Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Размещено на http://www.Allbest.ru/

03.01.06. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Тема:

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека

Казачинская Елена Ивановна

Кольцово - 2010

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Локтев Валерий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

доктор медицинских наук, профессор Бочаров Евгений Федорович

Ведущая организация: НИИ молекулярной биологии и биофизики (НИИМББ) СО РАМН, г. Новосибирск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор”

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Трошкова Галина Павловна

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Проблема быстрой и точной диагностики инфекционных болезней имеет чрезвычайно важное значение для современного общества. Многие инфекционные заболевания представляют угрозу для жизни и здоровья не только для конкретного индивидуума, но для всего общества. Быстрое и не контролируемое распространение инфекционных заболеваний может привести к развитию эпидемии или даже пандемии в течение весьма короткого периода времени. В последние годы вспышки короновирусной инфекции, птичьего гриппа, пандемического вируса гриппа H1N1 подтверждают крайне высокую значимость борьбы с инфекционными заболеваниями в современном мире (X.Y. Che et al., 2004; Q. He et al., 2007; А.А. Кущ и др., 2008).

Важнейшей составляющей борьбы с инфекционными заболеваниями является своевременная их диагностика. В настоящее время развиваются два основных подхода в диагностике инфекционных заболеваний. Генетическая диагностика, основанная на выявлении нуклеиновой кислоты возбудителя, и иммунодиагностика, базирующаяся на выявление специфических антигенов и антител, являются взаимодополняющими методическими подходами. Следовательно, крайне важно развивать оба эти направления исследований. Сложность проблемы состоит в том, что в настоящее время известны тысячи опасных инфекционных заболеваний, которые могут поражать сельскохозяйственные растения, домашних животных и человека. Кроме того, постоянно возникают новые, неизвестные инфекционные заболевания. По данных Международного таксономического вирусологического комитета только в последние годы зарегистрировано несколько сотен вновь открытых вирусных агентов. Открытие каждого нового возбудителя требует разработки методов их диагностики, причем эпидемическая значимость некоторых из них требует проведения этих исследований в самые кратчайшие сроки. Проблема усложняется тем, что постоянно возникают лекарственно устойчивые варианты возбудителей, многие вирусные агенты чрезвычайно быстро изменяются. Высокая патогенность многих вирусов также чрезвычайно усложняет экспериментальные работы по созданию новых методов диагностики. Вследствие этого, необходимо постоянное развитие и совершенствование биотехнологической базы для точной и своевременной диагностики инфекционных заболеваний.

Для совершенствования диагностики инфекций используют два основных подхода. Это технологии получения моноклональных антител (МКА) и рекомбинантных антигенов. Гибридомная технология позволяет создать уникальную биотехнологическую базу в виде препаратов МКА для исследования вирусных и бактериальных патогенов, опухолевых маркеров, гормонов, цитокинов, интерлейкинов, прионов, токсинов, аллергенов.

В настоящее время МКА все шире входят в повседневную практику научных лабораторий, активно используются для конструирования и производство высокоспецифичных тест-систем и все шире применяются в практической медицине. Использование рекомбинантных антигенов также позволяет совершенствовать иммунодиагностику, причем важно заметить, оба этих подхода позволяют фактически прекратить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве тест систем. Другим важнейшим преимуществом данного подхода является возможность стандартизации качества новых иммунодиагностических систем и появление возможности обеспечивать производство иммунодиагностических тест систем необходимыми биологическими компонентами, антителами и антигенами, в течение неопределенно длительного времени.

Высокопатогенные филовирусы Марбург и Эбола чрезвычайно опасны для человека и общества, они могут использоваться с террористическими целями. Эпидемическая важность этих агентов основана на способности этих вирусов распространяться через прямой контакт с биологическими жидкостями и воздушно-капельным путем (О.В. Пьянков, 1993; М.Ю. Луб и др., 1995; E. Johson et al., 1995). В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем для быстрого выявления антител и антигенов филовирусов.

Характерной особенностью филовирусных инфекций является раннее появление вирусных антигенов в тканях, выделениях и сыворотке крови инфицированных животных и заболевших людей (Н.В. Кизимов и др., 1993; Н.В. Мерзликин и др., 1995; A.K. Rowe, 1999; Т.С. Чепурнова и др., 2000). Эта особенность развития заболевания делает высокоэффективными методы иммунологической диагностики, основанные на раннем выявлении вирусных антигенов в биологических жидкостях человека и животных. Препараты очищенных МКА могут служить основой ИФА тест-системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике (J.S. Towner et al., 2004).

Вспышка 1999 г. в Волгоградской, Астраханской областях и Краснодарском крае лихорадки Западного Нила (ЛЗН), которая считалась эндемичной для тропических и субтропических стран, привлекла внимание к проблеме диагностики этой инфекции и потребовала быстрейшей ее разработки в нашей стране (Д.К. Львов и др., 2000). Тем более, что позднее появились сообщения о циркуляции вируса Западного Нила (ВЗН) в птицах, комарах и клещах от Белоруссии до Приморского края, в Закавказье, бассейне Каспийского моря, республиках средней Азии, в Сибири (Д.К. Львов, 2000, В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006). ВЗН передается теплокровным (людям, лошадям, птицам) через укус комаров, клещей и москитов. В США зафиксированы случаи, когда ЛЗН развивалась у реципиентов после переливания крови (T. Harrington, 2003). ЛЗН особенно опасна для пожилых людей, у которых может развиться миокардит, менингит и менингоэнцефалит, что приводит к 10%-ной летальности среди заболевших (E. Flatau et al., 1981). События 2010 г. на юге России, где снова возникла большая вспышка лихорадки Западного Нила, подтвердили значимость настоящего исследования и практическое использование разработанных тест систем обеспечило необходимые условия для борьбы с этой инфекцией в России.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), вызываемая вирусом герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5) - широко распространенное заболевание повсеместно во всех географических зонах, странах и социально-экономических группах (C.A. Alford et al., 1981). Главной биологической особенностью ВГЧ-5 является его пожизненное персистирование в организме человека и реактивация при снижении иммунитета. Заражение происходит разными путями: воздушно - капельным и при тесном контакте (в том числе и половом) через биологические жидкости, трансплацентарно (от матери к плоду) и интранатально во время родов при прохождении плода через инфицированные родовые пути женщины, при кормлении ребенка грудным молоком (C.A. Alford et al., 1990). Подтверждены факты инфицирования людей при трансплантации органов (почек, печени и костного мозга) (S. Chou, 1986; E. Meijer et al., 2003; R.R. Razonable, 2008). ВГЧ-5 вызывает генерализованную инфекцию у больных СПИД, что является причиной их гибели (G. Nigro et al., 1996). Сложность диагностики связана с проблемами персистирования этого вируса в клетках организма и необходимостью выявления вирусных антигенов именно в инфицированных клетках. В настоящее время присутствие на мембранах периферических лейкоцитов матриксного фосфопротеина pp65 и секреторного р72 ВГЧ-5 принято считать одним из основных критериев острой ЦМВИ. Получение отечественной панели МКА, специфичных к белку рр65, помогло бы улучшить ситуацию с диагностированием острой ЦМВИ у инфицированных людей.

