirana» при температуре 42°С. Для группы эктотермных животных перегревание проводили, в зависимости от видовых границ температурного оптимума, в водной среде при температуре 32°С для рыб и амфибий и 42°С для рептилий, в условиях свободного плавания с дополнительной аэрацией в течение 30 минут. Температурное воздействие в заданном режиме приводило к развитию теплового удара средней тяжести (G. N. Somero, 2002; A. E. McKechnie, 2004; Y.-M. Chang, 2005). Исследование модели in vitro проводилось на 30 животных, анализировалось 750 закладок клеточных культур гепатоцитов. Перегревание гепатоцитов в системе in vitro осуществляли на вторые сутки культивирования на водяной бане в течение 30 минут при температуре для культур гепатоцитов млекопитающих, птиц и рептилий 42°С, а для культур рыб и амфибий 32°С.

Методы исследования

Световая микроскопия. Образцы печени фиксировали в жидкости Карнуа, 10% - нейтральном забуференном формалине (М. А. Валовая, и др., 1993), заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по методу Ван-Гизон. На гистологических срезах определяли диаметр сосудов ацинуса (артериолы, венулы, желчного протока, лимфатического сосуда, синусоидов, центральной вены). Морфометрические показатели объема ядер (мкм3) и цитоплазмы (мкм3) гепатоцитов определяли в 3-х зонах ацинуса с помощью окуляр-микрометра МОВ-I-15х (объектив х40, 90), тест - сетки на 1мм2 и 0,04 мм2 (Г. Г. Автандилов, 2002). Количество живых и погибших гепатоцитов определяли в гомогенатах, окрашенных трипановым синим (107кл/мл) в камере Горяева (A. Lang, 2000).

Иммунофенотипирование клеток печени. Стромально-паренхимное соотношение клеточных типов печени, пролиферативную активность и полиплоидизацию гепатоцитов определяли с помощью выявления антител к белкам-маркерам этих клеток (М. В. Угрюмов, 1991; А. П. Киясов, 1998, 2000). Интенсивность и топографию процессов пролиферации и полиплоидизации по зонам печеночного ацинуса определяли путем подсчета на 1000 гепатоцитов количества двуядерных форм и PCNA-позитивных гепатоцитов. Парафиновые срезы окрашивали антителами к PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen; Ig - мышиные МАТ; клон РС 10; разведение 1:100; DAKO) гепатоцитов стрептавидин-биотиновым методом. Клетки Ито окрашивали антителами к десмину (Ig - МАТ; клон - десмин D 33; разведение 1:30; DAKO, DENMARK) так же стрептавидин-биотиновым методом. Антигены выявлялись после предварительной демаскировки методом HIAR (Нeat-Induced Antigen Retrieval) (S. H. Shi, et.al., 1991; R. Von Wasielewski, et.al., 1994). После инкубации с первичными антителами далее инкубировали биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase), со стрептавидином, коньюгированным с пероксидазой хрена (Streptavidin, DAKO LSAB+Kit Peroxidase). В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола (АЭК) и перекиси водорода. Гистохимическая реакция определения активности эндогенной пероксидазы на парафиновых срезах проводилась с целью выявления клеток Купфера по методу МакФи (R. Moll, 1990, Д. Н. Маянский, и др., 1992, J. L. McPhie, 1979). Подсчет числа типов и пролиферирующих гепатоцитов проводился на площади в 0,04 мм2.

Цитофотометрия ДНК гепатоцитов. Методом оптико-структурного анализа (ОСА) ДНК определяли долю гепатоцитов по фазам клеточного цикла - G0, S, G2+M, гиподиплоидные. Мазки печени окрашивали по Фельгену в модификации G. Olson, в реактиве Шиффа. На препаратах определяли состояние обеих фракций хроматина: интегральную плотность, общую интегральную плотность, площадь распределения, площадь ядра, оптическую плотность, среднюю оптическую плотность, периметр, коэффициент округлости хроматина. В каждой группе у каждого животного количество ДНК было измерено в 200 ядрах (одноядерные) (Г. И. Козинец, 2002). Фотографирование и обработка препаратов проводилась на автоматизированном морфометрическом комплексе «Axioplan" («Karl Zeiss», Германия).

