Исследование дафнии, как ценного объекта культивирования, являющегося основой стартового корма рыб

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Глава 1. Биология дафнии

1.1 Анатомическое строение. Виды

1.2 Цикл воспроизводства

1.3 Среда обитания

Глава 2. Описание методики исследования дафнии

2.1 Особенности использования методов биотестирования

2.2 Контроль качества вод на Daphnia magna Strauss

2.3 Динамика смертности и продолжительность жизни лабораторной культуры D. magna

Глава 3. Способы и методики культивирования дафнии

3.1 Содержание и выращивание маточной культуры

3.2 Методы промышленного разведения дафний

Глава 4. Методическая часть

4.1 Изучение роста популяции Daphnia magna в лабораторных условиях

4.2 Поиск новых субстратов и кормовых смесей для культивирования Daphnia

4.3 Оптимизация технологической схемы получения маточных культур

4.4 Исследование влияния различных концентраций сапонина на жизненный цикл Daphnia magna (Straus)

Заключение

Список использованной литературы

Введение

Выбранная тема является крайне актуальной, в связи с тем, что одной из важнейших задач современного рыбоводства является получение жизнестойкой, подрощенной молоди рыб для прудовых и озерных хозяйств, а также водохранилищ. Переход к индустриальным методам воспроизводства и подращивания рыб теоретически позволяет получать любое необходимое количество личинок, но на практике лимитируется недостатком полноценных стартовых кормов. Использование комбикормов в отсутствии живого корма приводит к высокой смертности личинок в первые дни подращивания и низкой их жизнестойкости.

«Последние исследования по выяснению механизма действия живого корма на рыб показывают, что эффективность живой пищи связана с наличием так называемого «фактора живого корма», обусловленного внутриклеточными ферментативными процессами. Вместе с тем, было доказано, что даже применение наиболее сбалансированных и дорогих комбикормов дает 50% выживаемость личинок только при наличии в рационе живого корма. В связи с этим, в современных рыбных хозяйствах обязательным считается подращивание личинок в первые семь-десять дней с использованием живого корма» Аксенова Е. И., Алдакимова А. Я., Идрисова Н. Х. Перспективы индустриального разведения живых кормов в рыбоводстве. М., 2012. С. 34..

До недавнего времени «основным стартовым живым кормом, находившим широкое применение в индустриальном рыбоводстве, был мелкий ультрагалинный рачок Artemia salina. Существовующие методы активации и декапсуляции яиц этого рачка позволяют получать ежегодно десятки и сотни миллионов подращенных личинок рыб» Вогатова Л.А, Шмакова Н.Ю., Дафния, в рыбном хозяйстве. 2000. С. 44. .

Вместе с тем, растущие потребности рыбного хозяйства в рыбопосадочном материале постоянно требуют все большие количества мелкого живого корма и особенно при заводском методе подращивания личинок, когда необходимо в сжатые сроки обеспечить стартовым кормом миллионы личинок. Поэтому, «наряду с широким использованием науплиусов артемий, получаемых инкубацией яиц, добываемых в природных резерватах артемий, по-прежнему актуальным остается такой давно известный и традиционно практикуемый способ получения живых кормов, как культивирование водных беспозвоночных, которое позволяет обеспечить автономное получение корма непосредственно на хозяйствах. Кроме того, известно, что чем разнообразнее по составу компонентов корм, тем он полноценнее. Подращивание личинок на нескольких видах корма позволит еще более повысить их жизнестойкость» Аксенова Е. И., Алдакимова А. Я., Идрисова Н. Х. Перспективы индустриального разведения живых кормов в рыбоводстве. М., 2012. С. 52..

В связи с этим в настоящее время особую актуальность приобретают вопросы повышения продуктивности культивируемых организмов, разработки способов отбора и введения в культуру новых кормовых беспозвоночных животных и методов их массового культивирования в производственных масштабах.

Практическая ценность работы состоит в том, что введение в массовую культуру нового мелкого кормового организма, каким является Daphniidae позволяет расширить ассортимент стартовых живых кормов для личинок рыб. Рассмотренный в работе способ культивирования дафнии достаточно прост, технологичен и экономичен, что позволяет использовать его на рыбозаводах и рыбхозах для получения дополнительного стартового живого корма.

Цель настоящей работы состоит в исследовании дафнии, как ценного объекта культивирования, являющегося основой стартового корма рыб.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить биологию дафнии.

2. Выявить известные методики исследования дафнии.

3. Исследовать способы и методики культивирования дафнии.

4. Определить условия массового развития дафнии в экспериментах.

5. Найти полноценный, доступный для дафнии корм, который можно было бы дешево и в больших масштабах: получать, легко хранить и использовать при массовом культивировании дафнии.

Глава 1. Биология дафнии

1.1 Анатомическое строение. Виды

Дафния является представителем организмов, традиционно причисляемых к «живой пыли». Это преимущественно небольшие ракообразные, относящиеся к семейству Daphniidae. Данное семейство, в свою очередь, входит в Cladocera, к которому также относятся гаммарусы, артемии и другие. За своеобразные резкие движения её часто называют «водяной блохой». Не говоря уже об особенностях перемещения, дафния (Pulex iritans) по внешнему виду также похожа на блоху. Однако последняя относится к насекомым (Insecta) и имеет очень далекого общего предка с ракообразными (Crustacea), так как оба класса входят в тип Arthropoda (Членистоногие). Все виды дафний имеют различные вариации, и иногда представители одного вида очень не похожи друг на друга. Особенности фенотипа, размер и форма тела зависят от области происхождения и конкретных условий окружающей среды. Значительным сходством с дафнией обладают представители рода Moina.

Одновременно с этим, дафнии служат индикатором степени загрязнённости водоёмов. В благоприятных условиях из яиц появляются главным образом самки, но при ухудшении условий рождаются и самцы. Этой закономерностью можно воспользоваться для определения качества воды и обнаружения в ней ядовитых веществ. В этом случае самцы играют роль индикаторов, так как содержание в водоеме даже ничтожного количества ядов изменяет соотношение между самками и самцами в пользу последних. индикатором степени загрязнения воды углекислым газом.