Цель работы: разработка биотехнологической базы для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа (цитомегаловирусом).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить представительные коллекции гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), специфичные к белкам филовирусов Марбург и Эбола, вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5).

2. Исследовать иммунохимические свойства МКА к структурным белкам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 и оценить возможность их использования для конструирования иммунодиагностических тест систем на основе МКА.

3. Сконструировать рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксных белков VP40 вирусов Марбург и Эбола и получить полноразмерные рекомбинантные белки.

4. Исследовать антигенную структуру природных и рекомбинантных белков вирусов Марбург и Эбола с помощью панелей противовирусных поликлональных антител и гибридомных МКА с целью оценки возможности использования рекомбинантных антигенов для разработки иммунодиагностических тест систем.

5. С использованием полученных МКА и рекомбинантных антигенов сконструировать новое поколение иммуноферментных систем для детекции антигенов вирусов Эбола и Марбург в биологических пробах.

6. С использованием МКА, специфичных к белку Е вируса Западного Нила, сконструировать лабораторный вариант экспериментальной ИФА тест-системы для выявления вирусного антигена, оценить его специфичность и чувствительность. Организовать коммерческий выпуск новой тест системы на основе МКА для широкого апробирования на практике.

7. Исследовать возможность использования МКА специфичных к белку рр65 ВГЧ-5 для диагностики острой и персистентной цитомегаловирусной инфекции на культурах клеток.

Научная новизна

Получены оригинальные и представительные коллекции гибридных клеток - продуцентов МКА и панели МКА к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5.

Исследование иммунохимических свойств представительной панели гибридомных МКА показало, что полученные панели МКА к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 могут быть использованы для научных исследований и для конструирования нового поколения иммунодиагностических тест систем на основе этих антител.

Получены оригинальные рекомбинантные белки гликопротеин (GP), нуклеопротеин (NP), VP40, VP35, VP24 вируса Марбург и белки NP, VP40, VP35 вируса Эбола. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков показало их иммунохимическую полноценность, что позволяет их использовать при конструировании тест систем на эти инфекции.

В результате проведенных исследований, с использованием оригинальных препаратов МКА, а также рекомбинантных антигенов филовирусов, сконструированы новые диагностические лабораторные тест системы для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола. Новизна и приоритет данной разработки подтверждена получением четырех патентов РФ (патенты №2395575, №2393220, №2395576, №2395577)

Исследование панели вируснейтрализующих МКА к белку Е вируса Западного Нила (LEIV-VLG99-27889-human) позволило обнаружить два вида МКА 9Е2 и 5Н6 пригодных для конструирования иммуноферментной тест системы для детекции антигена в биологических пробах.

Показана способность различных видов МКА, полученных к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, выявлять в иммуноблоттинге вирусный белок рр65. Иммуноцитохимическим методом показана способность МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65, выявлять вирусный белок рр65 в монослое клеток Vero, персистентно инфицированных цитомегаловирусом человека.

Практическая ценность работы

С использованием созданных панелей МКА к различным вирусным патогенам, в том числе высокопатогенным вирусам Марбург и Эбола, и набора рекомбинантных белков, созданы новые лабораторные образцы иммунодиагностических наборов. Это наборы для выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7H10; наборы для выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9; наборы для выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения); наборы для выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1. Каждая из четырех разработанных конструкций тест-системы защищена патентом РФ (№2393220, №2395575, №2395576, №2395577).

Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксные белки VP40 вирусов Марбург и Эбола, что позволяет нарабатывать соответствующие рекомбинантные белки филовирусов для практического использования, конструирования различных типов иммунобиологических препаратов. Данные белки могут также использоваться для конструирования вакцин и исследования иммунологии и патогенеза филовирусных инфекций. Важно отметить, что предложенный биотехнологический подход позволяет получать антигены филовирусов без использования лаборатории BSL-4 уровня и высокопатогенных вирусов Марбург и Эбола.

Практическая ценность оригинальной коллекции из 24 мышиных гибридом, секретирующих МКА к вирусу Западного Нила (российский штамм LEIV-VLG99-27889-human) состоит в том, что МКА, секретируемые этими клетками - продуцентами, обладают вируснейтрализующей активностью в отношении различных штаммов ВЗН. Это позволяет использовать данные МКА для конструирования нового поколения иммунотерапевтических препаратов для лечения лихорадки Западного Нила. Это возможность была продемонстрирована в создании нового метода генной терапии лихорадки Западного Нила с использованием гена МКА 9Е2 (А.V. Pereboev et al., 2007).