Флуоресцентная микроскопия. Тест «живое и мертвое» (life and dead assay) (Liu et al., 2000, Лямзаев 2007) проводили путем прижизненного окрашивания гепатоцитов ядерными красителями Hoechst 33342 (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 15 мин) (A. Lang, 1995; J. N. Harada, 2005) и йодистым пропидием (Sigma, США; р-р в концентрации 20 мкг/мл на среде МЗ в течение 25 мин), для разделения гепатоцитов на группы, основываясь на критериях - состояние плазматической мембраны и ядра с целью выявления апоптоз/некрозного соотношения гепатоцитов (Е. О. Данченко, 1999; А. А. Чиркин, 1999; T. Patel, 1995, К. Г. Лямзаев, 2007). Использовался флуоресцентный микроскоп «Axioscope» («Karl Zeiss», Германия) с применением блока фильтров «Голубая» при длине волны л500-550 и 600-700. Проводился подсчет фрагментированных ядер в расчете на 300 клеток.

Культивирование гепатоцитов in vitro. Гепатоциты выделяли методом двойной перфузии печени раствором коллагеназы (P. Rijnties, 1986). Выделение гепатоцитов проводили согласно запатентованным модификациям этапов выделения гепатоцитов (Рег. № 2008132219 от 08.08.2008). Гепатоциты культивировали на покровных стеклах, предварительно обработанных 0,2% раствором желатина в чашках Петри (Sigma, США). Инкубировали в среде F12, которая содержала 0,2мг/мл альбумина (Sigma, США) и 0,5мкг/мл инсулина (Sigma, США), а также 40 мкг/мл гентамицина, 10% фетальной сыворотки (PAA, Австрия), 25 ед/мл фактора LIF (Sigma, США). Воздушная среда - 5% СО2 и 95% воздуха. Культивирование проводили при температуре 37/20єС. Подсчет клеток проводили с помощью теста на исключение красителя (A. Lang, 2000; H. Wendler, 2005). В эксперименте использовались суспензии с количеством жизнеспособных гепатоцитов <96% (H. Ikeda, et. al., 2003; P. L. Else, 2004, M. Busk, 2005; T. Joseph, 2006). Для морфометрических исследований через двое суток культивирования покровные стекла фиксировали в абсолютном ацетоне и хранили при 20C. Индекс пролиферации (ИП) культур определяли отношением А/Б, где А- численность клеток в культуре после окончания времени инкубации; Б - исходная численность клеток в момент посева культур. С помощью МТТ-теста - (Sigma, США) выявляли потенциальную жизнеспособность клеточных культур определяли по величине оптической плотности формазана на фотометре («MultiScan MCC340, Labsystems») при длине волны л570нм (М. Ю. Еропкин, 2000).

Электронная микроскопия. Электронномикроскопическое исследование проводилось для оценки объемной плотности (мкмі/мкмі/%), поверхностной плотности (мкм2 /мкм3) и численной плотности (мкм0/мкм3) митохондрий, хроматина, ГЭС, АЭС, ядрышка, липидов, лизосом, гликогена гепатоцитов. Анализировали 50 полей зрения паренхимы печени, произвольно отснятых при просмотре материала в электронном микроскопе при увеличении 3000-20000. Объемную, поверхностную и численную плотность изучаемых структур проводили на электроннограммах с использованием встроенной программы «UTHSCSA ImageTool 3.0». Количественные параметры оценивали на единицу площади (100мкм2) паренхимы печени. Образцы печени животных фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%). После фиксации материал заключали в парафин, готовили срезы толщиной 10мкм, окрашивали 0,1% толуидиновым синим. Далее образцы печени дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе «Hitachi-600H» (Япония).