Наблюдая за поведением дафний, помещенных в банку с чистой водой, легко заметить, что они относятся к свету безразлично. Если в воду добавить 5-10% газированной воды, поведение дафний изменится: у них появится положительный фототаксис. По мнению ученых, «причина заключается в том, что углекислый газ снижает темп сердцебиения дафний (иногда на 30%), а это влечет за собой общее понижение жизнедеятельности рачков. Свет же учащает сердцебиение дафний и возвращает их в нормальное состояние. Поэтому они стремятся переместиться в освещенную зону сосуда с более благоприятными условиями. Следовательно, положительный фототаксис дафний в какой-то мере может служить индикатором степени загрязнения воды углекислым газом» Богатова И. Б. Возможности определения проблем экосистемы с помощью планктона. -М., 2012г. С. 28..

Донные отложения являются важным компонентом водных экосистем. В условиях загрязнения водоемов, донные отложения аккумулируют загрязняющие вещества, которые могут накапливаться в больших количествах и сохраняться длительное время. В последствие загрязняющие вещества могут поступать обратно в воду и водных животных, то есть может происходить вторичное загрязнение водоема. Изучение свойств донных отложений в условиях загрязнения водоемов - важная и актуальная задача. Одним из методов ее решения является биотестирование. В этих условиях дафния является стандартными тест-объектом для тестирования донных отложений . Наиболее чувствительным из изученных тест-обектов оказываются дафнии: отмечается их гибель при действии водной вытяжки из наиболее сильно загрязненных районов и снижение количества потомства при действии вытяжки грунтов, загрязненных в меньшей степени.

Значение дафний в жизни стоячих пресноводных водоёмов тоже очень велико. Они выполняют важную роль санитаров водоёмов, поедая разлагающиеся вещества. Дафнии потребляют большое количество органических остатков, погибших мелких животных, бактерий и водорослей, тем самым, очищая воду.

Питательность корма для промысловых рыб с содержанием дафнии очень высока: содержание белка в теле дафнии достигает пятидесяти процентов, а жира одиннадцать процентов по весу. В настоящее время на водоёмах рыбозаводов специально выращивают дафний в качестве живого корма.

Одновременно с этим, важно отличать дафнию от других «водяных блох», таких как Веслономгие ракообрамзные (Copepoda) (виды Циклопа) и Ракушковые рачки (Ostracoda) (виды Ципридопсиса), которые часто обитают в одних и тех же местах. Резкие движения, форма тела (и, в меньшей степени, окраска) являются наилучшими критериями для различения без необходимости рассмотрения под микроскопом.

Существует примерно 150 видов в Европе и Северной Америке (многие из этих видов обнаруженные на обоих континентах, случайно занесены человеком, либо появились естественным путем). Много чужих видов попало в Европу и Америку из Азии и Африки (печально известный вид Daphnia lumholtzi, в природе обитающий в Африке). Не редки случаи, когда на дне небольшого озера насчитывается 20 или более видов. Несколько видов Cladocera ведут хищнический образ жизни, хотя большинство являются травоядными или детритоядными. Как важное звено пищевой цепи практически любого водоема, дафнии перерабатывают фитопланктон/бентосные растения, бактерии, грибы и гниющую органическую массу животной ткани, которая могла использоваться крупными животными. В крупных озерах дафния является основной пищей для большинства типов рыб, таких как колюшка, гольян, мальки крупных видов, а также личинок амфибий. Многие водные личинки насекомых и других беспозвоночных также питаются дафнией.

Однако, в большинстве своем дафния, питается частицами на поверхности воды (фитопланктон, а также растительной и гниющей органической массой), преимущественно свободноплавающими водорослями (виды рода Chlamydomanas и Volvox), бактериями и грибами. В летние месяцы они часто обнаруживаются в цветущих прудах и озерах, в которых высока концентрация водорослей. Плодовитость дафний актуально велика, что связано с осуществлением партеногенеза.



Рис. 1. Анатомическое строение Анатомическое строение Daphnia pulex.

B - головной мозг; BC - выводковая камера; C - слепая кишка; CE - метафасетный глаз; F - сводчатое образование; FA - первая антенна (антеннула); H - сердце; INT - кишечник; O - фасеточный глаз; OV - яичник; R - хоботок; SG - скорлуповая железа» Гаевская Н. С. О методах выращивания живого корма для рыб. Труды Моск.техн.института рыбной промышленности и хозяйства, 2012. С. 125..

Рисунок 2. Фотография самки Daphnia magna.

Как видно из рис. 2 дафния имеет практически почковидную форму, только один сложный глаз (кроме дополнительного простого фасеточного глаза), две двуотросчатые антенны (часто в половину длины тела или более) и листовидные конечности внутри карапакса, которые создают ток воды, приносящий корм и кислород ко рту и жабрам» Гаевская Н. С. О методах выращивания живого корма для рыб. Труды Моск.техн.института рыбной промышленности и хозяйства, 2012. С. 129.. Тело прозрачное и можно видеть биение сердца, а также иногда зеленую массу в кишечнике, когда дафния отведала водорослей.

Оболочка, покрывающая тело, включает 4-6 пар грудных конечностей, которые используются для вынашивания потомства. Брюшные и постабдоминальные ножки обычно согнуты вперед навстречу к груди. Движение вниз в толще воды обеспечивается взмахом больших вторых антенн.

У большинства видов комплексные движения грудных конечностей создают постоянный ток воды между члениками. Это необходимо, для того, чтобы маленькие частицы (менее 50 мкм в диаметре) фильтровались концами щетинок грудных ножек и переносились вдоль желобка в их основании ко рту. Хотя существуют свидетельства того, что некоторые типы водорослей, бактерий и простейших выбираются для питания, основной является точка зрения, согласно которой все органические частицы соответствующего размера потребляются без разбора. Когда между мандибулами застревает нежелательные или большие запутанные кусочки материи, они удаляются при помощи щетинок первых ножек, а затем выбрасываются из карапакса постабдоминальными ножками.