Разработанная лабораторная тест-система ИФА в формате “сэндвич” на основе пары МКА (9Е2 и 5Н6) позволила создать совместно с ЗАО “Вектор-Бест” экспериментальную тест-систему ИФА “ВектоНил-антиген” для выявления антигена вируса Западного Нила в полевых материалах и организовать ее производство. Данная система успешно производиться более четырех лет и используется в практическом здравоохранении. В настоящее время на основе этих же МКА 9Е2, используемых в качестве “подложки” для антигена, также выпускает тест-система ИФА для выявления специфических антител класса IgG против вируса Западного Нила (“ВектоНил-IgG”) и тест-система ИФА для определения индекса авидности антител класса IgG, специфичных к вирусу Западного Нила (“ВектоНил-IgG-авидность”).

Получены 11 оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, были успешно использованы для выявления вирусного белка рр65 - маркера острой цитомегаловирусной инфекции. Штамм гибридных клеток животного Mus Musculus L. 5F10, используемый для получения высокоспецифичных МКА 5F10, защищен патентом РФ №2393219. Одноименные МКА могут стать основой для совершенствования диагностики этой инфекции у человека, что чрезвычайно важно в практическом здравоохранении.

Получение панелей МКА и набора рекомбинантных антигенов в рамках настоящей работы позволяет говорить, что удалось создать биотехнологическую базу для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа. Помимо использования этих иммунобиологических препаратов для разработки нового поколения иммунодиагностических тест систем возможно их использование для исследовательских целей. Важно подчеркнуть, что рекомбинантные антигены и МКА представляют собой стандартные препараты, которые могут храниться очень долго. Плазмиды и гибридные клетки могут обеспечивать наработку этих биореагентов в необходимых количествах на протяжение неограниченного времени без использования патогенных и высокопатогенных вирусных агентов.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Марбург (штамм Рорр) - к кофактору вирусной полимеразы (белку VP35) - 3 вида, к нуклеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопы не определяются.

2. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Эбола-Заир (штамм Mayinga) - к белку VP35 (2 вида), к нуклеопротеину (9 видов мышиного происхождения и 1 вид крысиного происхождения), остальные 9 видов МКА специфичны к матриксному белку VP40.

3. Рекомбинантные белки GP, VP24, NP, VP40 и VP35 филовирусов, полученные в экспрессионной системе E.coli, сохранили антигенную структуру, характерную для аналогичных вирусных белков, и в связи с этим, они могут быть успешно использованы для иммунодиагностики филовирусных инфекций.

4. Способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7H10.

5. Способ выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9, которые можно одновременно использовать как в качестве “захватывающих антиген”, так и в качестве “индикаторных” антител.

6. Способ выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения).

7. Метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1.

8. Панель из 15-ти МКА (мышиного происхождения), специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLG99-27889-human). Гибридную клеточную линию 9Е2 и одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности против семи штаммов ВЗН. Возможность использования МКА 9Е2 и 5Н6 в тест системе “ВектоНил-антиген”, в тест системе “ВектоНил-IgG” и в тест-системе “ВектоНил-IgG-авидность”.

9. Коллекция из 11-ти оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типам способны высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток (в чувствительной L68 и персистентно инфекцированных Vero и RH).

Конкретное участие автора в получении результатов

Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с д.б.н. И.А. Разумовым, д.б.н. В.Б. Локтевым, к.б.н. А.В. Качко, н.с. А.В. Ивановой, к.б.н. Е.Л. Субботиной, к.б.н. А.В. Перебоевым, д.б.н. А.А. Чепурновым, к.б.н. Е.Ф. Белановым, к.б.н. В.А. Терновым, н.с. А.В. Сорокиным, д.б.н. С.В. Нетесовым, д.м.н. Суслопаровым М.А., зав. лаб. ЗАО “Вектор-Бест” В.В. Распопиным.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Xth International Congress of Virology, Jerusalem 1996 г.; Russian-german colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. 1997 г.; 6th Biological Medical Defence Conference. Munchen 1999 г.; Inauguration of the Swedish Containment Laboratories. Stocgolm 2000 г.; IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф 2001 г.; VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Московская обл., г. Пущино 2001 г.; Digest reports of the IV th ISTС scientific advisory committee seminar on “Basic science in ISTС activities”, Novosibirsk, 2001 г.; II Научная конференция с международным участием. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск, 2002 г.; Всероссийская научно-практическая конференция “Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке”, Томск, 2006 г.; XIV International Congress of Virology, 2008 г., Istanbul; Научная конференция “Медицинская геномика и протеомика”, 2009 г., Новосибирск; Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы инфекционной патологии человека”, г. Минск, Республика Беларусь, 2009 г.

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ “Вектор” за период 1998-2010 гг. в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению “Изучение структурно - функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных”. Исследования были поддержаны государственной программой “Новейшие методы биоинженерии”, “Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов”, контракт №43.035.11.1529 (рук. д.б.н. А.А. Чепурнов); проектом по государственному контракту №02.512.11.2004 “Биосенсоры на базе полимерных микрочастиц - жидких микрочипов для иммунодетекции инфекционных заболеваний, в том числе и особо опасных вирусных инфекций” (рук. зав. лаб. ИХКГ СО РАН д.ф.-м.н., профессор В.П. Мальцев); проектом Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISNC №2087 (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); проектами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) №97-04-49697-а (рук. д.б.н. И.А. Разумов), №98-04-49439-а (рук. д.б.н., профессор С.В. Нетесов), №01-04-49877-а (рук. к.б.н. А.В. Качко), №01-04-48972-а (рук. д.б.н. И.А. Разумов); №09-0400450 а (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ “Научная школа НШ-387.2008.4” (рук. д.б.н., профессор С.В. Нетесов); контрактами, выполняемыми в 2009 г. по заказу ФГУЗ РосНИИПЧИ “Микроб” и ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии в рамках ФЦП “Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.): №6/ф/09 “Cоздание научно-технической основы для разработки новых методических и инструментальных подходов к индикации возбудителей особо опасных инфекций, с помощью высокочувствительных биосенсоров” (рук. к.б.н. А.П. Агафонов); №127-Д/1 “Разработка методов получения антигенов и антител для использования в микроэррей технологии (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 статей, входящих в список ВАК, 20 тезисов, получено 7 патентов на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, главы материалы и методы, 3-х глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 336 cтр., включает 28 таблиц и 53 рисунка. Список литературы состоит из 753 источников, включая 132 отечественных работ.