Биохимические методы. Монослой культуры гепатоцитов in vitro предварительно обрабатывали 0,1% раствором тритона Х-100, снимали со стекла раствором версена 0,2 г/л раствора Хенкса по методике Р.Адамса (1983). Митоходриальную и цитозольную фракции в обеих моделях получали методом дифференциального центрифугирования. Активность оксидоредуктаз: ИДГ-НАД (КФ 1.1.1.41), ИДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.42), МДГ-НАД (КФ 1.1.1.37), МДГ-НАДФ (КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) (КФ 1.1.1.49), а так же ЛДГ (КФ 1.1.1.27) определяли на СФ-26 при л=340 нм, регистрируя оптическую плотность при изменении концентрации восстановленных форм НАД/НАДФ в нмоль субстрата/мин на мг белка (М. И. Прохорова, 1982; А. Е. Медведев, 1994; A. C. Gibb, 2002; A. M. Neyrinck, 2005). Активность каспазы-3 (CPP-32) проводили с помощью коммерческого набора «Caspase-3 Assay Kit» «Sigma» на спектрофотометре «Platr Reader Star-30 KENSTAR» в мкм/мг белка. Свободную активность кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) определяли спектрофотометрически в цитозольной фракции по скорости гидролиза n-нитрофенилфосфата/г/мин (Merck, Германия) (R. Maciejewski, 2001). Содержание ионов определяли ионоселективным методом в цитозольной фракции с помощью прибора «EasyLyte Calcium» в 100 мкл субстрата, выражали в миллиэквивалент/литр и в ммоль/л. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (С. Н. Лызлова, и др., 1997).

Статистическая обработка полученного материала осуществлена с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA-5» (О. Ю. Реброва, 2002). За критический уровень значимости принимали р=0,05. Определяли статистические характеристики изучаемых параметров: средняя квадратическая, медиана, дисперсия. Выявляли критерий согласия ч2 Пирсона, равенство дисперсий у (Фишера-Снедекора) согласно которым определяли возможность применения параметрических и непараметрических методов анализа характера различий между независимыми выборками (критерий Манн-Уитни, Стьюдента, однородности Вилкоксона-U, Лапласа-Z, ч2 Пирсона). Для выявления степени сопряженности исследуемых показателей, межвидовых различий применялся корреляционный анализ Пирсона (r), Mann-Whitney тест, многофакторный дисперсный анализ MANOVА.

Результаты исследования и обсуждение полученных данных

Реактивность и пластичность печени на органном уровне

Печень рыб, амфибий, рептилий и птиц представляет собой железу трубчатого строения. Однако у птиц отмечается формирование коротких трабекул из гепатоцитов в два ряда, подобно млекопитающим. Пигментные клетки выявлены у всех изучаемых животных, за исключением млекопитающих. По всей видимости, у млекопитающих система детоксикации гепатоцитов более совершенна и не требует дополнительного участия пигментных клеток и меланомакрофагальных центров, как это выявлено у других групп животных. Соединительнотканная строма печени лучше (окраска Ван-Гизон) развита у млекопитающих. За счет слабо развитой стромы органа опорную функцию у рыб, амфибий и рептилий выполняют межклеточные контакты и коллагеновые волокна в пространстве Диссе.

У интактных животных внутренний диаметр резистентного звена ацинуса - артериолы больше в группе эндотермных животных. Прослеживается тенденция к увеличению диаметра артериолы от рыб к млекопитающим, с разницей между показателями более чем в два раза. Внутренний диаметр емкостного звена интактных животных - венулы, центральной вены, лимфатических сосудов различен: наибольший диаметр венулы и центральной вены выявлен у амфибий, наименьший диаметр венулы у рыб и млекопитающих, с разницей между показателями в три раза. Диаметр центральной вены группы рыбы/птицы, а так же рептилии/млекопитающие одинаков. В последней паре диаметр центральных вен больше. Разница между наибольшим и наименьшим показателем диаметра центральных вен составляет только 35%. Диаметр лимфатических сосудов так же, как и артериолы, больше у эндотермных животных с тенденцией увеличения просвета от рыб к млекопитающим. Как и у артериол, наибольший показатель диаметра лимфатических сосудов в два раза превышает наименьший. Бульший просвет желчного протока выявлен в группе рептилий и птиц. Разница между наибольшим и наименьшим показателями составляет 37% в сравнительном ряду.