Самцы отличаются от самок меньшим размером тела, удлиненными антеннулами, видоизмененными постабдоминальными и первыми конечностями, которые вооружены крючками для зацепления.

В зависимости от вида размер взрослых особей варьирует от 0,5 до 10 мм. Внутри вида также может наблюдаться изменчивость (самка Daphnia magna например, достигает 3-5 мм).

Иногда окраска дафний используется для определения их видовой принадлежности. Однако это плохой критерий, потому что внутри вида генетически детерминированная окраска может варьировать в зависимости от адаптивной физиологии дафнии. В воде, в которой низкий уровень кислороды, организм рачка производит больше гемоглобина для повышения связывания кислорода. Оксигемоглобин окрашивает тело в красный цвет. Аналогичные особи в богатой кислородом среде имеют тенденцию принимать желтую практически бесцветную окраску. В сравнении с другими представителями рода Daphnia hyalina, например, имеет небольшую концентрацию гемоглобина. Данный вид часто обнаруживается в открытых водоемах изобилующих содержанием кислорода. Окраска также сильно зависит от рациона питания. Например, дафния, которая недавно потребляла водоросли, становится прозрачно зеленой, а особь, потребляющая бактерий, оранжево-розовой.

Длительность жизненного цикла дафнии, от вылупления из яйца до смерти взрослого организма, сильно зависит от вида и условий среды. С увеличением температуры снижается продолжительность жизни, что вызвано повышением метаболизма. Средний срок жизни D. Magna при температуре 20 0C составляет 56 дней, а при 25 0C только 40 дней.

Одновременно с этим, можно выделить следующие этапы в цикле дафнии: яйцо, молодая особь, юношеский этап и взрослая особь. Как правило, 6-10 яиц содержатся в выводковой камере. Спустя 2 суток после созревания, молодые похожие на взрослых особи отпускаются с началом линьки у самки (смена экзоскелета). Половой зрелости дафнии достигают в возрасте 6-10 дней. Большая часть энергии расходуется у дафний на размножение (D. magna 69%, D. pulex 67%), в то время как на рост расходуется лишь 23%. Это подчеркивает преимущество быстрого воспроизводства в благоприятных условиях внешней среды.

По своей пищевой ценности сухое вещество дафнии содержит 50% белка, около 20-27% жира для взрослых (4-6% молодь). Некоторые виды имеют повышенное содержание белка, например, Моина, которая включает 70% белка. Как и большинство организмов, используемых в качестве живого корма, «они есть то, что они едят», поэтому дафниям, артемиям и другим ракообразным необходимо давать витаминизированный корм, богатый ненасыщенными жирными кислотами.

Для подкормки различных видов рыб можно использовать множество видов дафнии и родственных родов. Однако основное внимание следует уделить Daphnia pulex, Daphnia magna. Точная идентификация вида дафнии достигается рассмотрением её размеров, формы эфиппия, формы хоботка и длины постабдоминальных ножек, а также их щетинистости (покрытие маленькими волосковидными структурами). Стоит отметить, что внутри каждого вида обычно наблюдается гетерогенность особей, некоторые из которых выбиваются из нормы.

Daphnia pulex. Хотя это вполне самостоятельный вид, его крайне сложно выделить от других близкородственных форм (некоторые рассматриваются как самостоятельный вид, другие как подвид, потому что присутствует гибридизация. Примером может служить D. galeata. В общем случае особи данного вида похожи на маленькие копии D. magna.

Самцы Daphnia pulex обычно имеют размер 1,3-1,5 мм, а самки 2,2-2,5 мм. Окраска особей варьирует от желтой до практически красной, что очень схоже с D. magna. Отличие двух данных видов заключается в меньшем размере Дафнии pulex, наличии у них одних щетинистых ножек карапакса около постабдоминальной области, более треугольном эфиппии, не параллельном расположении эмбрионов и наличии лишь одного удлинения от верхнего края эфиппия. Создается впечатление, что D. pulex, образующая эфиппий, полностью готова к наступлению неблагоприятных условий.

Daphnia magna в большинстве случаев традиционно ассоциируется с дафнией. Особи данного вида являются основным источником живой пищи. Самцы имеют длину 2 мм, самки - 3-5 мм. Окраска варьирует от желтой до оранжево-розовой, что может говорить об их питательной ценности. D. magna выносит значительные колебания температур, но оптимальными являются 18-22 0C. В природе Дафния магна довольно редкий вид, однако в местах своего обитания она изобилует. Подобно эфиппию других видов Дафний, у магны эфиппий имеет седловидную форму. Тем не менее, эмбрионы внутри эфиппия (которых обычно два у дафний) расположены параллельно, и подобно прямоугольнику с удлиненной гранью, имеют два удлинения с каждого конца. Хотя Дафния магна способна образовывать эфиппий, он менее покатый, чем у Дафнии пулекс. Считается, что она более капризная и не такая стойкая к загрязнению культуры как пулекс.

К примеру виды Moina подобны дафниям и другим членам семейства Daphniidae, но совершенно отличаются от рода Daphnia. Они очень маленькие в сравнении с большинством Daphniidae (менее 0,5 мм в длину), а молодые особи по размерам соответствуют вновь вылупившимся артемиям. Тем не менее, культура Моины аналогична Дафниям, их сложно добыть, но можно использовать в качестве стартового корма вместо науплий артемий.

По всему миру можно обнаружить множество видов Daphnia/Cladoceran. Например, D. hyalina наиболее часто обнаруживается в открытых водах озер. В сравнении с D. magna, D. hyalina практически прозрачная, в результате её сложно заметить. Особи данного вида достигают в длину 3 мм, тело слегка округлое, а голова менее округлая и выделяющаяся по сравнению с Дафнией магной.

Bosmina coregoni представлен некрупными особями (около 1 мм в длину), заселяющими поросшие травой, озера и каналы. Благодаря своим небольшим размерам, Босмина является привлекательным кормом для мальков. Это очень активный вид, который без рассмотрения под микроскопом или увеличительным стеклом может быть легко спутан с другими мелкими дафниидами. Её форма тела похожа на горошек, который начал давать побег. Обычно данный вид обнаруживается в Северной Европе. Интересно, что многие культуры «Моины» в действительности являются культурой Босмины.

