Моделирование стимуляции тимоцитов эритропоэтином в зависимости от исходного потенциала митохондрий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Российский Университет Дружбы Народов

Факультет физико-математических и естественных наук

Направление: Физика

Специальность: Теоретическая и математическая физика

Кафедра теоретической физики и механики

Выпускная работа на степень бакалавра

«Моделирование стимуляции тимоцитов эритропоэтином в зависимости от исходного потенциала митохондрий»

Студентка: Медведева Дарья Игоревна

Гр. НФ-401

Страна: Россия

Научный руководитель: к.б.н., доц. Морозова Галина Ивановна

Заведующий кафедрой: д.ф.-м.н., проф. Рыбаков Юрий Петрович

Москва 2016



Введение

Рекoмбинантный эритрoпoэтин челoвека (ЭПО) представляет собoй oчищенный гликoпротеин, кoтoрый стимулирует эритрoпoэз, избирательнo вoздействуя на митoз и дифференцирoвку клетoк-предшественникoв эритрoцитов, не влияя существеннo на лейкoпоэз. Результаты применения ЭПО в клинике и oпыты не дают однoзначного oтвета о супрессoрном или стимулирующем эффекте ЭПО на лимфoциты. Однако, в опытах на тимоцитах крыс ин витро с помощью потенциал чувствительного зонда-катиона ДСМ выявлен достоверный стимулирующий эффект на митохондрии примерно в 25% клеток [Морозова Г.И., Пархоменко Т.В и др., 2007]. Причем, эффективность этой реакции зависит от исходного физиологического состояния тимусов и клеток, прежде всего от митохондриальной активности тимоцитов: их протонного потенциала и числа активных митохондрий. ЭПО не является специфическим гормоном для лимфоцитов и поэтому его эффект может отражать побочное стимулирующее действие на энергетику митохондрий зрелых (наивных) лимфоцитов, сопряжённое с возбуждением мембранной поверхности и движением клетки.

В связи с этим актуальна проблема моделирования механизма стимулирующего действия гормона ЭПО на тимоциты, зависящего от исходной энергетической активности митохондрий.

С целью решения этой проблемы в работе сопоставляются известные механизмы действия различных гормонов, типы мембранной рецепции, связь цитоскелета , как сигнальной структуры, с плазматической мембраной и с митохондриями, механизмы активации кальциевых насосов, запускающих стимуляцию клеток, в том числе влияющих на подвижность Т-лимфоцитов.

В свете современных данных становится всё более значимой роль митохондриального электрокабеля (МЭК) в обеспечении дистанционного распространения изменения протонного потенциала в различных клетках, синхронного с автоволновыми механическими процессами - сокращения миофибрилл, элементов цитоскелета или псевдоподий в клетках.

В представленной работе моделируется механизм ЭПО-стимуляции тимоцитов, рассматриваемый как процесс волнового возбуждения мембранной поверхности клетки, сопряжённый с сокращением филаментов цитоскелета и с проведения протонного потенциала (ПП) в системе митохондриального электрокабеля (МЭК) тимоцита (на основе телеграфного уравнения). Запуск этого процесса и конечный эффект зависит от исходного уровня энергетики митохондрий в зрелых тимоцитах и концентрации ЭПО.



1. Основные механизмы взаимодействия гормонов с клетками

1.1 Типы гормонов

Все известные гормоны действуют путем изменения активности внутриклеточных ферментов и по механизму действия подразделяются на 3 группы: гормоны, изменяющие активность внутриклеточных ферментов путем их модификации. Эти гормоны связываются с рецепторами, расположенными на поверхности клеток и действуют через вторичные посредники (мессенджеры): могут оказывать действие, активируя аденилатциклазу, т.е. (повышают уровень цАМФ), через циклический ГМФ через ионы кальция и фосфатидилинозитол [3,28].

Гормоны, изменяющие активность внутриклеточных ферментов путем изменения скорости синтеза ферментов. Эти гормоны связываются с внутриклеточными рецепторами: цитозольными, ядерными или рецепторами органоидов. Гормоны, изменяющие активность внутриклеточных ферментов путем изменения проницаемости плазматической мембраны. Эти гормоны связываются с рецепторами плазматических мембран и свое действие опосредуют через вторичные посредники, преимущественно с использованием тирозинкиназно-фосфатазной системы. При этом происходит изменение активности внутриклеточных ферментов за счет повышения концентрации субстратов, активации белков-транспортеров и ионных каналов. К такому типу гормонов относится эритропоэтин.

Большинство гидрофильных сигнальных веществ не способны проходить через клеточную мембрану. Поэтому передача сигнала в клетку осуществляется через мембранные рецепторы [3].

1.2 Типы рецепции

Рецепторы -- это интегральные мембранные белки, которые связывают сигнальные вещества на внешней стороне мембраны и за счет изменения пространственной структуры генерируют новый сигнал на внутренней стороне мембраны. Данным сигналом определяется транскрипция определенных генов и активность ферментов, которые контролируют обмен веществ и взаимодействуют с цитоскелетом [1,3]. Связывание сигнального вещества с мембранным рецептором влечет за собой один из трех вариантов внутриклеточного ответа: рецепторные тирозинкиназы активируют внутриклеточные протеинкиназы, активация лиганд-активируемых ионных каналов ведет к изменению концентрации ионов и активация рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, индуцирует синтез веществ-посредников, вторичных мессенджеров. Все три системы передачи сигнала взаимосвязаны.

Механизмы рецепторной реакции на поверхности клетки и внутренняя сигнализация.

1.2.1 Преобразование сигнала G-белками

G-белки переносят сигнал с рецептора третьего типа на белки-эффекторы. Они построены из трех субъединиц: б, в и г. б-cубъединица обладает свойством связывать гуаниновые нуклеотиды .Белок проявляет слабую ГТФ-азную активность. В неактивном состоянии G-белок связан с ГДФ.

При связывании сигнального вещества с рецептором третьего типа, конформация последнего изменяется таким образом, что комплекс приобретает способность связывать G-белок. Ассоциация G-белка с рецептором приводит к обмену ГДФ на ГТФ. При этом происходит активация G-белка, он отделяется от рецептора и диссоциирует на б-субъединицу и в,г-комплекс. ГФЦ-б субъединица связывается с белками-эффекторами и изменяет их активность, в результате чего происходит открывание или закрывание ионных каналов, активация или ингибирование ферментов [3].

1.3 Вторичные мессенджеры и механизмы их действия

Вторичные мессенджеры или посредники, это внутриклеточные вещества, концентрация которых строго контролируется гормонами, нейромедиаторами и другими внеклеточными сигналами. Такие вещества образуются из доступных субстратов и имеют короткий биохимический полупериод.

Наиболее важными вторичными мессенджерами являются циклические АМФ и ГТФ, Са²⁺, инозит-1,4,5-трифосфат, диацилглицерин и монооксид азота (NO). Один и тот же гормон может действовать и через ц-ГМФ, и через ц-АМФ.

1.3.1 Кальций-кальмодулиновая система

Концентрация ионов Са²⁺ в цитоплазме не стимулированной клетки очень низка (10-100 нМ). Внутри клетки ионы Са²⁺ депонируются в матриксе митохондрий и эндоплазматическом ретикулуме. Резкое повышение концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме (до 500-1000 нМ) происходит в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума). Открывание каналов может быть вызвано деполяризацией мембран или действием сигнальных веществ, нейромедиаторов, вторичных мессенджеров (ИФ₃ и цАМФ). Действие кальция опосредовано специальными Са²⁺-связывающими белками, к которым принадлежат аннексин, кальмодулин и тропонин Са²⁺, поступающий в цитоплазму из внешней среды или из внутриклеточных депо, взаимодействует с Са²⁺-зависимой кальмодулинкиназой.

Кальмодулин -- сравнительно небольшой белок (17 кДа) -- присутствует во всех животных клетках. При связывании четырех ионов Са²⁺ кальмодулин переходит в активную форму, способную взаимодействовать с многочисленными белками.

Известно, что кальмодулин имеет несколько центров (до 4-х) для связывания с ионами кальция или магния. В покое кальмодулин связан с магнием, при увеличении концентрации кальция в клетке, кальций вытесняет магний. Кальмодулин является регуляторной субъединицей не только Са²⁺-зависимой кальмодулинкиназы, но и других кальций связывающих ферментов и белков. При незначительном увеличении концентрации кальция образуется комплекс Са²⁺-Mg²⁺-кальмодулин, который активирует аденилатциклазу. При значительном увеличении кальция образуется комплекс 4Са²⁺-кальмодулин, который активирует гуанилатциклазу и фосфодиэстеразу цАМФ. За счет активации кальмодулина ионы Са²⁺ оказывают влияние на активность ферментов, ионных насосов и компонентов цитоскелета [1,3].

Действие гормонов через ионы кальция часто сочетается с использованием в качестве посредника производных фосфатидилинозитола. Рецептор в таких случаях находится в комплексе с G-белком и при взаимодействии рецептора с гормоном (например, ТТГ, пролактин, СТГ) происходит активация мембран связанного фермента - фосфолипазы С, которая ускоряет реакцию распада фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата с образованием ДАГ и JР_3. Липофильный ДАГ остается в мембране и активирует протеинкиназу C, которая в присутствии Са²⁺фосфорилирует различные белковые субстраты, модулируя их функциональную активность.



Схема передачи сигналов внутрь клетки вторичными мессенджерами

1.4 Механизм работы и энергетика кальциевых каналов при стимуляции клеток

Транспортные АТФазы называют ионными насосами поскольку они переносят дискретные частицы -- ионы. Каждый цикл переноса включает в себя как минимум три стадии: 1) частицу надо захватить с одной стороны мембраны, 2) перенести ее через мембрану (транслоцировать) и 3) выпустить с другой стороны. Осуществление этих стадий сопряжено с расходом энергии, и, следовательно, одновременно что-то должно происходить с АТФ. Сама молекула АТФ тоже должна быть захвачена (1) и гидролизована с запасанием энергии и расходом ее на перенос кальция (2), а продукты (АДФ и фосфат) должны перейти из связанного с ферментом состояния в водный раствор (3). В каждом цикле фермент одновременно использует не один, а два субстрата (внутриклеточный кальций и АТФ) и образует три продукта: кальций, накопленный внутри везикул эндоплазматического ретикулума, АДФ и ортофосфат. Усилиями многих ученых была в общих чертах расшифрована последовательность стадий при работе Ca-АТФазы, которая включает в себя все перечисленные выше этапы. Работа насоса замечательна еще и тем, что стадии переработки АТФ как бы чередуются со стадиями переноса Ca²⁺. Эти стадии перечислены ниже:

связывание двух ионов кальция на поверхности АТФазы, обращенной в цитоплазму (или наружу в изолированных пузырьках СР);

связывание на той же поверхности молекулы АТФ;

фосфорилирование белка (образование фосфофермента) и высвобождение АДФ; высвобождение ионов кальция с поверхности АТФазы, обращенной внутрь пузырьков СР; связывания магния;

гидролиз фосфатной связи и отщепление ионов магния;

Работа кальциевых насосов требует определённой энергии, которая выделяется в результате обратимой реакции гидролиза АТФ:

АТФ+Н₂О - ДG - АДФ+ Ф_Н^- +Н ⁺ (1)

Гидролиз АТФ осуществляется Са²⁺-АТФазой в три этапа. В начале происходит связывание АТФ, затем фосфорилирование белка и отщепление АДФ и, наконец, гидролитическое расщепление белок-фосфатной связи и высвобождение ортофосфата. Фосфорилирование осуществляется по карбоксильной группе остатка аспарагиновой кислоты.

Стадия эта обратима: добавив к изолированным везикулам эндоплазматического ретикулума, содержащим фермент-фосфат (Е~ Р), АДФ в присутствии 1 мМ Са ²⁺, можно наблюдать почти полный перенос фосфата с белка на АДФ с образованием АТФ. Таким образом, в мембранах СР существует равновесие:

К₀ K_ph

,(2)

где К₀ -- константа связывания ионов кальция на АТФазе у наружной поверхности мембранных везикул СР, а K_ph -- константа равновесия реакции фосфорилирования. Последняя величина близка к единице.

Известно четыре основные системы активного транспорта ионов в клетке, три из которых обеспечивают перенос ионов К⁺ , Са ²⁺ и Н⁺ через биологические мембраны за счет энергии гидролиза АТФ специальными ферментами-переносчиками, которые называются транспортными АТФ-азами).

Четвертый механизм -- перенос протонов при работе дыхательной цепи митохондрий пока изучен недостаточно. Наиболее сложно из транспортных АТФ-аз устроена Н -АТФ-аза, состоящая из нескольких субъединиц, а самая простая -- Са ²⁺ -АТФ-аза, состоящая из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 100 000.

Рассмотрим механизм переноса ионов кальция этой АТФ-азой.

Активный перенос ионов кальция через биомембрану

Первый этап работы Ca ²⁺ - АТФ-азы -- связывание субстратов: Са ²⁺ и АТФ в комплексе с Мg (Мg²+-АТФ). Эти два лиганда присоединяются к разным центрам на поверхности молекулы фермента, обращенной наружу мембранного пузырька. Высокая константа связывания Ca²+ (порядка 10 ккал/моль) свидетельствует о том, что при связывании этого иона высвобождается большое количество энергии.

Для того чтобы перенести через мембрану 2 грамм-эквивалента ионов кальция из клеточного сока, где его концентрация C_i = 1 * 10⁷ М, во внутреннюю полость СР, где концентрация кальция близка к 1 мМ (C₀ = 1 * 10³М), требуется затратить энергию, равную:

(3)

где-- изменение свободной энергии при переносе одного моля одновалентного иона (электрохимический потенциал), -- изменение энергии за счет взаимодействия одного моля ионов с окружающей средой (химическое сродство), R-- газовая постоянная, T-- абсолютная температура, RTln(Ci/C₀) -- изменение энергии моля ионов при изменении его концентрации, z-- валентность иона, F-- число Фарадея (заряд одного моля одновалентного иона),-- разность электрических потенциалов на мембране,-- изменение энергии моля ионов за счет перемещения в электрическом поле.

Поскольку внутри мембранных везикул СР потенциал равен внутриклеточному ( = 0), а величина С₀ примерно одинакова для ионов кальция в водных растворах= 0), можно считать, что изменение свободной энергии при переносе двух молей равно при 37° С :

?G= 2RTln(Ci/ C₀) = 47,5 кДж/моль (4)

Это приблизительно равно энергии гидролиза макроэргической связи АТФ при физиологических концентрациях АТФ, АДФ и ортофосфата. Таким образом, транспорт кальция через мембрану саркоплазматического ретикулума осуществляется с высоким коэффициентом полезного действия, почти без потерь энергии. Помимо прочего это предполагает обратимость работы Ca²+-АТФазы. И действительно, было показано, что можно получить синтез АТФ из АДФ и фосфата, если нагрузить изолированные везикулы СР кальцием, а затем убрать кальций из окружающей среды, добавив туда комплексон -- соединение, связывающее Ca²⁺. Заметим, что обратимо могут работать также и другие транспортные АТФазы: Na/K-АТФаза цитоплазматических мембран и Н+ - АТФаза митохондрий [2,17].



2. Характеристика гормона ЭПО и механизмов его взаимодействия с рецепторами разных клеток

Эритропоэтин является гликопротеиновым гормоном, который продуцируется в мозге, матке и почках, и является одним из эффективных при лечении почечных анимий. Эритропоэтин, как выяснилось, оказывает свои эффекты путём связывания с рецептором эритропоэтина (EpoR). Дополнительное гликозилирование или другие изменения ЭПО за счёт рекомбинантной технологии привели к повышенной устойчивости ЭПО в крови (что требует менее частые инъекции).

Рекомбинантный эритропоэтин человека (ЭПО) представляет собой очищенный гликопротеин, который стимулирует эритропоэз, избирательно воздействуя на митоз и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов, не влияя существенно на лейкопоэз.

ЭПО связывается с рецептором эритропоэтина на поверхности предшественников красных кровяных клеток, активируя при этом сигнальный каскад JAK2 через активацию тирозинкиназы, которая в свою очередь фосфорилирует собственные тирозиновые остатки и тирозиновые остатки рецептора гормона роста. Эти тирозины формируют сайты связывания для некоторых сигнальных белков - членов семейства STAT. Среди известных сигнальных молекул, участвующих в сигналинге от гормона роста, именно белки STAT5 играют чрезвычайно важную роль в регуляции транскрипции. В ядре фосфорилированный STAT5 связывается с промоторами таргетных генов.



Обобщённая схема механизма активации гормоном ядерных процессов и синтеза белков.

По мере приближения клеток к терминальным стадиям эритроидной дифференцировки снижается их чувствительность к гормону, что свидетельствует о том, что ЭПО выступает в роли триггера, запускающего процесс эритроидной дифференцировки. Кроме того, установлено, что эритропоэтин - рецепторные взаимодействия носят строго специфический характер.

Но экспрессия рецепторов эритропоэтина происходит и в ряде тканей, таких как костный мозг и периферическая / центральная нервная ткань.

Эритропоэтин проявляет ряд действий, включая гипертензию, зависимую от сужения сосудов, стимулирование ангиогенеза, включая пролиферацию гладкомышечных волокон. Были выявлены уровни ЭПО, превышающие в 100 раз базовый уровень в тканях головного мозга в качестве естественной реакции на гипоксическое повреждение. Многочисленные исследования показали, что ЭПО улучшает память, воздействия на нейронную пластичность.

В то же время обнаружены его антиоксиданные свойства, обеспечивающие защиту митохондрий, торможение апоптозных повреждений. Поэтому ЭПО иногда используют как допинг. Применение эритропоэтина в суммарной дозе 1500 МЕ/кг приводит к частичному или полному восстановлению количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза. Имеются данные о влиянии ЭПО на миграцию макрофагов. лейкоцитов, на усиление их выхода в кровь при некоторых патологиях [16,28,29]. Следовательно, можно предположить, что ЭПО через рецепцию может вызывать процессы сокращения элементов цитоскелета в таких клетках,усиливая их подвижность.

Ряд экспериментов свидетельствуют о его стимулирующем действии на митохондрии разных клеток. Но механизм этого действия может быть связан не только с анитиоксидантными свойствами ЭПО, как мы увидим далее.

Существенную энергизацию митохондрий в тимоцитах крыс наблюдали в экспериментах с флуоресцентным зондом-катионом ДСМ [25 ]

2.1 Стимулирующие эффекты гормона эритропоэтина в тимоцитах, выявляемые по флуоресценции зонда катиона ДСМ в митохондриях

Тимус - первичный лимфоидный орган, в котором образуются Т-клетки, контролируется гормонами. Данные, полученные на животных моделях, свидетельствуют о множественном воздействии гормонов белковой и небелковой природы на тимус: они модулируют пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптотическую гибель развивающихся тимоцитов. Например, гормон роста и пролактин могут усиливать пролиферацию и миграцию тимоцитов. С возрастом тимус подвергается прогрессирующей атрофии с потерей числа генерируемых и экспортируемых клеток

В экспериментах Морозовой Г.И с соавторами [25], исследовали воздействие рекомбинантного ЭПО (НПО «Микроген») на лимфоциты, выделенные из 27 тимусов белых беспородных крыс, по флуоресценции витального зонда 4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ). Как видно из эффектов на Рис 5.1, в трех разных образцах тимоцитов из разных тимусов, в присутствии ЭПО, наблюдается увеличение уровня флуоресцентного сигнала ДСМ внутри митохондрий (F) клеток (при добавлении в среду зонда в концентрации 0.5 мкМ). Измерения величины лежат в интервале от 10 до 25 единиц, что составляет относительному приросту сигнала на 20%, 85% и 57% для первого, второго и третьего образца соответственно. Максимум флуоресценции в клетках достигается в ~20% клеток (в случае тимуса I), 85% (в тимусе II) и 57% клеток (в тимусе Ш). При этом во всех образцах происходит преимущественный сдвиг кривых вправо. Как можно видеть на рис. (кривая II), клетки из этого тимуса имеют и наиболее высокий уровень исходного флуоресцентного сигнала.

Согласно этим данным, знак флуоресцентного эффекта ДСМ в клетках, полученных из разных тимусов, может изменяться на противоположный уже при С _ЭПО > 20 U/мл, хотя в большинстве опытов этот эффект выявляется при концентрации С _ЭПО > 200 U/мл.

Типичные кривые «доза-эффект» влияния ЭПО на тимоциты крыс, выявляемого по изменению средней интенсивности митохондриальной флуоресценции ДСМ в клетке (ДF) относительно ее контрольного значения. Прединкубация клеток с ЭПО - 30 мин (при 37є С), концентрация ДСМ - 0.5 мкМ

2.2 Проблема зависимости флуоресцентных эффектов ЭПО в тимоцитах от их исходного энергетического состояния

Статистический анализ результатов цитофлуориметрии показал, что разброс экспериментальных данных в опытах с клетками из разных тимусов существенно больше при инкубации тимоцитов с ЭПО (диапазон значений F: 50-100) по сравнению с контрольными данными (диапазон значений F: 2-20).



Показатели интенсивности ДСМ в митохондриях и числа энергизированных митохондрий (на клетку) в разных тимусах после их прединкубации с ЭПО (20U/мл).

Для этой серии экспериментов определены коэффициенты прямой корреляции между F и N_m. Обнаружено, что в контрольных образцах флуоресцентный полный сигнал от клетки прямо коррелирует с числом флуоресцирующих (энергизированных) митохондрий (оценка для массива окрашенных клеток: r= 0.9 при Р<0.001), а при добавлении к клеткам ЭПО эта связь нарушается ( r = 0.66 при Р<0.01) (нелинейный эффект).

Из результатов этих экспериментов следует, что чем выше исходная способность тимоцита накапливать зонд-катион ДСМ в митохондриях, тем сильнее стимулирующий эффект ЭПО: увеличение числа энергизированных митохондрий в клетке [25].

Чтобы объяснить механизм такой ЭПО-стимуляции, необходимо рассмотреть вопросы, связанные со свойствами митохондрий и митохондриального электрокабеля (МЭК), а так же роль цитоскелета в сигнальной реакции.



3. Взаимодействие цитоскелета с плазматической мембраной и его сигнальная роль в клетке

В цитоплазме были обнаружены сложные структуры, образующие цитосклет [1]. Выяснилось, что тяжи цитоскелета построены в основном из тонких (диаметром 7 нм) актиновых филаментов и длинных, толстых (диаметром 25 нм) и жестких микротрубочек, состоящих из a- и b-тубулина. Эти белки оказались очень лабильными, способными формировать легко изменяющиеся динамичные пространственные структуры. В частности, глобулярные белки актина не только легко и быстро полимеризуются в длинные вытянутые нити - филаменты. Они взаимодействуют с целым набором других вспомогательных белков, в результате чего возникает определенным образом организованная пространственная сеть филаментов.

Организация глобулярных молекул актина в актиновом филаменте.

Белки цитоскелета принимают деятельное участие в движении клетки, поскольку для его осуществления требуется постоянное изменение ее формы. Мышечное сокращение, амебоидное движение, перешнуровывание клетки во время деления, фагоцитоз основаны на взаимодействии актина и миозина, а биение ресничек и жгутиков сперматозоидов происходит благодаря скольжению микротрубочек друг относительно друга.

Цитоскелет образует многочисленные контакты с клеточной мембраной; предполагается, что с цитоскелетными элементами взаимодействуют определенные мембранные белки. Упорядоченное взаимодействие с определенными участками мембраны обнаруживают как микрофиламенты, так и микротрубочки. Большинство актиновых филаментов присоединяется к мембране своим быстро растущим концом.

Взаимодействие микротрубочек с мембраной наблюдается у цитотоксических лимфоцитов. Эти «клетки-убийцы» ориентируются по отношению к мишени так, чтобы их ЦОМТ были обращены к месту контакта. В клетках может возникать и поддерживаться асимметричное распределение многих компонентов мембраны. Примером может служить образование кепов в лимфоцитах, которое изучено уже в деталях [19]/ Быстрое образование кепов из комплексов лиганд -- рецептор требует энергии и присутствия кальция во внеклеточной среде. Клетки с такими кепами уже не остаются сферическими и симметричными. Под тем местом, где скапливаются комплексы лиганд--рецептор, располагаются актин, миозин, кальмодулин, а-актинин и киназа легкой цепи миозина. Миозин в этом районе уже фосфорилирован, т. е. в большей степени готов к участию в сокращении. Простое объяснение описанных явлений состоит в том, что в клетках, активно образующих кепы, комплексы лиганд--рецептор втягиваются с помощью сократительного аппарата в район кепа. В других асимметричных клетках, например, во время фагоцитоза, хемотаксиса или цитотоксического действия под агрегатами комплексов лиганд--рецептор видны плотные скопления микрофиламентов. Для объяснения всего этого можно предположить, во-первых, что на поверхности клетки возникает и движется, как волна, локальная деформация, в районе которой мембрана отличается по своим характеристикам, таким, как микровязкость и поверхностное натяжение, от остальной клеточной мембраны, и, во-вторых, что разные мембранные белки реагируют на такую волну по-разному: на одни она никак не влияет, а другие захватываются волной и движутся вместе с ней по направлению к областям скопления подмембранных микрофиламентов. Волны действительно видны на поверхности клеток. Они возникают, вероятно, в результате генерируемого микрофиламентами сокращения.

Диапазон возможных перестроек мембраны зависит от состояния клетки, он существенно ограничен во время митотического деления клеток, а также в клетках, у которых подвижность значительной доли мембранных белков подавлена.

Осуществляемое в результате такого движения перераспределение компонентов мембраны может изменять сродство поверхностных рецепторов клетки к соответствующим лигандам. А вызываемая движением на поверхности перестройка цитоскелета может выполнять функции сигнала, идущего к внутренним областям клетки [1, 3].

Просматривается аналогия устройства цитоскелета с сетью паутины, если учесть, что микротрубочки и промежуточные филаменты тянутся от ядра к периферии клетки [36] .

Митохондрии и лизосомы передвигаются в клетке не случайным образом, а вдоль микрофиламентов и могут образовывать разветвлённые цепочки.



4. Митохондрии и энергетический ресурс аэробных клеток

4.1 Строение митохондрий

Митохондрии представляют собой небольшие органеллы овальной формы с диаметром порядка 1мкм, их количество в клетке может достигать 2000. Митохондрии защищены двумя мембранами: наружной и внутренней.

Строение митохондрии

Внутренняя мембрана имеет многочисленные глубокие складки (грибневидные выросты), называемые кристами, которые значительно увеличивают её поверхность. Пространство, ограниченное внутренней мембраной, называют матриксом. Мембраны митохондрий сильно различаются по составу и функциям. Наружная мембрана митохондрий легко проницаема для большинства веществ с молярной массой 10000 и ниже. Внутренняя мембрана для многих соединений не проницаема. Эта мембрана, как ни одна другая богата белками, их содержание достигает 80%. Внутренняя мембрана, так как в ней локализованы ферменты переноса электронов, является сопрягающей мембраной, для которой справедлива химио-осматическая концепция сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования Р.Митчелла (1961) [ 33, 34].



4.2 Механизм генерации протонного потенциала на мембранах митохондрий

Митохондрии являются энергетическим станциями аэробных клеток, которые способны синтезировать макроэргические молекулы АТФ, энергия которых используется для обеспечения различных процессов в клетках. На внутренних мембранах митохондрий (кристах) работает дыхательная цепь, в которой электроны переносятся от субстратов (поставляемых циклом Кребса) к кислороду и идет реакция:

2 Суб-Н₂+О₂= Суб+Н₂О

Главными субстратами окисления являются: никотинамидадениннуклеотид /фосфат/-Н/НАДФН/, никотинамидадениндинуклеотид-Н/НАДН/ и сукцинат . Эти вещества в самой общей форме можно описать как водород (Н) , присоединенный к молекулам субстрата Суб-Н₂.

Основным положением концепции Митчелла является включение стадии трансформации энергии окисления в разность электрических потенциалов и (или) градиент осмотической концентрации ионов на сопрягающей мембране. Эта гипотеза разработана Митчеллом в 1961 - 1966 гг. она постулировала существование градиента электрохимического потенциала ионов водорода (?µ) на мембранах, способных к дыхательному или фотосинтетическому фосфорилированию. Согласно гипотезе Митчелла роль дыхательной и фотосинтетической редокс - цепей в синтезе АТФ сводится к образованию градиента электрохимического потенциала, после чего энергия электрического поля используется для обращения АТФазной реакции. ?µ удовлетворяет следующим требованиям:

1) ?µ может генерироваться редокс - цепью в отсутствие АДФ и Н_зРО₄;

2) ?µ - общий продукт прямого переноса электрона через пункты энергетического сопряжения и стало быть ответственный за обмен энергией между этими пунктами;

3) ?µ поддерживает перенос ионов через сопрягающую мембрану;

4) ?µ снижается разобщителями - протонофорами.

Иллюстрации к хемиоосматическом механизму Митчелла

Донор водорода (ДН) окисляется переносчиком электронов у внешней стороны мембраны. При этом 2Н⁺ остаются снаружи мембраны, а два электрона 2 е переносятся на другую её сторону по цепи, ориентированной поперёк мембраны. Локализованный там переносчик электронов передаёт их акцептору ионов водорода - соединению А, который присоединяет 2Н⁺ из водной фазы внутреннего пространства, отделённого мембраной. Таким образом окисление одной молекулы ДН посредством А приводит к выделению 2Н⁺ во внешнее пространство и поглощение 2Н⁺ из внутреннего пространства (на схеме это участок 1). Следовательно, на мембране возникает электрическое поле. Если рассмотреть митохондриальную мембрану и путь прохождения электронов от аскорбата до кислорода, то донором ионов Н является аскорбат, а соединение А в схеме - это молекулярный кислород.

В митохондриях синтез одной молекулы АТФ из АДФ и Ф приводит к выделению 2Н⁺ в матрикс и поглощению 2Н⁺ из вне митохондриального пространства (на схеме это участок 2). Таким образом, фосфолирующий механизм использует градиент ионов Н⁺, создаваемый работой дыхательной цепи. По мнению В.П. Скулачева [34], схему, где изложены основные принципы теории Митчелла, правильнее было назвать «протонным циклом».

На первом этапе осуществляется перенос Н⁺ против электрохимического градиента за счёт внешнего источника энергии. Созданный таким образом запас энергии в форме электрического поля и градиента рН потом используется в основном для синтеза АТФ (2 этап).

На схеме Митчелла дыхательная цепь митохондрий действует как электрический топливный элемент, который превращает энергию химической (окислительной) реакции в энергию электрического поля. Трансмембранный перенос должен заряжать сопрягающую мембрану, которую в этом случае можно сравнить с конденсатором. Разность электрических потенциалов между двумя обводненными пространствами, разделёнными мембраной, должна быть достаточной для энергообеспечения реакции фосфолирования.

Если синтез одной молекулы АТФ сопряжён, как установлено экспериментально, с переносом двух зарядов для каждого места фосфолирования, то необходимый мембранный потенциал оценивается величиной не менее 0,2В (изменение свободной энергии реакции фосфолирования принято 42кДж/моль АТФ). Это означает, что при толщине мембраны порядка 10 нм напряжённость электрического поля в ней должна составить не менее -200 кВ/см.

Во всех живых клетках электрическая форма энергии - обязательный этап на пути образования универсального химического топлива клетки - АТФ, которая используется для всех клеточных химических реакций и для создания истиннных градиентов. Свободная энергия порядка 10 Ккал/моль выделяется при гидролизе АТФ.

АТФ^{4 -}+Н₂О = АДФ^{3 -} + Ф_Н^{3 -} +2Н ⁺

Образуется аденазинфосфатная кислота - АДФ³ , неорганический фосфат Ф_Н и ионы водорода. Эта реакция катализируется в клетках разнымим АТФ-азами.

Энергетический статус живой клетки определяется как числом митохондрий в ней, так и степенью энергизации митохондрий, т.е. значениями их ?ц₂. Чем больше в клетке митохондрий, и чем в ней потенциалы на митохондриях, тем интенсивнее клеточный метаболизм, активнее движение клетки. Число энергизированных митохондрий и характер их распределения в клетках варьируют в зависимости от типа клеток и их функционального состояния. Поэтому суммарная флуоресценция потенциал чувствительных зондов в клетках данного вида фактически отражает ее функциональную активность. Уровень энергизации митохондрий в живой клетке можно оценить методом флуоресцентных зондов [13,14,19.]

Имеются цитологические и биохимические данные о гетерогенности митохондрий в пределах одной ткани и одной клетки, существует целый ряд различий между митохондриями разных клеток, которые никак не могут быть объяснены только различием их энергетических потребностей [37]. В одних клетках митохондрии почти шарообразны и равномерно рассеянны по всей цитоплазме. В других они вытянуты в виде параллельно расположенных цепочек , или образуют ажурные комплексы . Известна высокая реактивность митохондриальных структур в ответ на различные гормональные воздействия; при этих воздействиях может меняться не только характер распределения и форма митохондрий в клетках, но и их энергетическая активность, сопряженная с изменением электрических потенциалов на мембранах митохондрий. Согласно данным электронной микроскопии дифференцированные клетки отличаются характерным распределением в них основного пула митохондрий, сопряженным с типом функциональной активности этих клеток [37]. Так, в мышечных клетках митохондрии образуют длинные цепи, переходящие из одной клетки в другую вдоль миофибрилл, в гепатоцитах митохондрии образуют упорядоченные комплексы около ферментных гранул. В последние годы выявлено различие в распределении митохондрий в субпопуляциях лимфоцитов в зависимости от их специфических функций. Так, для Т-хелперов и В-лимфоцитов характерны цепочечные структуры митохондрий вблизи поверхности, сопряжённые с активацией их движения [22].

Согласно экспериментальным данным митохондрии в различных клетках способны соединяться в связный митохондриальный электрокабель (МЭК) через межмитохондриальные контакты (ММК) высокой проводимости. Концепция о наличии МЭК в клетках, выдвинутая Бубенцером (1966,) была далее развита и обоснована группой российских ученых во главе со Скулачевым В.П. [4,37] в ряде оригинальных экспериментов.

В экспериментах на нитчатых митохондриях использовали лазерный или ультрафиолетовый микролуч, который можно точно направить на избранную экспериментатором митохондрию. При облучении отдельной митохондрии в ней происходит тушение флуоресценции катионного зонда родамина из-за того, что в результате пробоя внутренней мембраны митохондрии разность потенциалов на ней падает и катионы родамина как бы вытекают из матрикса митохондрии. При этом соседние митохондрии не меняют своего свечения и продолжают синтез АТФ. В результате этого вся длинная митохондрия потухла, в то время как соседние оставались без изменений.

Локальное повреждение нитчатой митохондрии микролучом приводит к деэнергизации всей митохондрии: а - вид митохондрий в фазовом контрасте до эксперимента, б - флуоресценция родамина в митондриях этого же участка клетки (стрелка указывает на место лазерного укола), в - тот же участок клетки после локального облучения митохондрии, г - этот же участок в фазовом контрасте

Поражение микролучом участков свободной от НТ цитоплазмы не приводило к тушению митохондрий. Точечный пробой мембран митохондрий приводит к снятию разности потенциала не только в точке пробоя, но и по всей длине митохондрии, которая представляет собой проводник с эквипотенциальной поверхностью. Следовательно, длинные НМ могут представлять собой электрические проводники, могущие передавать разность потенциалов на митохондриальных мембранах на большие расстояния и кооперировать удаленные участки цитоплазмы.

Это значит, что и в случае разветвленных митохондрий в любой ее точке на внутренней мембране может накопиться потенциал, достаточный для того, чтобы начался синтез АТФ. С этих позиций митохондриальный ретикулум (МР) представляет собой как бы электрический проводник, кабель, соединяющий отдаленные точки такой системы.

Митохондриальный ретикулум как электрокабельная система необходим не только для мелких подвижных клеток, но и для более крупных, там, где требуются кооперация и синхронизация в работе многих структурных единиц

4.4 Сопряжение электромеханических процессов и протонного потенциала в МЭК при стимуляции кардиомиоцитов

В работе [30] рассмотрена взаимосвязь между проведением протонного потенциала вдоль МЭК и синхронного процесса сокращения кардиомиоцитов на поверхности сердца в схеме электромеханического сопряжения на основе телеграфного уравнения:

•



Такой же подход можно применить и для не мышечных клеток, например, для тимоцитов, имеющих цепочечные структуры митохондрий.

При воздействии ЭПО на рецепторы тимоцита может быть связано с возбуждением мембранной поверхности и активацией элементов цитоскелета вблизи МЭК.



5. Постановка задачи

В свете вышеизложенного для достижения цели моделирования механизма ЭПО-стимуляции тимоцитов в зависимости от исходного потенциала их митохондрий необходимо решить следующие задачи:

1. Обоснование схемы электромехано-энергетического сопряжения при ЭПО-стимуляции тимоцита на основе:

а) кинетической модели перераспределения ионов кальция в цитоплазме клеток, сопряжённой с изменением ТМП на внешней и митохондриальных мембранах

б) моделирования распространения волны изменения протонного потенциала (ПП) в электрокабеле митохондрий в процессе возбуждения мембранной поверхности тимоцита после ЭПО-сигнала (с использованием телеграфного уравнения).

2. Оценка энергозатрат и порогового уровня энергии АТФ митохондрий, необходимого для запуска первой фазы реакции тимоцита на ЭПО-стимул: активации кальциевых АТФ-аз, сократительных процессов.



6. Моделирование ЭПО стимуляции митохондрий в зависимости от исходного уровня потенциалов в тимоцитах

Исходя их экспериментальных данных с ЭПО и известных механизмов действия гидрофильных гормонов, можно предложить схему для объяснения ЭПО - эффектов в тимоцитах на основе биофизического подхода:

- в первой фазе реакции тимоцитов на связывание ЭПО с рецептором происходит волнообразное возбуждение мембранной поверхности тимоцитов, сопряженное с временной деполяризацией мембраны (быстрый вход Na⁺) и с медленным входом кальция в цитоплазму, который стимулирует выход кальция из депо и связывание его с сократительными структурами ЦС (филаментами) клетки.

- исходя из опытных данных, полагаем, что ЭПО- эффект наблюдается именно в зрелых Т-хелперах ( 25% клеток) тимуса, имеющих цепочечные структуры митохондрий, которые могут энергетически поддержать волну сокращений мембранной поверхности с помощью синхронной волны изменения протонного потенциала (ПП) вдоль цепи митохондрий .

- для обеспечения этого процесса, по-видимому, необходим определённый критический уровень АТФ, который зависит в свою очередь от исходной митохондриальной активности тимоцитов и концентраций внутриклеточного кальция.

6.1 Кинетика перераспределения кальция между цитоплазмой и митохондриями как регулятор проведения стимулирующего ЭПО-сигнала в тимоците

Рассмотрим возможный механизм регуляции проведение ЭПО-сигнала от рецепторов на мембранной поверхности тимоцита внутрь клетки на основе кинетической модели перераспределения кальция внутри клетки с участием других химических посредников.

Процессы регуляции концентрации Са ²⁺ внутри клетки

На основании, изложенного в предыдущих главах, можно считать, что взаимодействие ЭПО с поверхностью тимоцитов происходит и при участии G- белков. Тогда после преобразования сигнала гормона в плазматической мембране - в случае рецепторов, сопряженных с G-белками, - в клетке изменяются концентрации клеточных посредников, таких как цАМФ или , которые в свою очередь влияют на активность соответствующих протеинкиназ. В результате этой цепи процессов происходит каскадное усиление сигнала от гормона: число молекул на каждом этапе возрастает, так что общее число молекул внутриклеточных посредников значительно превышает число молекул гормона, связавшихся с рецепторами. Под влиянием гормона и, соответственно, рецептора R с G-белком активируется фосфатидил-инозит специфическая фосфолипаза C, которая гидролизует фосфатидилинозит-1,4-бисфосфат с образованием инозит-1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерина ДГ.

Эта сложная система может обладать своеобразным динамическим поведением. Действительно, оказалось, что для концентрации внутриклеточного посредника - ионов , характерно колебательное изменение в ответ на сигналы гормонов и медиаторов. В клетке наблюдаются осцилляции внутриклеточной концентрации с периодами от <1 до почти 30 мин.

Модель. В рамках кинетической модели [Dupont and Goldbetter (1989, 1994)] IP3 воздействует на IP3-зависимый внутриклеточный пул через свои рецепторы, заполняемые им со степенью в. Скорость индуцированного выхода из IP3-чувствительного пула, v₁в, пропорциональна насыщению в рецептора IP3. Таким образом, IP3 регулирует выход в цитозоль ионов , которые в свою очередь запускают осцилляторные циклы выброса другим, нечувствительным к IP3, пулом (например, из митохондрий). Модель состоит из двух дифференциальных уравнений.

В соответствии с рис. рассматриваются две переменные: Z- концентрация свободного в цитозоле и Y - концентрация ионов в IP3-нечувствительном пуле, кинетика изменений этих концентраций может быть записана так:

,

,

где и - скорости входа и выхода из клетки, соответственно, без гормональной стимуляции; - скорость АТФ-зависимой накачки из цитозоля в IP3-нечувствительного пул и выхода из него в цитозоль имеют кооперативную природу, а цитозольный сам активирует (автокатализ) выход из IP3-нечувствительного пула.

С учетом этого выражения для скорости входа в IP3-нечувствительный пул и выхода в цитозоль примут вид:

,

.