У всех видов животных прослеживается порто-венулярный градиент в размерах ядер гепатоцитов, и самые крупные локализованы в области центральных вен. Объем ядер гепатоцитов интактных животных в области портального тракта и центральных вен проявляется в распределении от большего к меньшему: амфибии > рыбы > рептилии > птицы и млекопитающие. В центролобулярной зоне распределение несколько изменяется: амфибии > рептилии > рыбы > млекопитающие > птицы. В среднем по трем зонам у амфибий объем ядер на 29% больше, чем у рыб, на 33% - чем у рептилий, на 47% - чем у млекопитающих и на 59% - чем у птиц.

После гипертермии у рыб, амфибий и рептилий выявляется значимое уменьшение диаметра артериолы. Диаметр венулы у амфибий, птиц и млекопитающих увеличивается, а у рептилий сужается. Диаметр центральной вены уменьшается у амфибий и рептилий, увеличивается у птиц. Расширение терминального звена микроциркуляторного русла обеспечивает усиление оттока крови из ацинуса, минимизируя негативный эффект гипоксии и аутоинтоксикации. Диаметр лимфатического сосуда увеличивается у рептилий, птиц и млекопитающих, сужается у рыб. Расширение лимфатического сосуда отражает интенсивный процесс транскапиллярного обмена и может быть связано с мобилизацией внеклеточной воды за счет компенсаторного перераспределения интерстициальной жидкости и с активацией уровня метаболизма, дренажно-иммунологической функцией и лимфообращения в печени, выравниванием ионного баланса между внутриклеточным и внеклеточным пространством (Ю. И. Бородин, 2000; А. А. Веренинов, 2004; И. Ю. Ищенко, 2005; А. Ю. Цибулевский, 2005). Гипертермия через час после воздействия вызывает уменьшение массы тела у рыб на 8%, у птиц - на 4% и у млекопитающих - на 14%.

Значимые изменения внутреннего диаметра желчного протока выявлены у рептилий и птиц. Но морфометрические изменения носят разнонаправленный характер: если у рептилий отмечается сужение, то у птиц, наоборот, расширение просвета. Диаметр синусоидов ацинуса проявляет зонально-дифференцированную реакцию - у рыб увеличивается просвет синусоидных капилляров только в области портального тракта, у амфибий только в области центральных вен. У рептилий увеличение просвета синусоидных капилляров затрагивает перипортальную и перивенулярную зону, у птиц область портального тракта и центролобулярной зоны.

После гипертермии у рыб в перипортальной зоне объем ядер гепатоцитов уменьшается (87,0±1,6 и 64,4±5,0*), а объем цитоплазмы увеличивается (582,0±1,2 и 1250,1±15,6*). У гепатоцитов центролобулярной зоны оба показателя увеличиваются (82,4±6,0 и 98,9±14,0*/634,2±1,8 и 799,2±18,9*), а в перивенулярной уменьшаются (157,3±4,0 и 99,4±6,0*/1211,0±2,3 и 694,3±22,3*). Средние значения объема ядер у рыб в трех зонах уменьшаются на 20%, а объем цитоплазмы напротив, увеличиваются на 54%. У амфибий уменьшается объем ядер в перивенулярной зоне ацинуса (238,8±0,3 и 177,0±0,9х), объем цитоплазмы увеличивается в перипортальной и центролобулярной, а в перивенулярной зоне уменьшается. В среднем у амфибий уменьшение объёма цитоплазмы гепатоцитов происходит на 33% (1597,3±13,2 и 1070,3±16,8х). У рептилий отмечается уменьшение объема ядер (124,6±1,5 и 91,8±2,4*) и цитоплазмы (1133,7±2,9 и 835,5±20,1*) в перивенулярной зоне и в центролобулярной (91,8±1,2 и 77,9±1,3*/835,4±5,4 и 708,2±28,5*). В среднем объем ядер и цитоплазмы уменьшается на 17%. Объем ядер гепатоцитов птиц (65,4±0,3 и 96,9±0,4*) и цитоплазмы (188,9±8,7 и 248,6±19,9*) увеличивается в области центральных вен и в области портального тракта (36,0±0,2 и 61,5±0,3*/98,2±1,2 и 162,8±25,3*). В среднем у птиц объем ядер гепатоцитов увеличивается на 36%, цитоплазмы на 32%. В группе млекопитающих объем ядер и цитоплазмы увеличивается в перипортальной (36,0±0,2 и 82,4±0,9*/100,2±1,0 и 306,2±2,1*) и в центролобулярной (63,4±0,2 и 107,4±0,8*/167,2±1,2 и 384,6±1,8*) зоне ацинуса, тогда как в перивенулярной уменьшается (113,0±0,3 и 77,9±1,0*/353,5±2,6 и 289,5±2,2*). В среднем увеличение объема ядер гепатоцитов у млекопитающих происходит на 26%, цитоплазмы на 64%. Порто-венулярный градиент в распределении размеров ядер сохраняется только у рептилий и рыб.