Simocephalus vetulus крупная дафниида, которая склона заселять верхнюю пленку воды. По сравнению с другими дафниидами, Simocephalus vetulus более стоек к кислой среде и часто достигает 6 мм в длину. Распространен в Северной Европе.

1.2 Цикл воспроизводства

Партеногенез это способность самовоспроизводства без необходимости оплодотворения (разновидность бесполого размножения), когда потомство полностью повторяет генотип родителя, то есть фактически является его клоном, а любые различия физиологического состояния определяются условиями окружающей среды. Партеногенез позволяет дафниям быстро размножиться в благоприятных условиях (пища, температура и т.д..) вскоре после их появления из яиц. В природе, в конце весны, лета и начале осени (в зависимости от температуры, доступности пищи и присутствия продуктов их метаболизма), дафния размножается партеногенетически, рождая в среднем 10 потомков на каждую взрослую особь. В период размножения в водоеме присутствуют только самки. Развивающийся эмбрион часто виден внутри материнского организма без микроскопа. Самки следующего поколения способны к партеногенезу через 4 суток развития, при этом роды происходят каждые трое суток. За свой жизненный цикл самка может успеть воспроизвести потомство 25 раз (на практике это число немного меньше и самка имеет тенденцию производить не более 100 отпрысков).

При недостатке корма некоторые яйца развиваются в самцов, а самки начинают производить яйца, которые должны быть оплодотворены (с гаплоидным набором хромосом). Последние развиваются в маленькие эмбрионы, которые затем впадают в спячку, покрываются темно-коричневой/черной седловидной раковиной, известной как эфиппий (с латинского «седло»). В данном виде дафния может переносить суровые условия среды, недолгое иссушение водоема и даже его промерзание. Самок, рожденных для образования эфиппия (выведения потомства), легко отличить от партеногенетических особей, потому что развивающийся эфиппий присутствует у них в виде черного пятна в заднем конце тела. Когда условия среды вновь становятся благоприятными, из яиц появляется поколение, которое, в свою очередь, рождает только самок (при этом все самцы погибают до момента наступления неблагоприятных условий).

Цикл воспроизводства популяции дафний обычно представлен двумя волнами, когда начинается практически логарифмическое возрастание их численности за счет партеногенеза до момента перенаселения, а затем при недостатке питания и похолодании происходит падение численности и образования эфиппий. Каждый год, как правило, наблюдается две подобных волны, хотя при благоприятных условиях может быть и больше.

1.3 Среда обитания

Дафния крайне чувствительна к загрязнению воды, и ряд исследований и производственных работ использовали её для определения чистоты водоемов. Например, для неё очень токсичными являются галогениды, такие как хлориды и фториды водопроводной воды. Кроме того, дафния чувствительна в концентрации натрия, калия, магния и кальция, повышение содержание которых вызывает их обездвиживание и смерть, а также наиболее восприимчива к меди, цинку и большинству растворенных токсинов (ионы дихромата). Часто их используют для мониторинга качества воды перед сбросом промышленных вод в окружающую среду.

Дафния является типичным пресноводным организмом, в роду не встречается морских видов. 99% представителей этого вида - это пресноводные организмы, а оставшиеся в большинстве своем населяют солоноватую и морскую воду. Некоторые виды обнаруживаются в воде с соленостью свыше 0,004 ‰, а 0,0015-0,003 ‰ являются обычной соленостью водоемов с культурами на Востоке.

Дафнии терпимы к грязной воде, а уровень растворенного кислорода может варьировать от почти нулевого до сверхнасыщенного. Подобно Артемии, способность дафний выживать в бедной кислородом среде объясняется возможностью образовывать гемоглобин. Продукция гемоглобина может ускоряться при повышении температуры и плотности популяции. Также как и в случае с Артемией, дафния не выносит активной аэрации с мелкими пузырьками воздуха, которые могут погубить её. Напротив, слишком медленная аэрация с крупными пузырьками образует пенный слой сверху, где будет скопление дафний, которые погибнут.

Допустимым считается уровень pH 6,5-9,5 с оптимумом 7,2-8,5. Аммиак является ядом для всех организмов, даже в маленьких количествах, но щелочной среде его токсичность резко возрастает, что сказывается на воспроизводстве дафний, но не здоровье особей. Таким образом, небольшая концентрация и колебания pH и аммиака не критичны для успешного развития культуры. Стоит отметить, что значительное повышение pH активизирует токсичность растворенных минералов и газов. Кроме того, pH является логарифмической зависимостью, то есть pH = 5 в 10 раз больше, чем pH = 6 и т.д..

В противоположность высокой устойчивости к концентрации растворенного кислорода, дафнии крайне восприимчивы к колебаниям ионного состава своей среды обитания. Они могут стать неподвижными и погибнуть при добавлении солей магния, калия, натрия и кальция. Низкие концентрации фосфора (0,0005 ‰) стимулирует воспроизводство, но концентрация выше 0,001 ‰ летальна для молоди. Daphnia magna среди других видов наиболее резистентна по отношению к уровню фосфора и может выдержать концентрацию 0,005-0,007 ‰. На дафнию не оказывает влияние азот, который способствует развитию водорослей. Как и для обычных аквариумов, должна использоваться аэрация или дехлорирование для удаления хлора перед запуском культуры. Концентрация меди всего 0,00001 ‰ приводит к снижению активности дафний. Данный организм чрезвычайно чувствителен к концентрации ионов металлов, подобных цинку и меди, пестицидов, детергентов, отбеливателей и прочих растворенных токсинов. По этой причине они часто используются на промышленных предприятиях для проверки качества воды. Городская и природная воды может быть загрязнена достаточно для гибели культуры. Наилучшим источником воды является вода, которая извлекается из бассейна с рыбами при его очистке. Однако может использоваться отфильтрованная озерная вода (лучше, где не обитают рыбки), дождевая вода, собранная с площадей с низким уровнем воздушного загрязнения (либо городская дождевая вода, которая обычно отстаивается в течение недели и используется лишь ѕ её). Нельзя применять дистиллированную или деионизированную воду, в ней отсутствуют минералы, необходимые для развития дафнии.