Содержание диссертации

Материалы и методы исследований

В работе использовали вирус Марбург (ВМ) штамм Popp, концентрированный и очищенный методом ультрацентрифугирования плазмы крови инфицированных морских свинок (А.А. Букреев, и др., 1995) и инактивированный в течение 24 ч при 8-10⁰С добавлением 0,17% димера этиленимина (ДЭИ) с дальнейшим прогреванием при 60 ⁰С в течение 1 часа (S. Mitchel et al., 1984). Вирус Эбола-Заир (ВЭ) штамм Mayinga, был сконцентрирован и очищен из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инактивировали кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5% -меркаптоэтанола и 1% додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60 ⁰С в течение 1 часа (А.А. Чепурнов, и др., 1994). Получение рекомбинантных (рек.) белков ВМ в результате экспрессии в прокариотической системе E. coli полноразмерных генов VP35, VP24, GP, NP описано (А.В. Сорокин и др., 1999; А.В. Качко и др., 2001) и препараты предоставлены авторами.

Семь штаммов вируса Западного Нила (ВЗН): LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLG00-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV-Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; Eg101, полученные из коллекции вирусных препаратов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, были пассированы на культуре клеток Vero и на новорожденных белых мышах заражением в мозг.

Сыворотка крови морских свинок, инфицированных ВЭ (референс-антисыворотка), получена из Белорусского НИИ ЭМ. Коммерческие препараты лошадиных IgG против инфекционных ВЭ и ВМ, очищенные спиртовым фракционированием по Кону (И.В. Борисевич и др., 1996), получены из ВЦ НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад). Получение сывороток против ВЭ и ВМ проводили иммунизацией мышей BALB/c (массой 18-20 г), крыс Lou (массой 180-200 г) инактивированными вирусными препаратами. Сыворотка крови кроликов, специфичная к ВМ, получена при иммунизации животных инактивированным вирусным препаратом. В качестве референс-антисывороток против ВМ использовали полученную из Белорусского НИИ ЭМ сыворотку крови инфицированных морских свинок и сыворотку крови сотрудника ГНЦ ВБ “Вектор”, переболевшего ГЛМ в результате случайного лабораторного заражения (В.В. Никифоров и др., 1994). Моносыворотки к отдельным рек. белкам филовирусов получали в результате 4-кратной (в течение месяца) иммунизации неинбредных мышей ICR в суммарной дозе - 100 мкг/мышь. Поликлональные сыворотки к ВЗН получали иммунизацией неинбредных мышей ICR и мышей BALB/c инфекционным вирусом и инактивированным вирусным препаратом. Все манипуляции с животными проводили с применением анестезии, в соответствии с ветеринарным законодательством.

Использовали культуры клеток: мышиную P3.NS.1/1-Ag4.1 (NS/1) и крысиную 210RC.Y3-Ag1.2.3 миеломы (полученные из Онкологического центра РАМН) культивировали на среде DMEM(M) (производство ГНЦ ВБ “Вектор”) с добавлением 10% - 15% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Flow Laboratories, Англия), 150 мг L - глутамина (ГНЦ ВБ “Вектор”) и 80 мг сульфата гентамицина (КРКА, Словения) на 500 мл среды; Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), L-68 (диплоидные клетки легкого эмбриона человека), RH (клетки почки эмбриона человека) и 293 (клетки почки эмбриона человека) культивировали в среде DMEM(M) с 5 - 10% ФБС. Иммунизацию мышей BALB/c - доноров иммунных спленоцитов проводили в течение двух недель по внутрилабораторной схеме (в общей дозе для ВМ - 98 мкг/мышь, ВЭ - 120 мкг/мышь; рек. белка рр65 - 220 мкг/мышь). Иммунизацию мышей ВЗН проводили по разным схемам, с использованием, как инактивированного препарата, так и инфекционного вируса (I.A. Razumov et al., 2005). Слияние клеток (гибридизацию) проводили с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 1300-1600) по методу, предложенному M.L. Gefter с соавт. (1977). Использовали соотношение миеломных клеток NS/1 к иммунным спленоцитам 1/3. Гибридные клетки выращивали при 37 ⁰C в атмосфере 7%-го CO₂ и проводили селекцию в среде ГAT с 10^-5 М аминоптерина (чтобы подавить рост клеток NS/1), гипоксантина и тимидина, с добавлением 10% оптимизированной для гибридом фетальной сыворотки (HyСlone, США). Тестирование культуральной среды от гибридных клеток проводили методом твердофазного ИФА (ТИФА), используя полистирольные планшеты (производства ВНИИ Медполимер (Москва) или Costar (США), проявление проводили с использованием субстрата ОФД (1 мг/мл о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буферном растворе (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М Na₂HPO₃, рН 5,0) с 0,03% Н₂О₂). Иммуно-химическую реакцию останавливали добавлением 1 N соляной кислоты, оптическую плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре “Uniscan” (Финляндия) при длине волны 492 нм. Клоны подвергали криоконсервации в среде DMEM(M) с добавлением 40% ФБС и 10% диметилсульфоксида. Наработку препаративных количеств МКА проводили in vivo.