В этих уравнениях и означают максимальные скорости накачки и утечки , соответственно; сами эти процессы описаны уравнениями Хилла [27,31], и коэффициенты кооперативности равны n и m; p - степень кооперативности процесса активирования, а K₂, K_R и K_A - пороговые константы для накачки, утечки и активации. Такие уравнения имеют единственное стационарное решение, которое, однако, не всегда устойчиво. Известно, что когда неравновесное стационарное состояние становится неустойчивым, могут возникать незатухающие колебания на траектории предельного цикла [27]. Модель предсказывает колебания концентрации кальция во времени, по форме близкие к экспериментальным.

С нашей позиции вход Ca²⁺ (АТФ-зависимый) в IP3 нечувствительный пул - это вход не только в цистерны ЭПР, но и в митохондрии, и выход из них при стимуляции клетки. Фактически энергизированные МХ-и являются ещё одним депо кальция.

Из экспериментальных данных (Акопова О.В.,2008) следует, что обычно проникает в митохондрии (МХ) по градиенту электрического поля их внутренней мембраны (минус со стороны матрикса МХ) в обмен на один протон (без затрат АТФ) и поэтому может при определенных условиях стимулировать синтез АТФ и, наоборот. Однако, при высокой его концентрациях в МХ-ях ? 20 мкм способен создавать поры и шунтировать протонный потенциал.

6.2 Моделирование процесса изменения протонного потенциала в цепи митохондрий тимоцита при ЭПО- стимуляции

Колебания кальция внутри тимоцита могут быть в то же время сопряжены и с периодическими сократительными процессами микрофиламентов ЦС вблизи мембранной поверхности, с клеточной подвижностью.

6.2.1 Связь митохондрий с цитоскелетом клетки и её роль в проведении стимулирующего сигнала

Известна роль цитоскелета для обеспечения движения митохондрий по микротрубочкам, как по рельсам, вблизи энергопотребляющих участков в клетках, и образования связных цепочечных структур, способных передавать протонный потенциал по ним как по электрокабелю. Такая структура может быть сопряжена с обеспечением локальных периодических сокращений поверхности и матрикса, например, при стимуляции рецепторов внешней мембраны лимфоцита гидрофильными гормонами типа эритропоэтина (ЭПО).

Тимоциты в свете флуоресценции зонда ДСМ

Исследования лимфоцитов (из тимуса и в нативной крови) с помощью витального флуоресцентного зонда-катиона ДСМ [19-25] показало, что митохондрии в зрелых Т-лимфоцитах образуют связные ажурные структуры. Т-хелперы составляют основную популяцию зрелых Т-лимфоцитов в тимусе, для которых характерны цепочечные структуры из митохондрий.

В препаратах нативной крови некоторых больных с аллергией в свете флуоресценции зонда ДСМ на термостатированном столике выявляются подвижные малые Т-хелперы. При этом наблюдается эффект последовательного тушения и возгорания жёлтой флуоресценции ДСМ в цепочке митохондрий, по-видимому сопряженный с активацией волны механических сокращений микрофиламентов вблизи поверхности клетки. При снижении температуры до комнатной движение клеток (быстрое потребление энергие) прекращается, а митохондрии возгораются.

Эти наблюдения дают основания предполагать прямую связь между входом кальция в клетку в результате воздействия ЭПО на рецепторы и активацией МЭК в Т-хелперах.

6.2.2 Применение телеграфного уравнения для моделирования процесса изменения ПП в МЭК тимоцита в процессе его ЭПО - стимуляции

Если гормон ЭПО способен стимулировать сократительные процессы в цитоскелете тимоцитов, то может иметь место волновой процесс: распространение механической волны по мембране, которое сопряжено с потреблением АТФ из распределённых источников энергии. Такими источниками как раз могут являться митохондрии, соединённые в цепочки и связанные с микротрубочками. Предполагается, что кальций может выступать стимулятором, поддерживающим протонный потенциал в митохондриях [4]. Движение клетки может быть сопряжено с автоколебательным процессом перераспределения кальция в цитозоле и синхронными сокращениями филаментов. При деполяризации внешней мембраны под влиянием ЭПО-сигнала, может происходить и временная деполяризация энергосопрягающей мембраны митохондрий, контактирующей с внешней мембраной. Механизм этого процесса связан с существенными изменениями концентраций ионов натрия и кальция в цитоплазме. В то же время потребление АТФ сократительными микрофиламентами (в актах сокращение-расслабление) может быть сопряжено с синхронными колебаниями протонного потенциала (ПП) вдоль цепи митохондрий как электрокабеля. Изменение ПП по цепи митохондрий рассмотрим с использованием телеграфного уравнения. Рассмотрим цепочку из митохондрий как электрический кабель, а именно коаксиальный, так как митохондрии имеют округлую форму и сопротивление сред по обеим сторонам митохондриальной мембраны значительно меньше сопротивления самой мембраны. Для такого электрического кабеля справедливы следующие телеграфные уравнения:

,

,

Откуда можно вывести телеграфные уравнения второго порядка:

,

Условие, при котором существует неискаженная волна (форма волны сохраняется, а амплитуда изменяется):

- волновое сопротивление МЭК

Где z-- координата, отсчитываемая вдоль провода, t -- время, С, G, L и R -- коэффициенты ёмкости, утечки, индуктивности, сопротивления митохондриального электрокабеля (МЭК), рассчитанные на единицу длины.

Оценим эффект затухания волны распространения протонного потенциала в МЭК (аналогия с распространением потенциала действия в аксоне) с помощью телеграфного уравнения, представленного выше.

Изменение протонного потенциала (ПП) вдоль мембраны митохондрий, которая является частью митохондриального электрокабеля (МЭК) (вверху) и ионный ток через эту мембрану (внизу).

Считаем место контакта митохондрий с мембраной началом МЭК, при этом изменение свойств внешней мембраны после ЭПО-связывания может повлиять на проницаемость мембраны краевых митохондрий для протонов и других ионов. Тогда происходят следующие процессы:

1- деполяризация мембраны митохондрий, контактирующих с внешней возбужденной мембраной клетки, т.е. увеличивается внутренний потенциал (потенциал со стороны матрикса) на некоторую величину по сравнению с исходным протонным потенциалом и соседними участками мембран митохондрий (при х=0, считаем ).