Низкий уровень временной и постоянной жесткости способствует развитию дафний, потому что рачки используют кальций и другие минералы для образования хитинового карапакса. D. magna предпочитает повышенную жесткость (170 мг карбонатной жесткости), а D. pulex чуть меньше (90 мг карбонатной жесткости). Можно добавлять немного порошкообразного туф камня, который применяется при разведении морских видов рыб. Он немного повысит временную жесткость и никак не отразится на постоянной.

Дафнии восприимчивы к концентрации растворенного сероводорода и сульфидов. Данные вещества обычно наблюдаются в водоемах в небольшом количестве и образуются при разложении органических веществ в илистых отложениях. Частичная гибель дафний наступает при концентрации сероводорода -- 1,0 мг/л, сульфида натрия -- 10,0 мг/л, а хирономид -- 70,0 и 1000,0 мг/л соответственно.

Дафния обитает в широком диапазоне температур. Оптимальной является температура 18-22 0C. D. pulex прекрасно себя чувствует при температурах выше 10 0C. D. magna выдерживает ещё более жесткие колебания, 5-31 0C; оптимум составляет 24-31 0C. Повышенная устойчивость D. magna к температурным показателям делает её предпочтительным объектом культивирования.

Наилучшей питательной средой для культуры являются сине-зеленые водоросли (обычно, это свободноплавающие виды зеленых водорослей, которые имеют тенденцию превращать воду в «гороховый суп»), дрожжи (Sacromyces spp и схожие грибы) и бактерии. Комбинация вышеуказанных объектов делает успешным процесс поддержания культуры (дрожжи и водоросли дополняют друг друга).

Микроводоросли потребляются дафниями в огромных количествах, и изобилие рачков наблюдается в местах цветения водоемов. Имеется ряд способов для обеспечения развития водорослей, все из которых требуют минимальных усилий:

1. Установка емкости с культурой под прямые солнечные лучи гарантирует развитие водорослей в течение двух недель, обычно раньше. Их споры переносятся по воздуху и колонизируют водоемы, но, как правило, для ускорения цветения в воду вносят некоторое количество водорослей.

2. Использование удобрений для растений, например, Miracle grow. Раз в неделю в емкость добавляют удобрения. Емкость должна находиться под прямыми солнечными лучами. Необходима аэрация и медленное перемещение воды. Должна быть построена система, согласно которой первая емкость с водорослями уже имеет зеленый цвет, вторая приобретет данный оттенок в течение двух дней, третья ещё в течение двух дней и т.д. Когда первая емкость становится светло-зеленой (через 2 недели), её смешивают с культурой дафний. Опустевшую емкость вновь наполняют смесью с добавлением небольшого количества воды из второй емкости.

Преимуществами водорослей является легкость приготовления и чрезвычайно быстрое развитие культуры дафний, их потребляющих. Недостатков нет, если не считать необходимость постоянного перезапуска емкостей.

Нельзя помещать дафний в слишком богатую водорослями среду, потому что водоросли имеют тенденцию повышать pH вплоть до 9. Высокая щелочность сопряжена с увеличением токсичности аммиака, даже при малых его концентрациях.

Существует два основных типа дрожжей, активные и неактивные, принадлежность которых необходимо учитывать. Активные дрожжи выступают лучшей питательной средой, потому что они не так быстро загрязняют воду как неактивные. Пекарные, пивоваренные и практически все другие типы дрожжей пригодны для культивирования дафний, но рекомендуется вносить не более чем 28 г на 20 литров воды в качестве ежедневной нормы. В случае использования дрожжей, особенно неактивных, можно дополнительно внести в воду водоросли, которые будут препятствовать загрязнению среды. Важно не переусердствовать с добавлением дрожжей, излишки загрязнят среду и погубят культуру дафний.

Некоторые пекарные дрожжи поставляются в смеси с активными ингредиентами, такими как сульфат кальция, аскорбиновая кислота, которые активизируют развитие грибов. Сами эти компоненты безвредны для культуры, однако аскорбиновая кислота может понизить pH среды до 6, что далеко от идеального показателя для дафний. Как правило, это происходит при чрезмерном кормлении.

Преимуществом дрожжей как питательной среды является простота их приобретения, и минимальные усилия на приготовление и поддержание культуры. Однако они не настолько ценные с точки зрения питания для дафний как водоросли (рачкам требуется потребить большую массу дрожжей, чем водорослей для получения той же пищевой ценности).

Бактерии имеют такую же питательную ценность, что и грибы, но они быстрее размножаются по сравнению с водорослями и грибами. Для создания питательной среды используют 140-170 г высушенных лошадиных, коровьих или овечьих экскрементов (высушивание необходимо для простоты манипуляций, а также для разрушения антибиотиков и ростовых факторов, которые часто используются в животноводстве), которые помещаются в нейлоновый мешок (из под колготок/трико), и опускается в воду с дафниями. Экскременты животных содержат значительное количество бактерий, необходимых для пищеварения. Эти бактерии выходят в воду и размножаются. Обычно вода становится мутной, что свидетельствует о начале бурного размножения бактерий. Максимальный эффект достигается через 1 неделю. Другой способ использования экскрементов заключается в замачивании их в течении недели вплоть до получения жидкой суспензии, которая затем по 450 мл каждые 5-8 дней вливается в культуру дафний.

Можно просто добавить лососевые, форелевые потроха, либо любое другое мясо в несколько литров воды с небольшим количеством аквариумной воды. Через несколько дней в резервуаре будет изобилие бактерий.

Бактерии являются хорошей питательной средой, их легко получить и культивировать. Среди недостатков выделяется использование гниющей материи (что со временем может стать проблемой). Кроме того, коровьи экскременты часто содержат бактерии столбняка так, что работать необходимо в перчатках.

Включают отруби, пшеничную муку, сухую кровь. Данные ингредиенты следует рассматривать по аналогии с неактивными дрожжами. В воду добавляется такое же количество, как и в случае с дрожжами, но питательная ценность оказывается ниже.