Очистку МКА из асцитических жидкостей проводили осаждением балластных белков каприловой кислотой (H. Bazin et al., 1990) с последующей преципитацией IgG в 50%-м растворе сульфата аммония на 0,05 М фосфатно-солевом буферном растворе. Определение концентрации белка в полученных препаратах выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм. Класс и подкласс МКА определяли методом иммунодиффузии по Уохтерлони с помощью набора мышиных моноспецифических антител (IСN, США) и методом ТИФА с использованием моноспецифических мышиных антител (АТ) (Sigma, США). Определение константы аффинности МКА проводили, используя метод параллельного титрования АТ известной начальной концентрации на сорбированном антигене в ТИФА (Д. Берзовски и др., 1989; А.М. Егоров и др., 1991). Биотинилирование очищенных МКА проводили по методу E.A. Bayer с соавт. (1980), используя Biotin N-hydroxysuccinimide ester FW 341,4 (Sigma, США). Для проведения двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” использовали высокосорбционные полистирольные планшеты (Testiks(США) или Nunc (Дания). В промежуточных этапах иммунохимической реакции лунки планшетов промывали трис-солевым буферным раствором с твином (ТСБ-Т, pH 7,4), содержащим 0,15 М NaCl, 0,02 M трис-HCl, 0,05% твин-20. Проявление проводили с использованием жидкого субстрата ТМБ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), останавливали реакцию добавлением 1 N соляной кислоты, оптическую плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре “Uniscan” при длине волны 450 нм.

Фрагменты генома ВЭ, кодирующие белки NP и VP40 получены в ОТ-ПЦР реакции с использованием следующих праймеров:

Для гена VP40:

5' - AAAAGGATCCATGAGGCGGGTTATATTGCCTAC - 3'

5' - AAAAAAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA - 3'

Для гена NP:

5' - AAAAGGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCTGG - 3'

5' - AAAAAAGCTTTCACTGATGATGTTGCAGGATTG-3'

Полноразмерные копии генов VP40 и NP ВЭ после гидролиза эндонуклеазами BamHI и HindIII клонированы в плазмиду pQE-30 (QIAGEN). Для сборки полноразмерной ДНК-копии гена белка VP40 ВМ использовали библиотеку клонов Е. coli (штамм JC5183), несущих рекомбинантные плазмиды pQE31 со вставками ДНК-копий фрагментов геномной РНК ВМ (A. Bukreyev et al., 1995).

Очистку рек. белков из лизата Е. coli проводили аффинной хроматографией на Ni-хелатной смоле (что обеспечивалось наличием в их составе полигистидинового белка 6хHis-tag), согласно протоколу фирмы-производителя (QIAGEN, Германия). Концентрацию белков измеряли при помощи набора “Bio-Rad Protein Assay Kit” в соответствии с рекомендациями производителя, используя в качестве стандарта овальбумин в 4 М мочевине. Электрофорез (ЭФ) вирусных препаратов, рек. белков и МКА проводили по методу, предложенному А.А. Остерманом (1981) в прерывистой буферной системе, с использованием 12-15%-го полиакриламидного геля (ПААГ) с 0,1% SDS в трис-глициновом буферном растворе в режиме 10 В/см. Окраску гелей проводили при помощи Кумасси G-250.

Иммуноблоттинг (ИБ) проводили после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) по методу H. Towbin и соавт. (1979) на аппарате Transphor (“LKB”, Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025 М трис-HCl буферном растворе, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20% этанола.

Результаты и их обсуждение

Применение МКА и рекомбинантных антигенов для разработки иммунодиагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола

Описанные в литературе МКА, полученные к инактивированному разными способами ВМ (штамм Musoke), имеют разный состав и разную специфику. Семнадцать видов МКА к GP, 4 к NP, 2 к VP30 и один вид МКА к белку VP40 ВМ, инактивированного г-облучением описано в работе (M. Hevey et al., 1997). Две гибридомы продуцирующие МКА к структурному GP ВМ (штамм Рорр), инактивированному 0,05% формалином, содержит коллекция (C.В. Ручко и др., 2001). МКА, специфичные к определенным эпитопам рек. NP ВМ (штамм Musoke), были использованы при конструировании ИФА тест-системы для установления быстрого диагноза ГЛМ (M. Saijo et al., 2005). Специфичные к ВЭ МКА получены, в основном, к рек. белкам GP и NP (J.A. Wilson et al., 2000; M. Niikura et al., 2001; A. Takada et al., 2001; J.S. Yu et al., 2006; S. Shahhosseini еt al., 2007).

Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусам Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ)

В результате 11-ти гибридизаций было получено более 2500 гибридных клеточных линии, растущих на селективной среде ГАТ. Выявление растущих гибридом осуществляли визуально, методом световой микроскопии. По результатам ТИФА ростовой среды от гибридом отбирали клеточные линии, продуцирующие специфичные МКА. С целью стабилизации культуральных свойств гибридом и секреции ими специфических IgG было проведено клонирование гибридных клеток методом предельных разведений. В результате отбора, после трех-кратного тестирования были получены коллекции, состоящие из 20-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВМ (Е.И. Казачинская, 2002) и 39-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВЭ. Клеточные линии были размножены, наработаны в культуральных сосудах и заморожены в жидком азоте (при минус 196 ⁰С).

Препараты очищенных МКА получали из культуральной среды гибридом и асцитических жидкостей мышей BALB/c и крыс Lou. Для характеризации МКА были определены: субклассы моноклональных IgG; белки вирусов, с которыми они взаимодействуют; титры специфического взаимодействия АТ с вирусным препаратам; количественный уровень синтеза гибридомных IgG в организме животных; константы аффинности.

Данные по иммуно-химическим свойствам МКА, специфичных к ВЭ представлены в табл. 1 (первая коллекция) и табл. 2 (вторая коллекция). Все гибридомные IgG по результатам типирования были отнесены к классу IgG разных подклассов. Уровень синтеза моноклональных IgG в организме мышей и крыс оценивали по концентрации белка в очищенных препаратах, которая составила от 0,5 до 14,5 мг/мл. Аффинность каждого МКА определяли методом ТИФА при параллельном титровании АТ (в одинаковой начальной концентрации 1 мг/мл) на инактивированном АГ ВЭ. Константы аффинности для каждого МКА находятся в диапазоне от 0,7 до 3,1х10⁸ М^-1, а самое высокое сродство к вирусному антигену было определено для МКА 4В9 9,0х10⁸М^-1 (см. табл. 1), специфичных к NP. Методом ТИФА было проведено определение специфичности взаимодействия вирусного FU с МКА, в виде культуральной и асцитической жидкости, а так же очищенных препаратов. Титры гибридомных АТ в асцитической жидкости находились в диапазоне разведений от 1/2700 до 1/6561000. В результате исследований методом ИБ было показано, что из 14 видов МКА первой коллекции - двенадцать специфичны к NP и два вида МКА к белку VP35 ВЭ (см. табл. 1). МКА, продуцируемые гибридомами второй коллекции, в основном специфичны к матриксному белку VP40 и 2 МКА специфичны к NP (см. табл. 2). Аффинность МКА второй коллекции не определяли в виду отсутствия достаточного количества инактивированного вирусного АГ.