Реактивность и пластичность печени на тканевом/межтканевом уровне

Выявлены особенности в стромально-паренхимных соотношениях клеточных типов печени и соотношениях полиплоидизации/пролиферации гепатоцитов. Так, в контроле у млекопитающих, рыб и рептилий двуядерные гепатоциты распределены равномерно в пределах ацинуса. У амфибий распределение двуядерных форм гепатоцитов характеризуется венуло-портальным, а у птиц порто-венулярным градиентом. По трем зонам общий процент двуядерных гепатоцитов у рыб, рептилий и птиц составляет 10%, у амфибий - 12%. Самая большая доля двуядерных гепатоцитов выявлена у млекопитающих - 24%. Отличительной особенностью рептилий является наличие как у контрольных, так и у экспериментальных животных 4-х ядерных гепатоцитов.

Наибольшее количество PCNA-позитивных гепатоцитов интактных животных выявлено в печени птиц - 11%, у рыб - 5%, у других групп животных 4%. Локализация данной популяции гепатоцитов в пространстве ацинуса у всех животных характеризуется порто-венулярным градиентом. Исключение составляет группа птиц, где количество PCNA-позитивных гепатоцитов во всех зонах ацинуса одинаково (рис. 1).

У интактных животных пероксидазо-позитивные клетки Купфера распределены равномерно в пределах ацинуса у амфибий и млекопитающих. Преобладание органоспецифичных макрофагов наблюдается в перипортальной зоне у рыб, рептилий и птиц. Десмин-позитивные клетки Ито рыб распределены равномерно в пределах ацинуса, у амфибий и млекопитающих более всего десмин-позитивных клеток Ито выявлено в области центральных вен, у рептилий в центролобулярной зоне, у птиц как в центролобулярной зоне, так и области центральных вен (рис. 1).

У рыб, рептилий, птиц и млекопитающих доля хехст-позитивных гепатоцитов от общего количества погибших гепатоцитов составляет 62-70%. Самое большое количество погибших гепатоцитов с апоптическим фенотипом - у птиц. У амфибий выявлена обратная тенденция. Примерно одинаковое апоптоз/некрозное соотношение выявлено у птиц (2,3), рептилий (2,1) и млекопитающих (2), у рыб 1,7 и у амфибий 0,6.

После гипертермии снижение количества живых гепатоцитов в перивенулярной зоне выявлено у всех групп животных, а также в центролобулярной зоне у амфибий и млекопитающих, в перипортальной у рептилий, птиц и млекопитающих. В отличие от других животных, в центролобулярной области печени рептилий наблюдается увеличение количества живых гепатоцитов, по всей видимости, за счет увеличения двуядерных форм. Увеличение количества двуядерных гепатоцитов обеспечивает закладку зон потенциальных источников будущего клона одноядерных гепатоцитов в области портального тракта (рис. 1) у амфибий, птиц; в центролобулярной - у амфибий, рептилий; в перивенулярной зоне - у рептилий и рыб (И. В. Урываева, 2001; Г. А. Сакута, 2005; S. Gupta, 2000). Так, если в контроле двуядерные гепатоциты были равномерно распределены по зонам ацинуса у рыб и млекопитающих, то после гипертермии равномерное распределение сохраняется только у млекопитающих. У амфибий и птиц распределение проявляет венуло-портальный градиент, у рыб и рептилий распределение меняется на порто-венулярный. В среднем по трем зонам количество двуядерных гепатоцитов после гипертермии у рыб составляет 14%, у амфибий 20%, рептилий 16%, у птиц 22% и у млекопитающих 22%.

После перегревания соответствует контрольным показателям количество PCNA-позитивных гепатоцитов у рептилий и птиц; у рыб и амфибий оно уменьшается в перипортальной зоне, отражая ингибирование процессов полиплоидизации. У амфибий PCNA-позитивные гепатоциты в области центральных вен вообще не выявляются, но в центролобулярной зоне их количество увеличивается. Млекопитающие - это единственная группа, у которой во всех зонах ацинуса количество PCNA-позитивных гепатоцитов увеличивается до 28% (рис. 1). Чтобы предотвратить повреждающее действие последствий гипертермии на структуру ДНК (соответственно и генов) в эволюции у животных сформировались механизмы, которые ограничивают быстрое увеличение количества тетраплоидных гепатоцитов как по пути формирования двуядерных, так и по пути полиплоидизации одноядерных форм клеток (S. P. Otto, 2007). Кроме того, тетраплоидные клетки имеют тенденцию к активации p53, что, в свою очередь, ведет к развитию блока клеточного цикла в G1-стадии, и, в конечном счете, к активации апоптоза, что выявлено нами у всех групп животных (N. J. Ganem, 2007). Потребность в PCNA (факторов процессивности PCNA-зависимых ДНК-полимераз), который обнаружен у всех организмов, по всей видимости, возрастает в условиях теплового стресса отражая не только активацию пролиферативных процессов, но и деструктивных, связанных с повреждением ДНК и активацией различных ПКГ (M. G. Jeschke, et al, 2001; R. M. Douglas, 2003; J. Frampton, 2006). Увеличение количества PCNA-позитивных гепатоцитов так же может быть индуцировано синтезом клетками Ито рядом важных цитокинов, что подтверждается выявленным увеличением количества у всех животных данной популяции стромальных клеток печени (C. Schmidt, et al., 2004, 2006; P. L. Andersen, 2008 J. G. Aparicio, et al., 2004; J. Frampton, 2006).

Выявленное нами в эксперименте дифференцированное снижение активности оксидоредуктаз цикла Кребса, по всей видимости, сопряжено с активацией полиплоидизации гепатоцитов по пути формирования двуядерных форм у всех групп животных, за исключением млекопитающих. Источником двуядерных гепатоцитов, вероятно, могли стать резервные гепатоциты, готовые к митозу, и гепатоциты, находящиеся в фазе синтеза ДНК к моменту начала эксперимента и, следовательно, способные вступать в митоз (В. А. Шкурупий, 1989; Г. Г. Автандилов, 2001, 2004). Увеличение количества двуядерных гепатоцитов может быть компенсаторной реакцией для восстановления межклеточных контактов с клетками Ито, а следовательно, ингибирования их активации и трансформации в миофибробласты. В то же время полиплоидизация одноядерных гепатоцитов на фоне снижения пролиферации в группе млекопитающих является защитным механизмом от метаболических последствий, связанных с действием гипертермии. У амфибий отмечается активация как процессов пролиферации, так и полиплоидизации (Сакута Г.А., 2005).

Увеличение количества погибших гепатоцитов и количества двуядерных и PCNA-позитивных гепатоцитов во всех зонах ацинуса у млекопитающих сопряжены, по-всей видимости, с аутокринной активацией. В группе рыб выявлена зональная сопряженность между увеличением количества погибших и двуядерных форм гепатоцитов в области центральных вен. У амфибий в центролобулярной зоне на фоне увеличения погибших гепатоцитов увеличивается количество как двуядерных, так и PCNA-позитивных гепатоцитов. У птиц в области портального тракта сопряжено увеличение количество погибших гепатоцитов и двуядерных форм, а у рептилий таковой зоной является перивенулярная. У млекопитающих увеличение количества погибших гепатоцитов положительно коррелирует с увеличением количества PCNA-позитивных гепатоцитов.

Количество органоспецифичных макрофагов у рыб после перегревания соответствует контрольному показателю; тем не менее нельзя исключить развитие качественных, а не количественных изменений в этой группы клеток (Р. А. Knolle, 2000, 2003). У амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих отмечается увеличение количества пероксидазо-позитивных клеток Купфера в области портального тракта. В то же время у млекопитающих количество органоспецифичных макрофагов увеличивается так же и в зоне центральных вен. Следовательно, выявленный в контроле у птиц и рептилий порто-венулярный градиент в распределении пероксидазо-позитивных клеток Купфера меняется на венуло-портальный, у амфибий, млекопитающих и рыб органоспецифичные макрофаги распределяются равномерно по зонам ацинуса (рис. 1).

Динамика количества и топографии десмин-позитивных клеток Ито после

Перипортальная зона

Центролобулярная зона

Перивенулярная зона

Рис. 1. Динамика соотношения стромально-паренхимных клеточных типов печени в норме и после гипертермии (при р?0,05). ДГ - двуядерные гепатоциты, К - контроль, П - перегревание, PCNAПГ - PCNA-позитивные гепатоциты, КК - клетки Купфера, КИ - клетки Ито.

Рис. 2. Динамики цитокоммуникаций в пределах зон ацинуса (при r ?0,7).

перегревания проявляется в увеличении их количества у всех групп животных в области центральных вен, в группе птиц - в центролобулярной и перипортальной, в группе млекопитающих - в центролобулярной. Столь ранняя активация данного типа клеток печени подтверждается нашими электронномикроскопическими исследованиями. Увеличение количества десмин-позитивных клеток Ито происходит, по всей видимости, за счет перехода десмин-негативных в десмин-позитивные клетки Ито: ранее не экспрессировавшие данный протеин клетки или содержащие его в минимальных количествах могут начинать его синтез при повреждении печени (H. Senoo, 2000, 2004; R. Issa, 2001; G. Carpino, 2004; G. Schlaf, 2004; C. Schnabel, 2004; M. R. Alison, 2004; R. G. Wells, 2005; M. H. Ismail, 2009). Причиной активации клеток Ито может служить прекращение мембранного контакта с гепатоцитами, выброс поврежденными гепатоцитами «раневых гормонов» и АФК. В свою очередь, активированные клетки Ито паракринно определяют активацию клеток Купфера; последние обладают стимулирующей активностью в отношении клеток Ито для удаления клеточного детрита и реконструкции межклеточного вещества (S. K. Meurer, 2005; A. M. Figueiredo-Fernandes, 2006).

Исходя из современной концепции, вышеприведенные деструктивно-репаративные события разворачиваются согласно топографическим зонам ацинуса (рис. 2) (А. П. Киясов, 2002; А. Lang, 1999; N. Milosevic, 2000; Z. Kmiec, 2001; J. E. Dumont, 2002; А. М. Figueiredo-Fernandes, 2006;). У рыб в перипортальной зоне не наблюдается активации показателей раннего репаративного процесса. У амфибий и млекопитающих активация органоспецифичных макрофагов оказывает разнонаправленное влияние на эпителиальные источники регенерации. Положительная сопряженность между количеством органоспецифичных макрофагов и количеством погибших гепатоцитов выявлена у рептилий и птиц. В отличие от других групп, у птиц выявлена положительная корреляция между количеством двуядерных гепатоцитов и увеличением количества десмин-позитивных клеток Ито (рис. 2). В центролобулярной зоне у амфибий и рептилий проявляется в большей мере аутокринная активация эпителиальных источников регенерации паренхимы. У млекопитающих активация десмин-позитивных клеток Ито положительно соотносится с увеличением количества как погибших, так и PCNA-позитивных гепатоцитов. Подобная тенденция проявляется в перивенулярной зоне у рыб и рептилий. У амфибий активация клеток Ито перивенулярной зоны сопряжена с увеличением количества погибших гепатоцитов. У птиц выявляется активация только клеток Ито. У млекопитающих активация стромальных клеток положительно соотносится как друг с другом, так и с увеличением количества погибших и PCNA-позитивных гепатоцитов (рис. 2). (Н. Ding, 2003; G. Schlaf, 2004; O. Kohji, 2007).