В качестве альтернативы водорослям используют смесь из 80% зеленого горошка и 20% моркови. Овощи смешивают и тщательно измельчают до кашицы. Полученный раствор имеет частицы размером меньше 50мкм, что пригодно для скармливания дафниям.

Производство дафний относительно легкий процесс. Однако существует меры повышения продуктивности культивирования:

1. Хорошая аэрация (хорошо в той мере, в какой вода насыщается кислородом, но не чрезмерно сильная аэрация) является главным фактором повышения продуктивности. Некоторые виды предпочитают отсутствие аэрации, но Daphnia magna лучше разводится в её присутствии. Кроме того, это позволяет повысить плотность культуры, циркуляции воды (что препятствует стагнации и угнетению культуры), снижает водорослевый налет на стенках сосуда, а также переводит пищевые частицы во взвешенное состояние, что характерно для естественного рациона дафний. Единственный недостаток заключается в том, что мелкие пузырьки воздуха наполняют карапакс рачков, которые всплывают и не могут питаться. Распылитель воздуха в этом случае вообще должен исключаться, либо он должен быть очень грубым для создания крупных пузырей. Фильтр захватывает крупные частицы, способствует их разложению для питания водорослей.

2. Регулярное поддержание чистоты среды и замена воды.

3. Регулярный отбор/сбор культуры. Это мероприятие сохраняет постоянный прирост культуры и предоставляет дафниям возможность быстрее аккумулировать кислород и корм.

4. 24 часовой световой день повышает продуктивность дафний, однако это необязательная мера. Также не стоит содержать дафний 24 часа в темноте, потому что это стимулирует рачков к образованию эфиппий.

5. Режим и степень замены воды зависит от используемой питательной среды, но, в любом случае, они необходимы для очистки от метаболитов и токсинов.

Культура дафний требует минимального вмешательства, что заключается в частичной замене воды (количество зависит от объема и плотности популяции - при больших объемах обычно требуется меньше замен воды, при высокой плотности требуется более значительная замена). Необходимо постоянное кормление как описано выше.

Ключом к сохранению популяции является недопущение резких перепадов параметров среды (pH, температуры), засорения культуры, внесения опасных веществ в воду.

Глава 2. Описание методики исследования дафнии

2.1 Особенности использования методов биотестирования

Биотестирование - использование в контролируемых условиях биологических объектов (тест-объектов) для выявления и оценки действия факторов (в том числе и токсических) окружающей среды на организм, его отдельную функцию или систему организмов. Хорошие результаты дает анализ бентосных (придонных) беспозвоночных. Оценка чистоты водоемов делается по преобладанию, либо отсутствию тех или иных таксонов.

Типы чувствительности биоиндикаторов:

В зависимости от скорости проявления биоиндикаторных реакций выделяют несколько различных типов чувствительности тест-организмов:

1 тип - биоиндикатор проявляет внезапную и сильную реакцию, продолжающуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнитель.

2 тип - биоиндикатор в течении длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнителя.

3 тип - после немедленной, сильной реакции у биоиндикатора наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное.

4 тип - под влиянием загрязнителя реакция биоиндикатора постепенно становится все более интенсивной, однако, достигнув максимума постепенно затухает.

5 тип - реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция биоиндикаторных параметров.

Существуют следующие требования к биоиндикаторам

1. накопление загрязняющих веществ не должно приводить к гибели тест-организмов.

2. численность тест-организмов должна быть достаточной для отбора, т.е. без влияния на их воспроизводство.

3. в случае долгосрочных наблюдений предпочтительны многолетние виды флоры.

4. фитотесты должны быть генетически однородными.

5. должна быть обеспечена легкость взятия проб.

6. должна реализоваться относительная быстрота проведения тестирования.

7. биотесты должны обеспечивать получение достаточно точных и воспроизводимых результатов.

8. биоиндикаторы должны быть одновозрастными и характеризоваться, по-возможности, близкими свойствами.

9. диапазон погрешностей измерений (по сравнению с классическими или эталонными методами тестирования) не должен превышать 20-30%.

10. при выборе тест-организмов предпочтение следует отдавать регистрации функциональных, этологических, цитогенетических изменений отдельных индикаторных процессов биоты, а не только изменению ее структуры, численности или биомассы, т.к. последние являются более консервативными.

Биотестирование и биоиндикация являются основными элементами биологического мониторинга состояния окружающей среды. Возможен мониторинг, как состояния биологических объектов, так и компонентов окружающей среды. Оценка проб среды с использованием тест-организмов и наблюдение за состоянием биообъектов, вносимых в контролируемую экосистему в разнообразных садках, представляет собой биотестирование. Биотестирование выполняет функцию тактического контроля происходящего загрязнения, нацеленного на получение быстрого сигнала о токсичности и необходимой степени разбавления конкретных стоков. На водном объекте оно может быть эффективным с момента начала загрязнения до его завершения. Биоиндикация выявляет результат произошедшего вредоносного воздействия на окружающую среду. Может применяться на экологическом объекте постоянно, но эффективность его станет очевидной при начале неблагоприятных экологических изменений. Эти три элемента общей природоохранной стратегии дополняют, но не способны заменить друг друга. Задачей экологов является отработка оптимальных режимов применения каждого из подходов, целенаправленного и обоснованного применения их в системе ограничения загрязнения.

Условия, определяемые с помощью организмов-биоиндикаторов, называются объектами биоиндикации. Ими могут быть как определенные типы природных объектов (почва, воздух, вода), так и различные свойства этих объектов (механический, химический состав и др.) и определенные процессы, протекающие в окружающей среде (эрозия, заболачивание и т.п.), в том числе происходящие под влиянием человека. Среди особых преимуществ биологических методов следует отметить то, что они позволяют фиксировать негативные изменения в природной среде при низких концентрациях загрязняющих веществ.

Использование биоиндикаторов позволяет:

- обнаруживать места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений;

- проследить динамику изменений в окружающей среде;

- определить степень вредности тех или иных веществ для живой природы, в частности для человека;

- составить прогноз дальнейшего развития экосистемы.