Результаты по преобладанию в нашей коллекции МКА, специфичных к матриксному VP40 филовирусов, совпадают с данными авторов (A. Lucht et al., 2000), описавших коллекцию из 12 гибридных клеточных линий, девять из которых синтезируют МКА к VP40 инактивированного ВЭ-Заир.

Исследование специфичности полученных МКА указывают на возможность их использования как для анализа антигенной структуры филовирусных белков, так и для конструирования диагностических тест - систем для выявления антигенов ВМ и ВЭ.

Таблица 1

Свойства МКА (первая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№п/п	Название гибридомы и МКА	Класс IgG	Белок-мишень в ИБ	Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр. величины)	Конц-я очищенных IgG (мг/мл)	Константа аффинности Ка, М-1
				Культуральная среда	Асцитическая жидкость	Очищенный препарат МКА
1	10A8	IgG2b	NP	900	218700	218700	7,2	1,4 x108
2	1E5	IgG2b	NP	2700	218700	218700	6,3	2,5 x108
3	4A8	IgG2b	NP	8100	2187000	2187000	8,0	2,8 x108
4	10B4	IgG2a	NP	8100	2187000	2187000	9,0	2,5 x108
5	7E1	IgG2a	NP	300	24300	24300	3,1	2,5 x108
6	6G8	IgG2a	NP	300	8100	24300	6,8	0,7 x108
7	4B9	IgG2b	NP	8100	656100	656100	7,4	9,0 x108
8	2H9	IgG1	NP	900	72900	72900	6,0	2,5 x108
9	6A8	н.о.	NP	900	27000	72900	4,3	2,9 x108
10	9G11	IgG2a	NP	8100	2187000	2187000	6,0	2,5 x108
11	9A7	IgG2b	NP	900	24300	24300	4,3	1,7 x108
12	1C7	IgG2a	VP35	8100	729000	2187000	7,8	3,1 x108
13	6F7	IgG2a	VP35	8100	656100	729000	8,3	2,8 x108
14	7B11*	н.о.	NP	н.о.	512000	512000	7,2	н.о.

Примечания: МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор А.В. Перебоев).

Выявление иммунодоминатных белков вирусов Марбург и Эбола

Полученные гибридные клеточные линии продуцируют МКА, для которых белки-мишени определены: к белку VP35 - 7 линий, к VP40 - 20 линий и к NP - 16 линий (см. табл. 1, 2). Эти результаты показывают наличие антигенной структуры на внутренних белках VP35, VP40 и NP инактивированных вирионов ВМ и ВЭ. Вклад каждого белка в иммуногенность вирусного препарата по количеству полученных видов МКА оценить сложно, так как отбор положительных гибридом (продуцирующих МКА) проводили эмпирически, отбирая их в ТИФА по результатам сигнала ОП (>1,0) субстратно-индикаторной смеси в лунках с тестируемой культуральной средой от растущих гибридных клонов. Белок-мишень для полученных МКА можно определить, имея не менее 1 мл культуральной среды и достаточно АГ для переноса на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы протестировать большое количество гибридных клонов, но это рутиная и затратная процедура.

Кроме того, для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов были использованы инактивированные вирусные АГ, что могло повлиять на антигенную структуру вирусных белков.

Таблица 2

Свойства МКА (вторая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№п/п	Название гибридомы и МКА	Cпецифичность к АГ	Класс IgG	Белок-мишень в ИБ	Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр.величины)	Конц-я очищенных IgG (мг/мл)
					Культу-ральная среда	Асцитическая жидкость	Очищенный препарат МКА
1	4A2	ВЭ-IS	IgG1	VP40	24300	6561000	6561000	7,7
2	5C10/H5	ВЭ-IS	IgG1	VP40	8100	72900	24300	6,3
3	3F6/E9/H8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	24300	4,3
4	2E12	ВЭ-IS	IgG2a	VP40	300	8100	8100	4,1
5	2G9/E12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	24300	2,5
6	2A3/C6	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	1,2
7	3E3/D8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	2700	н.о.	0,5
8	4C4/E11/G12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	8100	2,8
9	3C7/D9	ВЭ-IS	IgG1	VP40	300	24300	24300	6,5
10	1B2	ВЭ-IS	IgG1	NP	8100	6561000	2187000	8,9
11	1B1	ВЭ-IS	н.о.	NP	100	8100	н.о.	н.о.
12	3B12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	н.о.
13	4G8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	300	8100	н.о.	н.о.
14	2H5	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	н.о.
15	1C1	ВЭ-8МС	IgG1	VP40	8100	6561000	6561000	14,5
16	1E6/A3	ВЭ-8МС	IgG1	VP40	8100	729000	729000	1,5
17	1B5	ВЭ-8МС	IgG2a	VP40	8100	218700	72900	5,7
18	3D9/C2	ВЭ-8МС	IgM	VP40	8100	729000	729000	7,0
19	3C12/G2	ВЭ-8МС	IgG2a	VP40	900	72900	72900	3,5
20	1G4	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	300	н.о.	н.о.	н.о.
21	2H4	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	100	н.о.	н.о.	н.о.
22	3F8	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.
23	3F6	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	100	н.о.	н.о.	н.о.
24	7D12	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.
25	6A12	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.