Нельзя исключить, что активация стромальных типов клеток печени обеспечивает выявленные переключения стратегий метаболизма после действия гипертермии. В частности, известно, что увеличение продукции ИЛ-6 ингибирует активность ключевых ферментов глюконеогенеза в печени, а ФНО обладает антилиполитическим действием. Следовательно, синтез стромальными цитотипами цитокинов пара- и аутокринного действия во многом способствуют метаболическим сдвигам с дальнейшей реализацией либо толератной, либо резистентной стратегии метаболизма (В. И. Кулинский, 1992).

Реактивность и пластичность печени на клеточном уровне (гепатоциты)

Максимальная интегральная оптическая плотность конденсированной фракции ДНК хроматина ядер гепатоцитов выявлена у интактных животных в группе амфибий и млекопитающих. Вторую группу образуют рыбы и рептилии, третью птицы. Но, согласно анализу MANОVA, значимых отличий в интегральной оптической плотности между второй и первой группой животных не выявлено. Согласно интегральной оптической плотности декондесированной фракции ДНК (эухроматин) в первую группу можно отнести амфибий (рис. 4), во вторую - млекопитающих (рис. 7), в третью - рыб (рис. 3) и рептилий (рис. 5) и в четвертую - птиц (рис. 6). Уровень оптической плотности конденсированной фракции уменьшается в направлении млекопитающие > амфибии > рыбы > рептилии>птицы. Уровень оптической плотности деконденсированной фракции одинаков у эктотермных, но меньше, чем у эндотермных животных. Самый высокий уровень оптической плотности деконденсированной фракции хроматина выявлен у млекопитающих. По результатам сравнительного анализа уровня оптической плотности деконденсированной фракции, значимых отличий не выявлено в группе рептилии/рыбы и амфибии/рыбы. Максимальная же разница в уровне оптической плотности де- и компактизированной фракции хроматина выявлена у амфибий и рыб (рис. 3, 4).

Площадь распределения деконденсированной фракции хроматина больше в ядрах гепатоцитов амфибий, меньше у рыб, млекопитающих и рептилий и минимальная у птиц. Конденсированная фракция локализована более компактно с убыванием от амфибий >рептилии>рыбы>млекопитающие>птицы. Согласно площади распределения обеих форм хроматина, самая большая площадь ядра выявлена у амфибий, далее рыбы>рептилии>млекопитающие>птицы. При этом значимых отличий данного показателя не выявлено только в группе рептилии/млекопитающие, а распределение компактизированной фракции хроматина в группе млекопитающие/рыбы.

Наибольшее количество гепатоцитов в G0-G1 стадии (2n2с) выявлено у интактных рыб (рис. 3) за счет минимального количества гиподиплоидных гепатоцитов и гепатоцитов в S, G2-M - стадии клеточного цикла. Вследствие этого у данной группы животных выявляется и минимальный индекс пролиферации. Обратная тенденция выявляется у птиц и рептилий (рис. 5, 6). Тем не менее, в группе рептилий выявлено самое большое количество гиподиплоидных гепатоцитов, менее всего у млекопитающих и рыб (рис. 3, 4, 5, 6, 7). При этом наиболее высокий показатель индекса пролиферации - у птиц и рептилий. Анализ соотношения «митотической активности/количества гиподиплоидных гепатоцитов» интактных животных (G2-M/D) выявил, что в группе рептилий, рыб и амфибий количество митотически делящихся гепатоцитов меньше, чем гиподиплоидных. У птиц и у млекопитающих - обратная реакция. Соотношение «полиплоидизации/пролиферации» (S/G2-M) таково, что из гепатоцитов, находящихся в S-стадии, у рыб 10% гепатоцитов вступают в G2-M-стадию, у амфибий 19%, у рептилий - 17%, а у птиц и млекопитающих этот показатель одинаков - 13%.