Биоиндикацию можно проводить на видовом и биоценотическом уровне. Видовой уровень включает в себя констатацию присутствия организма, учет частоты его встречаемости, изучение его анатомо-морфологических особенностей, физиологии, биохимии. При биоценотическом уровне исследования учитываются различные показатели разнообразия видов, продуктивность данного сообщества.

Существуют различные виды биоиндикации. Если одна и та же реакция вызывается различными факторами, то говорят о неспецифической биоиндикации. Если же те или иные происходящие изменения можно связать только с одним фактором, то речь идет о специфической биоиндикации. Например, лишайники и хвойные деревья могут характеризовать чистоту воздуха и наличие промышленных загрязнений в местах их произрастания. Видовой состав животных и низших растений, обитающих в почвах, является специфическим для различных почвенных комплексов, поэтому изменения этих группировок и численность видов в них могут свидетельствовать о загрязнении почв химическими веществами.

Методы биоиндикации подразделяются на два вида: регистрирующая и аккумулятивная биоиндикация. Регистрирующая биоиндикация позволяет оценивать воздействие факторов среды по состоянию особей вида или популяции, а биоиндикация по аккумуляции использует свойство живых организмов накапливать некоторые химические вещества. В соответствии с этими методами различают и типы биоиндикаторов.

Регистрирующие биоиндикаторы реагируют на изменение внешней среды изменением численности, фенооблика, изменением скорости роста, соматическими проявлениями (в том числе уродливостью) и другими хорошо заметными признаками. Примером таких биоиндикаторов служат лишайники и хвоя деревьев (хлороз, некроз) и их суховершинность.

Накапливающие биоиндикаторы концентрируют загрязняющие вещества в своих тканях, определенных органах и частях тела, которые в последующем используются для выяснения степени загрязнения окружающей среды при помощи химического анализа. В качестве примера можно назвать хитиновые панцири ракообразных и личинок насекомых, обитающих в воде, мхи, печень млекопитающих. Аккумулятивную биоиндикацию используют при исследовании процессов миграции токсичных веществ.

Методы регистрирующей биоиндикации наиболее доступны для использования в условиях экспедиции или экологического лагеря, так как они не требуют применения сложных приборов и трудоемких методик.

2.2 Контроль качества вод на Daphnia magna Strauss

Биотестирование наряду с биоиндикацией является обязательным элементом современной системы контроля качества вод. «Биотестирование - один из приемов определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды, потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности» Зенин А.А., Белоусова Н.В. Гидрохимический словарь. Л., 2012. С. 235..

«Во второй половине XX столетия в связи с необходимостью оценки токсичности природных и сточных вод, а также некоторых химических веществ во многих странах мира стали использовать биотестирование на Daphnia magna Straus. Впервые D. magna как индикатор токсичности воды была предложена в 1929г.» Дементьев М. С. Биотестирование воды на Daphnia magna Straus. М., 2014. С. 49.. В СССР начало подобных исследований связано с работами Н.С.Строганова и его школы, Е.А.Веселова и Л.А.Лесникова. Позже последователями американской школы биотестирования была предложена Ceriodaphnia affinis Lilljeborg, и этот вид, наряду с D. magna и D. pulex (De Geеr, 1778), был введен в руководства по биотестированию во многих странах мира. «В последнее время дафний рекомендовано использовать и для биотестирования питьевых вод. Поэтому необходимо как можно более полное знание биологии вида, выбранного в качестве тест-объекта, в условиях его использования в виде лабораторной культуры» Дементьев М. С. Биотестирование воды на Daphnia magna Straus. М., 2014. С. 52..

Ветвистоусые рачки дафнии обычно имеют длину не более 2-3 мм, характеризуются двумя парами усиков-антенн, ясно выраженной головой с большим сложным глазом, состоящим из двух десятков простых глазков, четырьмя парами ножек и мешковидным выростом с яйцами на спине. Антенны небольшие, но сильно развиты, двуветвистые и служат для плавания. Голова дафний спереди вытянута в остренький «клюв», тело покрыто прозрачной двустворчатой раковинкой из тонкого хитина, брюшные ножки скрыты под раковинкой, на грудных ножках находятся жаберные лепестки. У дафний даже есть сердце. Сердце дафний, сокращаясь несколько десятков раз в минуту, проталкивает кровь вначале к голове, а затем к жабрам и заднему концу тела. Окраска, в зависимости от питания, колеблется от розово-желтой до красной при дефиците кислорода. Питаются дафнии мелкими водорослями и бактериями. В течение лета рачки размножаются партеногенетически, нося неоплодотворенные яйца на спине, в так называемой выводковой камере. Самцы у дафний редки, появляются обычно к осени и всегда значительно мельче самок.

Исследована изменчивость биологических параметров лабораторной культуры D. magna в оптимальных условиях длительного лабораторного культивирования.

2.3 Динамика смертности и продолжительность жизни лабораторной культуры D. magna

Смертность определялась в процентах от общего количества фертильных или неполовозрелых самок на каждый месяц. Под неполовозрелыми подразумевались все самки, не успевшие дать потомство.

Продолжительность жизни отдельных особей D. magna определялась довольно точно в связи с индивидуальным культивированием и использованием для закладки каждой повторности только 1-2суточных рачков.

«Нижний и верхний пределы продолжительности жизни D. magna составили соответственно несколько часов (в пределах суток) и 7, 57 месяца, причем в среднем дольше всех прожили рачки, родившиеся в январе (4, 18 месяца - без учета смертности неполовозрелых самок, 3, 14 месяца - с учетом месяца). Особенно велика продолжительность жизни рачков, родившихся в последней декаде января - 5, 64 и 4, 63 месяца, а количество особей, проживших от 1 до 7 месяцев, колеблется от 7, 9 до 21, 1%» Вогатова Л.А, Шмакова Н.Ю., Дафния, в рыбном хозяйстве. М. 2000. С. 425..

Соотношение особей D. magna с различной продолжительностью жизни. Количество особей (от общего числа проживших): 1-7 - месяцев.

Максимальная продолжительность жизни D. magna в оптимальных условиях лабораторного культивирования равна 7 месяцам (и более), причем доля проживших максимальный срок составляет более половины от числа особей, проживших около месяца.

«Для изучения продолжительности жизни, роста и сроков созревания ракообразных в лабораторных условиях ежедневно проводят наблюдения за их выживаемостью и продолжительностью жизни, приростом, сроками появления яиц в выводковых камерах самок, количеством молоди в первом и последующих поколениях. Размеры молоди и взрослых самок измеряют на микроскопе МБС-9 при помощи окуляр-микрометра» Вогатова Л.А, Шмакова Н.Ю., Дафния, в рыбном хозяйстве. М. 2000. С. 429..

«Введение в культуру S. vetulus, M. macrocopa, C. affinis, S. mucronata и D. magna проводят по общей схеме. Одну партеногенетическую самку помещают в емкость с контрольной водой, туда же ежедневно вносят корм: суспензию сухих пекарских дрожжей и смесь культур зеленых водорослей Chlorella vulgaris Beijer и Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. После получения потомства взрослых самок отсаживали, а молодь помещают в емкости для создания генетически однородной монокультуры, происходящей от одной партеногенетической самки» Там же. С. 434..

Глава 3. Способы и методики культивирования дафнии

3.1 Содержание и выращивание маточной культуры

Кормление рыбы кормовыми смесями является самым мощным средством интенсификации прудового рыбоводства, наиболее надежным способом увеличения рыбной продукции с единицы прудовой площади. Но современное состояние науки и практический опыт в области кормления прудовых рыб еще далеко не достигли того уровня, при котором искусственные корма могли бы полностью заменить естественную пищу. Естественная пища остается совершенно необходимой и притом наиболее ценной частью любого рациона прудовых рыб. Поэтому степень возможного увеличения выхода рыбы за счет кормления искусственными кормами зависит в первую очередь от того, в какой мере удается повысить и улучшить запас естественного корма, т. е. естественную рыбопродуктивность пруда. Особенно большое значение имеет обеспеченность естественной пищей, живым кормом молоди рыб на самых ранних стадиях развития. В последнее время начали подкармливать кормовыми смесями и мальков в нерестовых прудах, но основной пищей для них является естественная. Важное значение естественная пища имеет и для выращивания в выростных прудах максимального количества стандартных по весу, хорошо упитанных и зимостойких сеголетков карпа.

«Главным способом увеличения запаса естественной пищи рыб является создание наилучших условий для массового развития планктонных и бентосных организмов непосредственно в рыбоводных прудах путем их удобрения, мелиорации, улучшения гидрохимического режима и т. п. Однако для небольших прудов (в первую очередь нерестовых) следует дополнительно выращивать естественный живой корм в специальных бассейнах и водоемах, откуда его по мере надобности переносят в рыбоводные пруды» Вогатова Л.А, Шмакова Н.Ю., Дафния, в рыбном хозяйстве. М. 2000. С. 413.. дафния культивирование биотестирование сапонин

В качестве живого корма для молоди рыб в прудовых рыбоводных хозяйствах выращивают в первую очередь планктонных ветвистоусых рачков - дафний. Для выращивания дафний используют специальные бассейны, бочки, чаны, канавы, ямы или небольшие прудики, расположенные на солнечных, хорошо прогреваемых местах. Водоемы для выращивания дафний следует хорошо удобрять навозом из расчета около 1,5 кг на 1 куб. м воды. Затем в водоем вносят живых дафний по 5-10 г на 1 куб. м воды. Этих дафний вылавливают из окрестных естественных водоемов или луж, хорошо прогреваемых солнцем. В теплое время года для полного развития культуры дафний требуется 18-20 дней. На 8-10-й день после внесения дафний в водоем спускают свежий коровий или конский навоз из расчета 750 г на 1 куб. м воды. На 18-20-й день, когда дафнии появятся в массовом количестве, их вылавливают сачками из шелкового мельничного газа и в ведрах или в другой посуде переносят в рыбоводный пруд или же соединяют дафниевую яму с прудом канавкой, по которой дафнии вместе с водой перепускаются непосредственно в рыбоводный пруд. Дафниевые ямы обычно располагают вдоль береговой линии рыбоводного пруда в непосредственной близости от него (от 5-10 до 20 ям на 1 га пруда).

Для колхозных рыбоводных прудов успешно выращивают дафний в специальных дафниевых ямах размером 1 X 3 м и глубиной от 5-10 до 50 см. На 1 га площади рыбоводного пруда устраивают до 20 ям, в каждую из которых вносят до 8 кг коровьего навоза и 2 кг. сена или сенной трухи. В некоторых дафниевых ямах сено можно заменять сухими листьями гороха, а коровий навоз - птичьим пометом из расчета 1,5 кг на ведро воды.

По методу Г. И. Шпета дафний разводят в деревянных или железных бочках, чанах, цементных бассейнах, в ямах и канавах со стоячей водой, а также в непроточных мелких прудах. Бассейны наполняют водой на 50-60 см. Перед посадкой дафний в воду вносят свежий конский навоз по норме 1,5 кг на 1 куб. м воды. В тот же или на следующий день в бассейн помещают живых дафний в количестве 5-10 г на 1 куб. м воды. Через 8-10 дней в бочки или бассейны вносят подкормку из конского навоза (половину первоначальной нормы, т. е. 0,75 кг навоза на 1 куб. м воды). Примерно через 18-20 дней при устойчивой теплой погоде в бассейне развивается масса дафний, которых и используют для кормления рыбы. До окончательного созревания дафний доливать воду в бассейн не рекомендуется. Производительность бассейна при полном облове на 18- 20-й день составляет 1 кг дафний на 1 куб. м воды, а при непрерывном разведении и подкармливании выход дафний в теплое время года доходит до 50 г на 1 куб. м за сутки. Один килограмм дафний может быть использован для кормления примерно одной тысячи мальков карпа.

Культуру дафний выращивают в климатостате или эквивалентном приспособлении, обеспечивающем поддержание искусственного освещения лампами дневного света с интенсивностью света от 500 до1000 лк, 16-часовой световой и 8-часовой ночной (без освещения) период; температуру 20±2 0С.