Примечания: н.о. - не определяли; ВЭ-IS - исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС - штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V.E. Volchkov et al., 2000).

Исследование антигенного состава любого патогена необходимо для совершенствования дифференцирующей диагностики на специфические маркеры, а также для разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов. По литературны данным, основными белками филовирусов, вызывающими иммунный ответ организма, являются NP, VP40 и белок VP35. Это было выявлено методом ИБ при исследовании сывороток крови обезьян различных пород из возможного ареала распространения филовирусов и cывороток крови реконвалесцентов (S. Becker et al., 1992).

Исследование спектра АТ, продуцируемых организмом в ответ на иммунизацию или инфицирование животных ВМ и ВЭ проводили методом ИБ. В инактивированных вирусных препаратах были выявлены вирусные белки-иммуногены, взаимодействующие с АТ сывороток крови от иммунизированных и инфицированных животных (табл. 3). Это белки - GP, NP, VP40, VP35, VP30 и VP24, формирующие антигенную структуру филовирусного вириона и распознаваемые иммунной системой макроорганизма при инфицировании или иммунизации. Белки NP, VP40, VP35 ВМ выявлялись АТ исследуемых сывороток в виде мажорных полос. Эти результаты свидетельствуют, что белки инактивированных вирусных АГ не теряют своих иммуногенных свойств, то есть сохраняются антигенные детерминанты. Особый интерес для данного исследования представляют результаты взаимодействия белков инактивированных вирусов с АТ инфицированных морских свинок, с IgG лошадей и АТ сыворотки реконвалесцента (В.В. Никифоров и др., 1994).

У морских свинок, переболевших экспериментальной ГЛМ, несмотря на одинаковую дозу заражения и одинаковое количество прошедших суток на день взятия крови, варьировал титр АТ и диапазон специфичности к вирусным белкам. Тем не менее, доминирующие полосы при ИБ соответствовали белкам - NP, VP40 и VP35 (см. табл. 3). В ТИФА был обнаружен титр 1/218700 для препарата IgG лошадей. Особенность получения данных препаратов состоит в том, что лошади не восприимчивы к филовирусным инфекциям, но вырабатывают нейтрализующие АТ в титре 1/2048. По данным И.В. Борисевич и соавт. (2008) введение морским свинкам, полученного таким образом препарата, через 1 - 2 часов после заражения ВМ в дозе 20-50 ЛД50, защищало от гибели 88-100% животных.

Противовирусные АТ сыворотки крови реконвалесцента выявляют эти белки в вирусном препарате методом ИБ так же в виде мажорных полос (см. табл. 3, рис. 1), что говорит о том, что внутренние структурные белки ВМ, так же как и наружные, презентируются иммунной системе организма индивидуально, обладают высокой иммуногенностью как в нативном, так и в инактивированном состоянии. Титр антивирусных АТ в сыворотке крови реконвалесцента составлял 1/24300. Такой же уровень антител наблюдался в сыворотке крови мышей (№2), иммунизированных инактивированным ВМ.

Так же в табл. 3 представлены результаты специфического взаимодействия в ТИФА белков ВЭ с противовирусными АТ. Наиболее высокий титр АТ (1/2187000 и 1/729000) был выявлен в сыворотках крови мышей (от гибридизаций №5 и №4), иммунизированных инактивированным АГ ВЭ.

Несмотря на то что, ВМ и ВЭ являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют заметные отличия. На это обратили внимание K.M. Johnson соавт. (1977), пытаясь сравнить впервые выделенный ВЭ с уже известным ВМ. Дальнейшие исследования филовирусов подтвердили их антигенные различия (M.P. Kiley, 1988; E.D. Johnson et al., 1996). Но в работе S. Becker cоавт. (1992) отмечается, что при исследовании сывороток крови от людей, переболевших ГЛМ в 1967 г., регулярно наблюдалась кросс-реактивность с АГ ВЭ в реакции иммунофлюоресценции. Аминокислотная последовательность, определенная для NP ВМ и ВЭ, показывает высокую степень их гомологии 400 N-концевых а.о. (A. Sanchez et al., 1993), что позволяет предположить наличие антигенного перекреста. При сравнении аминокислотной последовательности белков VP35 ВЭ и ВМ также были обнаружены у них гомологичные участки (A. Bukreyev et al., 1993).

В исследовании было обнаружено, что в сыворотках крови животных ПАТ имеют перекрестную активность с гетерологичными антигенами в ТИФА (см. табл. 3). Методом ИБ ранее были показаны белки для перекрестных взаимодействий ПАТ мышей, иммунизированных ВЭ - это NP и VP35 ВМ (Е.И. Казачинская, 2002). Возможно, что при инактивации вирионов открылись гомологичные а.о. последовательности филовирусных белков.

Для исключения не специфического взаимодействия противовирусных АТ с гетерологичными вирусными белками использовали для исследования аффинно-очищенные рек. белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных филовирусных генов в клетках E.coli.

Получение рекомбинантных белков филовирусов в экспрессионной системе E.coli и исследование их свойств с помощью противовирусных антител

Для наработки и очистки филовирусов необходим 4 уровень биозащиты, персонал со специальной подготовкой и надежная инактивация вирусных препаратов. Есть данные, что рек. NP ВЭ и ВМ, экспрессированные в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, обладали антигенностью и были использованы в ИФА в качестве АГ для обнаружения IgG в сыворотках реконвалесцентов. Специфичность определения IgG была 100%-ной, без ложноположительных результатов. Кроме того, было обнаружено, что рек. NP ВЭ, полученный на основе гена NP ВЭ-Заир, можно использовать для выявления IgG к другим штаммам ВЭ - Судан, Рестон и Берег Слоновой Кости (M. Saijo et al., 2001). Рек. VP40 ВЭ использовали в качестве положительного контроля на АГ в лабораторной тест-системе (G. Kallstrom et al., 2005). Так же рек. VP40 ВЭ был использован в ИБ для точного определения специфичности МКА, полученных к инактивированному ВЭ-Заир (штамм Mayinga) (A. Luch et al., 2003).

