Вплив висококалорійного харчування на ферментативну активність основних комплексів електронно-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів за умов розвитку стеатогепатозу різної етіології

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив висококалорійного харчування на ферментативну активність основних комплексів електронно-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів за умов розвитку стеатогепатозу різної етіології

Вступ

висококалорійний харчування гепатоцит

Неалкогольна жирова хвороба печінки (НЖХП) або стеатогепатоз на сьогоднішній день вважається однією з найбільш поширених форм хронічного захворювання печінки. Порушення системи та режиму харчування, використання харчових добавок, зокрема таких як L-глутамат натрію (ГН), низька фізична активність впливають на обмін речовин та слугують основними факторами, що викликають розвиток стеатогепатозу. Більшість хворих, у яких спостерігається жирова інфільтрація печінки різного ступеня тяжкості, страждають на абдомінальний тип ожиріння та/або з діабетом 2-го типу, хоча відомі випадки розвитку НЖХП у хворих без надлишкової ваги і лише з інсуліно- резистентністю. Розвиток стеатоге- патозу супроводжується балонною дистрофією, фіброзними явищами у гепатоцитах, поряд з підвищенням прозапальних цитокінів у крові, результатом чого стає зниження функціональної активності органа [1,2,3].

У літературі виділяють два ключових явища, які обов'язково супроводжують розвиток НЖХП різної етіології, а саме надлишкове надходження тригліцеридів з підвищенням ліпоге- незу і розвиток окисного стресу, які зустрічаються як в комплексі, так і незалежно один від одного. Розвиток окисного стресу тісно пов'язаний зі змінами у функціонуванні мітохон- дрій, що призводить до так званої «мі- тохондріальної дисфункції», яка відмічається у більшості хворих та на тваринних моделях. Одними з основних характеристик порушення нормального функціонування мітохондрій є зміни активності всіх комплексів елек- трон-транспортного ланцюга (ЕТЛ, дихальний ланцюг) разом зі зниженням рівня АТФ. Найбільш поширеним способом оцінки ступеня активності комплексів ЕТЛ є визначення активності їх ферментативної складової. НАДН - foQ-оксидоредуктаза, сукцинат-КоQ-оксидоредуктаза, КоQ-цитохром с-оксидоредуктаза та цитохромоксидаза є складовими І, ІІ, ІІІ і IV комплексів, відповідно. Наразі, дані щодо змін у функціонуванні ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів доволі суперечливі, може спостерігатись або падіння активності деяких комплексів на фоні підвищення інших, так і зниження функціональної активності всього ЕТЛ [4, 5, 6, 7, 8]. Саме тому, актуальним і доцільним є оцінка і порівняння змін у активності комплексів ЕТЛ, які є характерними ознаками «мітохондріальної дисфункції», за умов патогенезу НЖХП, спричиненого різними етіологічними факторами.

Метою роботи стало визначення ступеня ферментативної активності комплексів ЕТЛ мітохондрій гепато- цитів щурів за умов розвитку стеато- гепатозу різної етіології.

Матеріали і методи

Досліди проводили на білих нелінійних щурах-самцях. Для моделювання метаболічного синдрому у щурів використані два методи. Перший базується на використанні висококалорійної дієти, яка складається із стандартного корму (47%), солодкого концентрованого молока (44%), кукурудзяної олії (8%) і рослинного крохмалю (1%) (дієта #C 11024, Research Dietes, New Brunswick, NJ). Дана дієта за даними літератури спричиняє розвиток стеатогепатозу у мишей та щурів [9]. Другий метод полягає у введенні новонародженим щурятам глутамату натрію (4 мг/кг, підшкірно) на другий, четвертий, шостий, восьмий і десятий день життя.

Для першого методу було відібрано 20 білих щурів масою 180-200 г, які перед початком експерименту було поділені на дві групи. Щурів першої групи утримували на стандартному кормі та з вільним доступом до води. Щурів другої групи утримували на дієті # C 11024 і також з вільним доступом до води. Обидві групи тварин утримувались протягом 20 тижнів.

Попередньо, нами було доведено розвиток стеатогепатозу на фоні глутамат-індукованого вісцерального ожиріння [10]. Саме тому, новонароджених щурят ділили на дві групи. Першій групі на протязі 2, 4, 6, 8 і 10 дня підшкірно вводили ГН у дозі 4 мг/ кг розчинений у фізіологічному розчині у кількості 8 мкл/г ваги щурят. Другій групі в ці ж терміни підшкірно вводили фізіологічний розчин у кількості 8 мкл/г. Щурів обох груп утримували на стандартному кормі та вільним доступом до води протягом місяців життя.

На основі аналізу методичних підходів для отримання морфологічно та функціонально інтактних клітин нами була модифікована відома методика неферментативного методу виділення гепатоцитарної фракції клітин за Петренко А.Ю. і співав. [11]. Препарати внутрішньої мітохондріальної мембрани отримували за допомогою поетапного уль- трацитрифугування [12]. Визначення НАДН - КоQ-оксидоредуктазної активності проводили за методом По- кровського А.А. зі співав. [13]. Визначення Н+-АТФазної активності проводили за методом Пікулева А.Т. зі співав. [14]. Визначення сукцинат- КоQ-оксидоредуктазної активності, КоQ-цитохром с-оксидоредуктазної активності та цитохромоксидазної активності проводили за стандартними методиками [15].

Результати та їх обговорення

Утримання щурів-самців на ВКД протягом 20 тижнів показало як падіння ферментативної активності деяких комплексів, так і зростання інших (табл. 1).

Так, сукцинат-КоQ-оксидоре- дуктазна активність і Н+-АТФазна активність була нижчою у 1,2 (р<0,05) і 1,8 разів (р<0,01) відносно контрольної групи. НАДН - КоQ-оксидоредуктазна активність, КоQ-цитохром-с-оксидо- редуктазна активність і цитохромок- сидазна активність підвищувалась у 1,3 рази (р<0,05), 1,1 рази (р<0,05) і 1,2 рази (р<0,05) відповідно. Підвищена НАДН- КоQ-оксидоредуктазна активність, яка спостерігається поряд зі зниженням сукцинат-КоQ-оксидоредуктазної активності вказує на накопичення на даному етапі проміжних електрон- транспортуючих сполук, таких як окиснений убіхінон. Через зниження активності ІІ комплексу убіхінон не може передати електрон далі і тому віддає його молекулі кисню, в результаті чого утворюється супероксид аніон. Результатом цього може бути розвиток окисного стресу.

Таблиця 1. Ферментативна активність комплексів ЕТЛ за умов дієт-індукованого стеатогепатозу у мітохондріях гепатоцитів щурів

* - р<0,05, ** - р<0,01 - у порівнянні з контрольною групою

На етапі передачі електрона між ІІІ і IV комплексом та за умов паралельного зниження Н+ - АТФазної активності відбувається синтез супероксид аніону, а не АТФ. Літературні дані вказують, що подібні зміни у функціонуванні ЕТЛ можуть відбуватись за умов розвитку стеатогепатозу, спричиненого надходженням великої кількості вуглеводів і ліпідів, що узгоджується зі змодельованими нами умовами [16]. Основуючись на характері змін функціонування дихального ланцюга ми можемо припустити розвиток окисного стресу через накопичення проміжних електрон-транспортуючих сполук при такій функціональній активності ЕТЛ та при умові надмірного надходження ліпідів і вуглеводів.

Нами було встановлено зниження активності ферментативної складової всіх комплексів ЕТЛ за умов розвитку глутамат-індукованого сте- атогепатозу (табл. 2). Так, НАДН- КоQ-оксидоредуктазна активність знижується у 2,3 рази (р<0,01), сук- цинат-КоQ-оксидоредуктазна активність у 1,1 рази (р<0,05); КоQ-цитохром с-оксидоредуктазна активність - у 2,3 рази (р<0,01); цитохромоксидазна активність - у 3,3 рази (р<0,001) і Н+ - АТ- Фазна активність - у 3,3 рази (р<0,001). Отримані дані показують зниження активності всіх комплексів ЕТЛ та відповідне зменшення синтезу АТФ за умов розвитку стеатогепатозу під впливом ГН.

Літературні дані вказують, що за умов глутамат-індукованого ожиріння у сироватці крові підвищується рівень тригліцеридів та холестеролу, а також спостерігається простий стеатоз [17].

Як видно з отриманих нами даних, за таких умов ми спостерігали падіння ферментативної активності всіх комплексів ЕТЛ і Н⁺-АТФазної активності, що узгоджується з описаними у літературі даними про стан дихального ланцюга та рівня АТФ у інтактних міто- хондрій гепатоцитів за умов розвиткуФерментативна активність комплексів ЕТЛ за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу у мітохондріях гепатоцитів щурів вісцерального глутамат-індукованого ожиріння і НЖХП [18].

Таблиця 2

1. Medina J., Fernandez-Salazar L.I., Garcia-Buey L. et al. Approach to the pathogenesis and treatment of Non-alcoholic steatohepatitis // Diabetes Care. - 2004. - Vol. 27, №8. - P. 2057-2066.

2. Pereira-Lancha L.O., Campos-Ferraz P.L., Lancha A.H. Obesity: considerations about etiology, metabolism, and the use of experimental models // Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targed and Therapy. - 2015. - Vol. 5. - P. 75-87.

3. Franca M.L., Costa Freitas L.N., Chagas V.T. et al. Mechanisms underlying hypertriglyceridemia in rats with monosodium L-glutamate-induced obesity: evidence of XBP-1/PDI/MTP axis activation // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2014. - Vol. 443. - P. 725-730.

4. Moreau F., L. Claude. Isolement et Proprietes des Membranes Externs et Internes de Mitochondries Vegetales // Biochimie. - 1972. - Vol. 54. - P. 1335-1348.

5. Engel W. D., Schagger H., Jagow G. V. Ubiquinol-cytochrome c reductase. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1980. - Vol. 592 - P. 211-222.

6. Paradies G. Paradies V. Ruggiero F.M. et al. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease // World Journal of Gastroenterology. - 2014. - Vol. 20(39). - P. 14205-14218.

7. Pessayre D. Role of mitochondria in non-alcoholic fatty liver disease // Journal of Gastroenterology and Hepatology. - 2007. - Vol. 22. - P. S20-S27.

8. Quines C.B., Rosa S.G., Chagas M.N. et al. Homeostatic effect of p-chloro-diphenyl diselenide on glucose metabolism and mitochondrial function alterations induced by monosodium glutamate administration to rats // Amino Acids. - 2016. - Vol. 48(1). - P. 137-148.

9. Методы биохимических исследований / Под ред. Прохоровой М.Н. - Л.: Изд-во Ленинград.ун-та. 1982. - С. 207 - 212.

10. Oliveira M. L., Ishii-Iwamoto E. L. Yamamoto N. S. et al. Liver mitochondrial function and redox status in an experimental model of non-alcoholic fatty liver disease induced by monosodium L-glutamat in rats // Experimental and Molecular Pathology. - 2011. - Vol. 91. - P. 687-694.

11. Петренко А. Ю. Выделение гепатоцитов крыс неферментативным методом: детоксикационная и дыхательная активности / А. Ю. Петренко, А. Н. Сукач, А. Д. Росляков // Биохимия. - 1991. - Т. 56, № 9. - С. 1647 - 1650.

12. Ardail D., Privat J.P., Erget-Charlier M. et al. Mitochondrial contact sites // The Journal of Biochemistry, - 1990, - Vol. 265, - P. 18797-18802.

13. Покровский А.А., Мальцев Т.Ю. Особенности переноса электронов в митохондриях слизистой желудка // Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов. - Москва, «Наука». - 1977. - 160 с.

14. Пикулев А.Т., Дисько Н.А., Кукулянская М.Ф. и др.. Некоторые итоги изучения механизмов нарушения азотистого и энергетического обмена при воздействии на організм различных видов ионизирующего излучения // Методы биохимических исследований. - Л. 1982. - С. 49-55.

15. Gusdon A.M., Song K., Qu S. Nonalcoholic fatty liver disease: pathogenesis and therapeutics from a mitochondria - centric perspective // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2014. - Vol. 2014. - P. 1-20.

16. Rolo A.P., Teodoro J.S., Palmeira C.M. Role of oxidative stress in pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis // Free Radical Biology and Medicine. - 2012. - Vol 52. - P. 59-69.

17. Jiang Y., Zhao M., An W. Increased hepatic apoptosis in high-fat diet-induced NASH in rats may be associated with downregulation of hepatic stimulator substance // Journal of Molecular Medicine. - 2011. - Vol. 89(12). - P. 1207-1217.

18. Kondro M., Mykhalchyshyn G., Bodnar P., et al. Metabolic profile and morpho-functional state of the liver in rats with glutamate-induced obesity// Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences. -2013. - Vol. 26(4). - P. 379-381.

19. Hainer V Pathophysiologic preconditions of obesity / V. Hainer // Internal. Medicine. - 2009. - VOL. 4 - NO. 16. - P.

20. Kopelman P. G. Obesity as a medical problem / P. G. Kopelman // Nature. - 2000. - VOL. 404 - P. 635-643.

Размещено на Allbest.ru