Таблица 3

Исследование спектра филовирусных белков-иммуногенов и перекрестного взаимодействия поликлональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА

Источник антител	Сутки взятия крови от начала иммунизации	Иммуноген	Титры антител в ИФА (обратные величины)	Белки-иммуногены, выявляемые в ИБ на гомологичном инактивированном антигене
			Антигены
			инакт. ВМ	инакт. ВЭ
мышь №1	14	инакт. ВМ	8100	<100	NP, VP35, VP40
мышь №2	21	инакт. ВМ	24300	300	GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
кролик	нет данных	инакт. ВМ	24300	<100	NP, VP40, VP35, VP30,VP24
IgG лошади	нет данных	инф. ВМ	218700	<100	GP, NP, VP35, VP40,VP30
ЧС	нет данных	инф. ВМ	24300	900	GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
морская свинка	нет данных	инакт. ВМ	900	<100	NP, VP40, VP35
морская свинка* (6.4; 7.2)	14	инф. ВМ	200; 200		NP
морская свинка* (2.2; 4.2;6,3)	14	инф. ВМ	6400; 6400; 12800		GP, NP, VP40, VP35
морская свинка* (2.1;4.1;5.1; 6.1; 6.2)	14	инф. ВМ	1600; 800; 800; 400; 6400	<100	NP, VP40, VP35
морская свинка* (1.2;5.2)	14	инф. ВМ	400; 400	<100	NP, VP35
морская свинка* (1.3; 1.4)	14	инф. ВМ	400; 400	<100	NP, VP40
морская свинка* (3.1)	14	инф. ВМ	200	<100	VP40
мышь №1	14	инакт. ВЭ-IS	2700	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь №2	14	инакт. ВЭ-IS	900	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь №3	14	инакт. ВЭ-IS	300	81000	L,GP, NP, P40,VP35,VP30,VP24
мышь №4	21	инакт. ВЭ-IS	300	729000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь №5	14	инакт. ВЭ-IS	300	2187000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь №6	14	инакт. ВЭ-8МС	<100	9000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь №7	14	инакт. ВЭ-8МС	300	243000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь №8	14	инакт. ВЭ-8МС	300	72900	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь №9	14	инакт. ВЭ-8МС	300	72900	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
кролик	нет данных	инакт. ВЭ-IS	2700	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
крыса	14	инакт. ВЭ-IS	8100	72900	NP
IgG лошади	26-42	инф. ВЭ	24300	218700	NP, VP40, VP35
морская свинка	нет данных	инакт. ВЭ-IS	<100	900	NP
морская свинка	нет данных	инф.ВЭ	<100	900	GP, NP
контроли	без антигена	<100	<100	-

Примечание к табл. 3:

инакт. - инактивированный вирусный препарат; инф. - инфекционный вирус;

^*- сыворотки от выживших морских свинок, инфицированных ВМ (условное обозначение каждого животного);

ЧС - сыворотка реконвалесцента (человек переболел ГЛМ) (Никифоров В.В. и др., 1994);

нормальные сыворотки - мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля;

№1 - 9 - сыворотки мышей, представляющие собой каждая пул сывороток от 3 мышей - доноров иммунных спленоцитов, используемых для гибридизаций; NP, VP40, VP35 - жирным шрифтом выделены белки, образующие доминирующие полосы при ИБ.

Оценку степени чистоты рек. белков, полученных в настоящем исследовании оценивали по результатам ПААГ-ЭФ с SDS (рис. 2, 3, 4). Были исследованы свойства рек. белков ВМ и ВЭ: антигенные - по выявлению специфических антивирусных АТ реконвалесцента и АТ иммунизированных животных; и иммуногенные - по взаимодействию АТ, полученных к рек. белкам, с вирусными АГ методами ТИФА и ИБ.

Рис. 1. Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург антителами сыворотки реконвалесцента

1 - нормальная сыворотка человека в разведении 1/1000;

2 - сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (Никифоров В.В. и др., 1994), в разведении 1/1000;

Стрелками обозначено местоположение белков ВМ на нитроцеллюлозной мембране.

Серопозитивная сыворотка крови рековалесцента оказалась ценным препаратом для исследования рек. белков, так как содержит противовирусные АТ, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции.

Результаты тестирования, представленные в табл. 4 и табл. 5 демонстрируют, что рек. аналоги вирусных белков GP, NP, VP35, VP40,VP24 ВМ и VP35, NP, VP40 ВЭ обладают иммуногенностью - вызывают синтез антител в организме иммунизированных беспородных мышей и выявляют в ТИФА антивирусные антитела, то есть обладают антигенными свойствами.



Рис. 2. Электрофореграмма. Анализ белков, синтезирующихся под контролем рекомбинантной плазмиды pQE-VP35 вируса Эбола в клетках E.coli

1 - лизат E.coli - pQE;

2,3 - лизат E.coli - pQE-VP35 ВЭ;

4 - препарат очищенного рек. белка VP35 ВЭ;

5 - препарат инактивированного ВЭ (стрелкой показан вирусный белок VP35); обозначено местоположение маркеров молекулярной массы - 18, 29, 36, 43, 68, 97 и 116, соответственно.

Рис. 3. Электрофореграмма вирусов Марбург и Эбола и очищенных рекомбинантных белков VP40

1. Рек. белок VP40 ВМ (5 мкл);

2. препарат инактивированного ВМ (10 мкл);

3. препарат инактивированного ВЭ (10 мкл);

4. рекомбинантный белок VP40 ВЭ (5 мкл);

5. местоположение белковых маркеров молекулярной массы (Bio-Rad).

Рис. 4. Электрофореграмма вируса Эбола и очищенного рекомбинантного нуклеопротеина

1. рекомбинантный белок NP ВЭ (5 мкл);

2. препарат инактивированного ВЭ (10 мкл).

Таблица 4

Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург