Размещено на http://www.allbest.ru/

Белорусский государственный университет

Биологический факультет

Кафедра генетики

Курсовая работа

Характеристика пестицидных белков Bacillus thuringiensis и их генетических детерминант

Выполнил: студент 3 курса

Сергеенко А.В.

Научный руководитель: канд. биол. наук, доцент

Ремезов О.П.

Минск 2011

Оглавление

• Введение
• 1. Общая характеристика Bacillus thuringiensis
• 2. Токсины Bacillus thuringiensis
• 2.1 Общая характеристика и структура токсинов
• 2.2 Механизм действия токсинов
• 2.3 Генетические детерминанты токсинов
• 2.4 Биотехнология Bacillus thuringiensis
• 3. Прикладное использование Bacillus thuringiensis как продуцента хозяйственно полезных токсинов
• Заключение
• Список использованной литературы
• Перечень сокращений

Введение

Объектом данной курсовой работы является Bacillus thuringiensis, а предметом - использование данного вида эубактерий как продуцента хозяйственно полезных токсинов, а также методы и приёмы по повышению эффективности продукции этих токсинов или усилению их биологической активности.

Цель данной работы - разносторонняя характеристика токсинов Bacillus thuringiensis как природных биопестицидов, а также сферы их применения. Для достижения этой цели предполагается решить следующие задачи: дать общую характеристику, раскрыть многообразие, механизм действия и особенности токсинов Bacillus thuringiensis, охарактеризовать их генетические детерминанты, указать методы повышения их продукции или биологической активности, а также рассмотреть область их практического использования человеком.

Актуальность выбранной темы определяется тем, что биопестициды являются серьёзным дополнением или реальной альтернативой синтезируемым химической промышленностью пестицидам. Синтетические пестициды менее специфичны в своём действии и имеют опасное свойство накапливаться как в почве и воде, так и в растениях и организме животных, что может приводить к развитию раковых заболеваний, повреждению гепатоцитов печени, дефектам плода и репродуктивным проблемам у человека и животных. (Kegley, Wise, 1998). Отрицательная роль синтетических пестицидов во всё ухудшающейся экологической ситуации во всём мире не вызывает сомнения. Более того, для приблизительно 40% широко применяемых химических пестицидов не проводились никакие исследования по изучению их токсичности, и лишь для 10% имеется полная информация по их токсичности (Kegley, Wise, 1998). Преимуществами биопестицидов по сравнению с химическими пестицидами является отсутствие загрязняющих остатков вследствие их быстрой деградации, высокая специфичность действия, обусловливающая их относительную безопасность для нецелевых организмов и невысокая стоимость процедур, необходимых для регистрации их в качестве средств защиты растений (Добрица и др., 2001; Federici, Maddox, 1996) Помимо этого, BT является источником генетических детерминант для генно-инженерных манипуляций и создания трансгенных растений, устойчивых к сельскохозяйственным вредителям. В последнее время были выявлены новые типы биологической активности токсинов, продуцируемых BT: против нематод (Wei et al., 2003), фитопатогенных грибов (Каменёк и др., 2008), патогенных микроорганизмов (Андреева и др., 2008), против опухолевых клеток, в т.ч. раковых клеток (Ito et al., 2004; Kitada et al., 2006). Помимо этого, выделены штаммы, обладающие множественной пестицидной активностью (Кузин и др., 2008).

Всё это вызывает большой интерес к BT как продуценту широкого спектра токсинов, используемых для создания биопестицидных препаратов, и некоторых других биологически активных веществ.

1. Общая характеристика Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (BТ) относится к грамположительным аэробным спорообразующим эубактериям палочковидной формы и принадлежит к сем. Bacillaceae. Это космополитный вид, а его экологические ниши весьма разнообразны: почва, тела беспозвоночных животных (в частности, насекомых), частицы хранившихся продуктов (Kao et al., 1996), листья Голо- и Покрытосеменных (Schnepf et al., 1998) и даже термальные источники, из которых сравнительно недавно были выделены новые атипичные штаммы Bt (Андреева и др., 2008). Всего описано более 82 сероваров ВТ (Pigott, Ellar, 2007). Впервые BТ была открыта Эрнстом Берлинером в 1911г. и охарактеризована как энтомопатогенный микроорганизм. Активное изучение этого вида в качестве потенциального биопестицида началось после Второй Мировой войны, когда возникла проблема загрязнения окружающей среды синтетическими пестицидами (Tappeser, 1998).

Характерной особенностью BТ является способность продуцировать в больших количествах белковые токсины, проявляющие биологическую активность в отношении клеток преимущественно беспозвоночных (в частности, насекомых), но также и позвоночных животных, патогенных грибов и бактерий (Каменёк и др., 2008; Manasherob et al., 2003). Помимо этого, цитолитические белки Cyt-семейства могут оказывать летальное действие в отношении клеток E.coli, нарушая связь нуклеоида с цитоплазматической мембраной, что влечёт за собой блокирование репликации ДНК нуклеоида, его компактизацию в центре клетки и, как следствие, последующему частичному лизису и гибели бактериальной клетки. (Manasherob et al., 2003)

Bacillus thuringiensis - излюбленный объект биотехнологии в сфере производства биопестицидов, причём препараты на её основе составляют 90-95% от всего рынка биопестицидов. (Добрица и др., 2001) Помимо основы для таких препаратов, Bt является источником генов, детерминирующих токсины, для их последующего клонирования и создания трансгенных растений, устойчивых к различным патогенам (Kota et al., 1999; Vaughn et al., 2005; Fang et al., 2007). Показан также цитоцидный эффект белков параспоральных включений ряда штаммов BТ по отношению к опухолевым клеткам (HeLa, Ythg2, HL60 и др.), а также некоторым культурам нормальных клеток человека (Ito et al., 2004; Kitada et al., 2006).

2. Токсины Bacillus thuringiensis

2.1 Общая характеристика и структура токсинов

Токсины, продуцируемые BT, представляют собой белки с молекулярной массой от 130 до 140 кДа либо около 70 кДа для Сry-токсинов (Pigott, Ellar, 2007), 100 или 88 кДа для Vip-токсинов(Lee et al., 2003), 26-28 либо 60 кДа для Cyt-токсинов (Manasherob et al., 2003).

Рис.1. Группы Cry- и Cyt-белков, выделенные на основании сходства их аминокислотных последовательностей и представленные графически в виде радиальной филлограммы. Группы сходства заштрихованы. (По Schnepf et al., 1998, на основании данных Crickmore et al., 1998)

Принятая в настоящее время классификация токсинов основана на степени сходства их консервативных аминокислотных последовательностей, первичной и вторичной структуры (Crickmore et al., 1998; Schnepf et al., 1998), что отражает эволюционную дивергенцию между подвидами и штаммами. (Добрица и др., 2001) В соответствии с этим выделяют два мультигенных семейства токсинов: Cry и Cyt (рис.1) (Crickmore et al., 1998)

Следует отметить, что эта система классификации касается тех токсинов, которые продуцируются в период стационарной фазы роста популяции бактериальных клеток, в зависимости или независимо от процесса споруляции, и формируют параспоральные кристаллические включения внутри клетки (рис.2). Таким образом, эти белки следует относить к эндотоксинам.

Рис.2. Клетка Bacillus thuringiensis subsp. israelensis после споруляции (А) и её типичное параспоральное тельце с указанием взаиморасположения в нём включений индивидуальных токсинов (В). Sp - спора, Е - экзоспориум, РВ - параспоральное тельце (По Federici et al., 2003)

Протеины групп Cry1, Cry2 и Cry9 токсичны для насекомых отряда Чешуекрылые, а групп Cry3, Cry7 и Cry8 - для представителей отряда Жесткокрылые. Токсины групп Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 и Cyt активны в отношении видов отряда Двукрылые, а Cry5, Cry12, Cry13 и Cry14 обладают нематоцидным действием (Bravo et al., 1998).

Однако эндотоксины Cry- и Cyt-семейств - далеко не единственные факторы, обусловливающие пестицидную активность ВТ: определённый вклад вносят также фосфолипазы, протеазы, хитиназы, продуцируемые ВТ, а также пестицидные белки (VIP-белки), продуцируемые некоторыми штаммами ВТ на протяжении фазы вегетативного роста (Добрица и др., 2001; Schnepf et al., 1998). Аббревиатура VIP (vegetative insecticidal protein) отражает особенности их синтеза (во время периода вегетативного роста), хотя при таком рассмотрении данный термин не вполне корректен, поскольку некоторые Cry-токсины также продуцируются в фазе вегетативного роста (Schnepf et al., 1998). В связи с широким и длительным использованием биопестицидов на основе именно д-эндотоксинов и приобретением многими видами насекомых устойчивости к ним (Tabashnik, 1997; Onstad, 2008), подробное изучение VIP-токсинов перспективно в плане их использования как альтернативы препаратам на основе Cry-протеинов. VIP-протеины не обнаруживают никакого сходства по первичной, вторичной и третичной структуре с белками семейств Cry и Cyt, для них существует отдельная номенклатура, в соответствии с которой они объединены в 3 семейства: Vip1, Vip2, Vip3. Белки Vip1 и Vip2 - компоненты бинарного токсина, активного в отношении представителей отряда Coleoptera (Rang et al., 2005).

Рис.3. Трёхмерная кристаллическая структура Cry-токсинов на примере Cry3Aa и Cry1Aa. Домен I показан красным цветом, домен II - зелёным, домен III - синим. (По Pigott, Ellar, 2007)

Все токсины Cry-семейства - белки, состоящие из трёх основных функционально значимых единиц - доменов. Каждый домен имеет специфический аминокислотный состав, вторичную и третичную структуру (рис.3).

Домен I представляет собой связку б-спиралей, в которой шесть спиралей окружают одну центральную спираль. Каждая из этих шести внешних спиралей имеет амфипатическую природу (т.е. имеет и гидрофильную, и гидрофобную части). Заряженные или полярные остатки, как правило, расположены на тех частях домена, которые контактируют с растворителем, а гидрофобные остатки, обычно ароматической природы, находятся на частях, обращённых к центральной б-спирали. Полярные группы представлены в межспиральном пространстве, но все они участвуют в образовании водородных связей или солевых мостиков (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007). Следует отметить, что структура домена I сходна с таковой у порообразующего домена колицина. Домен I - главный детерминант процесса образования пор в плазматической мембране, например, мембране ворсинок эпителиальных клеток кишечника насекомых, он способен встраиваться в липидный бислой мембраны, пронизывая его (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007).

Домен II образован тремя антипараллельными в-слоями, упакованными воедино так, что они формируют в-призму с псевдотрёхлучевой симметрией. Два из этих слоёв обращены по направлению к окружающему молекулу токсина растворителю (т.е. наружу), а третий располагается рядом с доменом I. По своей структуре домен II проявляет наибольшую вариабельность среди всех трёх доменов Cry-токсинов, это особенно справедливо для трёх верхушечных петель домена II, структура и роль которых в настоящее время интенсивно изучаются (Pigott et al., 2008). Домен II играет главную роль в определении специфичности действия токсина, связываясь с определённым рецептором на плазматической мембране (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007). Важная роль петель в специфическом связывании токсина была, например, подтверждена путём мутагенеза в последовательности размером 30 нуклеотидов, которая кодирует последовательность аминокислот домена II, при этом лишь мутации, затрагивающие сериновые остатки, расположенные в области петель, приводили к выраженному снижению токсичности продукта такого мутантного гена для личинок насекомых (Aronson et al., 1995). Направленный мутагенез был использован и для редизайна CryIAa токсина, активного в отношении гусениц-вредителей, в токсин, действующий против москитов (Liu, Dean, 2006). Это было сделано путём делеций и замены нуклеотидов в последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность петли домена II.

Домен III сформирован "сэндвичем" из двух антипараллельных в-слоёв, в котором внешний слой обращён к окружающему молекулу белка растворителю, а внутренний располагается рядом с доменом II. Две длинные петли отходят от одного конца домена III и взаимодействуют с доменом I. Домен III с отходящими от него петлями образует уникальный сайт связывания с определёнными углеводами, на основании чего полагают, что он усиливает действие токсина путём повышения его эффективной концентрации на поверхности субстрата, т.е. плазматической мембраны (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007).

Рис.4. Трёхмерная структура Cyt-токсинов на примере Cyt2A (По Schnepf et al., 1998)

Что касается структуры Cyt-токсинов, то они, в отличие от Cry-токсинов, состоят из единственного домена (рис.4), в котором два внешних слоя б-спиралей окружают смешанный в-слой (Schnepf et al., 1998).

Нельзя не обратить внимание на тот факт, что положение определённых аминокислотных остатков в доменах молекул токсинов является консервативным и функционально важным, например, для Cry-протеинов выявлены восемь остатков триптофана, замена которых на другие аминокислотные остатки путём сайт-специфического мутагенеза соответствующих Cry-генов приводит к снижению токсичности таких мутантных белков для насекомых (Padilla et al., 2006).

2.2 Механизм действия токсинов

Клетками-мишенями для белков Cry-семейства (т.н. д-эндотоксинов) являются эпителиальные клетки средней кишки насекомых, а также некоторых других беспозвоночных. Белки Cyt-семейства, в отличие от Cry-токсинов, способны вызывать лизис многих типов клеток, что обусловлено их структурой, т.к. у них не найден специфический домен, ответственный за связывание со строго определённым типом рецепторов, а механизм их действия отличен от такового у Cry-токсинов (Schnepf et al., 1998). Кроме этого, в последние годы вызывают пристальное внимание учёных особые белки, относящиеся к Cyt-семейству, которые были названы параспоринами (параспорин-1 и параспорин-2). Для параспоринов характерно то, что они не являются инсектицидными белками, но обладают активностью в отношении клеток позвоночных животных, в частности, млекопитающих (Katayama et al., 2007), а также специфически распознают и уничтожают клетки раковых опухолей печени и толстой кишки человека и определённые типы нормальных клеток человека (Kitada et al., 2006).

Следует отметить, что термин "токсины" по отношению к пестицидным белкам, продуцируемым ВТ, употребляется в широком смысле, в т.ч. и для обозначения внутриклеточных параспоральных кристаллических включений. Это не совсем корректно, поскольку белки в составе кристаллических включений представляют собой протоксины, т.е. неактивную форму, из которой в кишечнике беспозвоночных путём ограниченного протеолиза образуется активный токсин.

В общем виде процесс действия д-эндотоксинов Cry-семейства на клетки кишечного эпителия насекомых, в соответствии с наиболее распространённой моделью, можно представить как последовательность следующих этапов (Schnepf et al., 1998; Pigott, Ellar, 2007; Soberon, Bravo, 2008):

1) Растворение кристаллических включений, содержащих молекулы протоксина, в кишечнике насекомых за счёт особых условий в нём (определённый рН, присутствие кишечных ферментов).

2) Активация токсина: процесс превращения протоксина (неактивной формы) в токсин (активная форма) путём частичного протеолиза под воздействием протеаз кишечного сока насекомых. При этом отщепление полипептидных фрагментов, не входящих в состав зрелого токсина, может происходить для различных токсинов либо с N-, либо с С-конца молекулы протоксина (Лосева и др., 1996).

3) Связывание активного токсина с первым специфическим рецептором на мембране щёточной каёмки кишечного эпителия (самый распространённый класс рецепторов - кадгериновые рецепторы).

4) Дальнейшее конформационное изменение молекулы токсина, индуцированное контактом с первым специфическим рецептором, приводит к отщеплению небольшого фрагмента с N-конца молекулы - б-спирали 1.Это отщепление делает открытыми гидрофобные области домена I, которые ранее были обращены вовнутрь и, таким образом, закрыты, а также инициирует формирование из четырёх таких молекул токсина единой тетрамерной структуры.

5) Олигомерная структура (тетрамер), обладая повышенным сродством ко второму специфическому рецептору, аминопептидазе N (APN), эффективно связывается с ним. Аминопептидаза N способствует встраиванию олигомерной структуры в мембрану клетки, в результате чего формируется пора.

6) На последнем этапе протекают процессы, приводящие к гибели клетки: осмотический шок и лизис клеток вследствие свободного прохождения воды и растворённых веществ через поры, а также, в соответствии с другими моделями (Pigott, Ellar, 2007), в результате предшествующей инициации серии определённых внутриклеточных сигналов, приводящих к запуску процесса гибели клетки.

Описанная выше модель действия Cry-токсинов на клетки кишечного эпителия насекомых получила название модели Bravo (Pigott, Ellar, 2007), по фамилии учёного, её предложившего и обосновавшего. Схема взаимодействия д-эндотоксина с клеткой-мишенью на примере белка Cry1A (Soberon, Bravo, 2008) в соответствии с этой моделью показана на рис.5.

Рис.5. Схема действия д-эндотоксина на клетку-мишень на примере Cry1А токсина по модели Bravo (По Soberon, Bravo, 2008)

В соответствии с моделью Bravo при формировании в мембране одной клетки двухсот или даже менее таких литических пор, имеющих радиус 0,5-1нм, происходит очень быстрое изменение мембранного потенциала клетки, выравнивание концентрации ионов по обе стороны мембраны, приток воды в клетку, её разбухание и, в итоге, лизис (Pigott, Ellar, 2007). Таким образом, собственно механизм цитоцидного действия д-эндотоксинов - осмотический лизис.

Интересно отметить, что на активность инсектицидных токсинов BT могут оказывать действие протеазы кишечника насекомых. При этом для различных токсинов их действие может быть различным, усиливающим или ингибирующим. В частности, для токсина Cry1Ab показано, что протеолитическое отщепление фрагментов мембранными протеазами снижает уровень его активности (Fortier et al., 2007). Ещё один факт, заслуживающий внимания - это двухэтапный механизм взаимодействия молекул д-эндотоксинов в составе олигомера со вторичным рецептором - APN. Было установлено (Cooper et al., 1998), что первая стадия взаимодействия является быстрой и обратимой, может ингибироваться определёнными сахарами и реагентами, используемыми для разрыва белок-белковых взаимодействий. Вторая стадия - медленная и необратимая, не ингибируется указанными веществами. В случае использования мутантного штамма BT, продуцирующего изменённый Cry1Ac токсин, способный связываться с APN на первой, но не на второй стадии, было показано снижение его уровня активности по отношению к личинкам Manduca Sexta (Cooper et al., 1998). Это может дать представление об одном из возможных путей возникновения устойчивости насекомых к д-эндотоксинам.

Всего существуют три модели механизма цитоцидного действия д-эндотоксинов на клетки кишечного эпителия насекомых, которые являются не взаимоисключающими, а взаимодополняющими. Помимо вышеупомянутой модели Bravo существуют модели Zhang и Jurat-Fuentes (Pigott, Ellar, 2007).

Согласно модели Zhang, токсичность Cry-протеинов определяется не только способностью вызывать осмотический лизис клетки. В этом случае мономерный Cry-токсин, связываясь с первичным рецептором, инициирует - зависимый каскадный сигнальный путь, который влечёт за собой стимуляцию белка G, аденилатциклазы, повышает уровень цАМФ и активирует протеинкиназу А, что приводит к дестабилизации цитоскелета и ионных каналов и влечёт за собой гибель клетки (Zhang et al., 2006).

Модель Jurat-Fuentes, по сути дела, объединяет в себе две вышеупомянутые модели, подразумевая, что цитотоксичность д-эндотоксинов зависит как от эффекта осмотического лизиса, так и от инициации специального внутриклеточного сигнального пути. Разница заключается лишь в том, что, в отличие от модели Zhang, автор полагает, что сигнальный путь регулируется фосфатазами, а также взаимодействием токсина с актином, входящим в состав цитоскелета и взаимодействующим с молекулой кадгерина. В отличие от модели Bravo, олигомерный токсин взаимодействует не только с APN, но и с другими определёнными классами рецепторов (Pigott, Ellar, 2007).

Помимо рассмотренных механизмов действия д-эндотоксинов, заслуживают внимания данные о том, что д-эндотоксины BT способны в 2-5 раз снижать сопротивление искусственных фосфолипидных мембран, причём эта способность прямо пропорциональна концентрации токсина, а методами ИК- и ЯМР-спектроскопии обнаружено, что эндотоксин является потенциальным природным разобщителем-протонофором из-за наличия большого количества лабильных протонов (Каменек и др., 2008). Представляют также интерес сведения о системном эффекте д-эндотоксинов в гемоцеле насекомых: ряд Cry-токсинов способен при введении их в гемоцель вызывать быстрый паралич и смерть личинок насекомых, при более низких концентрациях приводит к различным нарушениям при окукливании, а при воздействии на культуру нервных клеток насекомых, полученную из клеток надглоточного ганглия, вызывать лизис и гибель нейронов (Cerstiaens et al., 2001). биопестицид трансгенный патоген токсин

Токсины семейств Vip и Cyt также разрушают клетки по механизму осмотического лизиса, формируя в мембране поры, хотя для некоторых Cyt-токсинов не доказано формирование пор в мембране при их взаимодействии с клеткой. Но сами способы связывания с мембраной и образования в ней каналов, приводящих к осмотическому лизису, отличаются от таковых для Cry-токсинов (Schnepf et al., 1998; Lee et al., 2003).

Уже упоминавшиеся параспорины, специфически воздействующие на раковые клетки и ряд типов нормальных клеток человека, обладают отличным от д-эндотоксинов механизмом действия. Так, действие на клетку

параспорина-1 приводит к быстрому возрастанию внутриклеточной концентрации , что ведёт к активации сигнального пути апоптоза, при этом была обнаружена активация G-белка и каспазы, специфического фермента апоптоза (Katayama et al., 2007). Параспорин-2 действует как цитолизин, обуславливая морфологические изменения всей клетки в целом и её цитоскелета, фрагментацию митохондрий и эндоплазматического ретикулума, а также увеличение проницаемости клеточной мембраны с последующим выходом из клетки большинства цитоплазматических белков (Kitada et al., 2006).

2.3 Генетические детерминанты токсинов

Уже показанное в разделе 3.1 многообразие как групп токсинов, так и индивидуальных токсинов является следствием высокой генетической пластичности Bacillus thuringiensis (Schnepf et al., 1998). Большинство генов, детерминирующих синтез токсинов, локализованы в больших плазмидах (Berry et al., 2002; Agaisse, Lereclus, 1995), многие из которых являются конъюгативными в природе (Schnepf et al., 1998). Помимо этого, в составе генома различных штаммов BT присутствуют разнообразные транслоцируемые генетические элементы - IS-элементы и транспозоны, поэтому Cry-гены в составе плазмид нередко входят в состав сложных транслоцируемых генетических конструкций (Добрица и др., 2001; Baum, 1994). В качестве примера можно привести ген Cry1А, фланкированный с обеих сторон инвертированными повторами, которые были определены как вставочные последовательности IS231 и IS232. Эти IS-элементы, очевидно, обеспечивают генетическую мобильность Cry1А гена, образуя вместе с ним типичный сложный транспозон (Schnepf et al., 1998). Кроме конъюгации, перенос генетического материала может обеспечиваться и путём трансдукции.

Все описанные выше особенности организации генома BT обеспечивают возможность обмена генетическим материалом между штаммами ВТ и другими видами бактерий, как близкородственными (B. cereus, B. anthracis), так и более отдалёнными в генетическом отношении, такими, как B. subtilis, B. megaterium, B. sphaericus (Добрица и др., 2001; Han et al., 2006). Таким образом, для BT характерно участие в горизонтальном переносе генетического материала между видами семейства Bacillaceae, особенно с близкородственными видами, например, B. cereus (Schnepf et al., 1998).

Размер генома различных штаммов ВТ варьирует от 2,4 до 5,7 миллионов п.н. Для большинства штаммов ВТ размер плазмид, находящихся в бактериальной клетке, составляет 2 - 600 т.п.н. Cry-гены в большинстве своём локализованы в крупных плазмидах, в качестве примера можно привести мегаплазмиду pBtoxis, являющуюся генетическим детерминантом токсинов в клетках B. thuringiensis subsp. israelensis (Berry et al., 2002). Размер этой плазмиды составляет 127 923 п.н., и она реплицируется по тета-механизму типа А. Плазмида pBtoxis кодирует все шесть токсинов, обнаруженных в клетках этой бактерии: Cry4Aa, Cry4Ba, Cry10Aa, Cry11Aa, Cyt1Aa и Cyt2Ba, а также несёт несколько вставочных последовательностей и кодирует два протеина (P19 и P20), которые способствуют формированию кристаллических внутриклеточных включений и повышают жизнеспособность бактериальной клетки, действуя, вероятно, как шапероны (Berry et al., 2002). Помимо этого, в составе оперона, расположенного непосредственно вблизи точки инициации репликации, идентифицированы два гена, pBt156 и pBt157, кодирующие белки, необходимые для репликации плазмиды, массой 54,4 кДа и 11,8 кДа соответственно (Tang et al., 2006).

Некоторые общие характеристики pBtoxis даны в таблице 1, а комбинированная круговая карта плазмиды - на рис.6.

Таблица 1 Некоторые характеристики pBtoxis (По Berry et al., 2002)

Характеристика	Значение
Общий размер	127 923 п.н.
Содержание G + C	32,42%
Число кодирующих последовательностей	125
Число псевдогенов	8
Кодирующая плотность	63,5%
Средняя длина гена	725 п.н.

Рис.6. Комбинированная круговая карта мегаплазмиды pBtoxis

Внутренний круг отражает соотношение G-C / G+C (положительные значения - цвета хаки, отрицательные - пурпурного цвета), второй круг отражает содержание G + С. Два внешних круга дают представление о взаиморасположении генов на комплементарных нитях ДНК, при этом использованы следующие цветовые обозначения: серый - токсины и антибиотики, розовый - гены, связанные с транспозонами, оранжевый - гипотетически консервативные последовательности, красный - гены метаболизма ДНК, голубой - регуляторные гены, светло-зелёный - гены, детерминирующие поверхностные структуры клетки, бледно-зелёный - неизвестные гены, жёлтый - различные гены метаболизма. Внешняя шкала маркирована в т.п.н. (По Berry et al., 2002)

Cry-гены в зависимости от времени и механизма активации их экспрессии подразделяют на гены, зависящие от споруляции, и гены, не зависящие от споруляции. Протекание различных этапов процесса споруляции обеспечивается синтезом определённых мРНК и их трансляцией, причём последовательность синтеза задаётся тем, какой именно у-фактор свяжется с кор-ферментом РНК-полимеразы. Соответственно на разных стадиях споруляции последовательно активируются определённые у-факторы. Так, у Bacillus subtilis процесс прохождения различных этапов жизненного цикла, включая споруляцию, регулируют шесть последовательно активируемых у -факторов: , , , , и . Такой же механизм активации экспрессии генов во время споруляции характерен и для BT, а её соответствующие у-факторы обладают высокой степенью сходства по аминокислотной последовательности с аналогичными у-факторами B. subtilis (Agaisse, Lereclus, 1995).

Типичным примером Cry-гена, зависимого от споруляции, может служить ген Cry1A, транскрипция которого идёт с двух сильных перекрывающихся промоторов, BtI и BtII, используемых последовательно, причём в транскрипции этого гена in vivo принимают участие оба специфических у-фактора, и (Adams et al., 1991; Agaisse, Lereclus, 1995).

К генам, не зависимым от споруляции, относится ген Cry3A, транскрипция с промотора которого идёт слабо, но стабильно во время вегетативной фазы роста, активируется в конце экспоненциального роста и идёт только до определённого этапа споруляции. В отличие от промоторов BtI и BtII, Cry3A промотор подобен промоторам, распознаваемым первичными у-факторами вегетативных бактериальных клеток, как, например, . Более того, экспрессия гена Cry3A усилена и пролонгирована в мутантных штаммах BT, не способных к инициации споруляции (Agaisse, Lereclus, 1995).

Данные о нуклеотидной последовательности промоторов некоторых Cry-генов приведены в таблице 2.

Таблица 2 Нуклеотидная последовательность промоторов некоторых Cry-генов (По Agaisse, Lereclus, 1995)

Промотор	Область -35	Спейсер	Область -10
Распознаваемый (B. thuringiensis)	GCATNT	N14 или 15	CATANNNT
Cry1A(a) BtI	GCATTT	N15	CATATGTTT
Распознаваемый (B. thuringiensis)	Н/О	Н/О	TNATANNNTG
Cry1A(a) BtII	Н/О	Н/О	TCATAAGATG
Распознаваемый (B. subtilis)	TTGACA	N17 или 18	TATAAT
Cry3A	TTGCAA	N18	TAAGCT
Примечание: Н/О - не определено.

2.4 Биотехнология Bacillus thuringiensis

Биотехнологические проекты с использованием BT ведутся в двух основных направлениях: 1) использование различных штаммов ВТ в качестве источника генетических детерминант токсинов с целью создания новых трансгенных организмов, которые изначально не обладают способностью к синтезу пестицидных белков; 2) улучшение уже известных штаммов ВТ и родственных ей видов путём повышения биологической активности токсинов и расширения спектра действия пестицидных белков, синтезируемых конкретным штаммом, с целью последующего получения биопестицидных препаратов (Добрица и др., 2001; Federici et al., 2003; Walters et al., 2008).

В первом направлении большинство работ ведётся в области создания трансгенных растений и бактерий (Schnepf et al., 1998). Трансгенные растения, способные экспрессировать Cry-гены, обладают высокой степенью устойчивости к своим специфическим вредителям, за исключением случаев приобретения последними устойчивости к токсинам. В качестве примера можно привести трансгенный сорт кукурузы MON863, устойчивый к Diabrotica spp. Он был получен путём введения в клетки зародыша растения ДНК-вектора, который содержал модифицированный Cry3Bb1 ген, встроенный под промотор 4-AS1, с которого идёт синтез белка, усиливающего рост корней растения. Сам вектор со встроенным геном Cry3Bb1 был введен в клетки методом бомбардировки микрочастицами (Vaughn et al., 2005). Чужеродные гены могут быть введены в растительную клетку также с использованием векторов на основе вирусов растений и Ti-плазмид (Щелкунов, 2004).

Трансгенные бактерии используют в качестве биологического средства борьбы с различными вредителями сельского хозяйства и переносчиками определённых заболеваний. Например, сконструирован рекомбинантный штамм ВТ, несущий наряду с москитоцидными Cry- и Cyt-генами дополнительный ген, детерминирующий бинарный токсин, источником которого послужил геном Bacillus sphaericus. Этот трансгенный штамм обладает высокой инсектицидной активностью по отношению к представителям рода Culex (Federici et al., 2003). Путём конъюгационного переноса из клеток BT Cry-генов, продукты которых активны в отношении Чешуекрылых, в клетки Bacillus megaterium удалось также получить рекомбинантный штамм, продуцирующий инсектицидные белки. Поскольку использованный штамм B. megaterium в естественных условиях обитает на поверхности листьев хлопчатника, то обработка растений хлопчатника живой культурой клеток рекомбинантного штамма обусловила высокую степень устойчивости растений к поражению личинками Heliothis armigera: на протяжении 21 дня после обработки смертность личинок составляла 75-96% (Bora et al., 1994).

Что касается второго направления в биотехнологии ВТ, то оно подразумевает молекулярно-генетические манипуляции, генную и белковую инженерию, направленные на получение промышленных штаммов ВТ для производства биопестицидов и некоторых других препаратов. Так, значительное повышение инсектицидной активности штаммов ВТ может быть достигнуто путём создания рекомбинантных бактериальных клеток, Cry- и Cyt-гены которых происходят из различных штаммов. Таким образом добиваются расширения спектра действия препаратов, полученных на основе таких генно-инженерных штаммов (Добрица и др., 2001; Baum et al., 1996). В ряде случаев наблюдается синергетический эффект, когда один токсин усиливает действие другого или же оба токсина оказывают взаимоусиливающее влияние. В качестве примера можно привести Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, штамм IPM-46. В препаратах на основе этого рекомбинантного штамма Cry3A токсин проявляет значительно большую активность против колорадского жука, чем в исходном штамме, за счёт усиления его активности токсином Cry1A. Полагают, что в этом случае Cry3A отвечает за связывание с рецепторами на мембране клеток кишечного эпителия колорадского жука, а Cry1A, обладая более высокой пороформирующей способностью по сравнению с Cry3A, образует собственно пору (Добрица и др., 2001). Интересно, что Cyt-токсины вследствие своего значительно более широкого спектра действия и высокой способности к порообразованию способны усиливать активность Cry-токсинов и расширять круг их видов-мишеней, функционируя, очевидно, как мембраносвязанный рецептор для самих Cry-токсинов (Manasherob et al., 2003; Perez et al., 2005). Таким образом, синергетический эффект основан на межмолекулярных взаимодействиях токсинов.

Недостатком непосредственного использования клеток ВТ после споруляции в качестве биопестицида или их споро-кристаллических комплексов является засорение окружающей среды спорами, поэтому часто для наработки токсинов в составе внутриклеточных кристаллических включений используют либо мутантные штаммы ВТ, неспособные к спорообразованию, либо штаммы других видов бактерий, например, представителей рода Pseudomonas. В последнем случае можно получить так называемые инкапсулированные биопестициды, в которых д-эндотоксины защищены от действия повреждающих факторов внешней среды клеточной оболочкой (Добрица и др., 2001).

Генно-инженерные манипуляции, направленные на определённые последовательности в составе генов, детерминирующих токсины, могут изменять свойства продукта этих генов. Например, путём сайт-специфического мутагенеза в последовательностях, кодирующих петли домена II, можно получить токсин, проявляющий специфичность уже по отношению к другому виду насекомых-вредителей (Liu, Dean, 2006), а путём изменения сайта распознавания для протеаз в домене I можно повысить активность токсина (Walters et al., 2008).

3. Прикладное использование Bacillus thuringiensis как продуцента хозяйственно полезных токсинов

Обобщив все изложенные выше сведения о применении ВТ и её токсинов, можно указать такие основные сферы практического использования, как производство биопестицидов, создание и использование трансгенных растений и бактерий, сельское и лесное хозяйство.

Более частными направлениями являются:

1) создание и использование рекомбинантных штаммов бактерий для защиты растений от вредителей, для контроля численности и уничтожения насекомых, переносящих возбудителей опасных заболеваний (особенно в тропических странах);

2) внедрение и использование в сельском и лесном хозяйстве трансгенных растений, экспрессирующих гены токсинов ВТ и устойчивых к различным вредителям;

3) использование ВТ в промышленном производстве препаратов, обладающих активностью в отношении вредных насекомых, нематод, фитопатогенных грибов и бактерий;

4) применение в сельском хозяйстве биопестицидов на основе ВТ для получения большего количества сельхозпродукции вследствие снижения ущерба, наносимого вредителями;

5) использование различных штаммов ВТ в качестве источников генетических детерминант токсинов для различных генно-инженерных манипуляций;

6) использование в медицине (например, параспорины как противораковые препараты).

Заключение

На основании представленного материала можно сделать вывод, что Bacillus thuringiensis как продуцент хозяйственно ценных токсинов вызывает пристальное внимание учёных всего мира, поскольку биопестициды на основе различных штаммов этой бактерии обладают неоспоримыми преимуществами по сравнению с пестицидами, выпускаемыми химической промышленностью. За относительно небольшой период времени (около 50 лет), особенно если учесть большое внутривидовое разнообразие BT вследствие её высокой генетической пластичности, было опубликовано множество научных работ, посвящённых самой бактерии и её биотехнологии, её токсинам и их генетическим детерминантам. Препараты на основе д-эндотоксинов ВТ на протяжении довольно длительного времени используются в сельском хозяйстве высокоразвитых стран, однако это наряду с ощутимым положительным эффектом породило новую проблему - устойчивость насекомых-вредителей к д-эндотоксинам ВТ. Это заставляет искать новые подходы к увеличению эффективности действия биопестицидов, например, интенсивное использование методов генной инженерии для получения штаммов с набором токсинов, проявляющих синергетический эффект, а также для изменения структуры самих токсинов. В качестве потенциального дополнения или основы для новых биопестицидных препаратов рассматриваются Vip-токсины и в-экзотоксины. Интересны и перспективны в качестве противоракового средства были бы препараты на основе параспоринов, которые могли бы найти применение в клинической онкологии. Вместе с тем в настоящее время недостаточно полно охарактеризованы генетические детерминанты токсинов, в частности, плазмиды. Причина этого во многом кроется в значительном разнообразии генетических элементов ВТ вследствие уже упоминавшейся высокой генетической пластичности данного вида бактерий.

Список использованной литературы

1. Андреева И.С., Печуркина Н.И., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Саранина И.В., Репин В.Е. Атипичные штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные из почвы и горячих источников Долины гейзеров (Камчатка) // Биотехнология. - 2008. - № 6. - с. 41-50.

2. Добрица А.П., Корецкая Н.Г., Гайтан В.И., Коломбет Л.В., Дербышев В.В., Жиглецова С.К. Разработка биопестицидов против колорадского жука // Рос. хим. ж. - 2001. - т.XLV, № 5-6. - с. 174-184.

3. Каменек Д.В., Ильинская О.Н., Цофина Л.М., Каменек Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis как природный протонофор: анализ методами ИК- и ЯМР спектроскопии // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2008. - Т. 150, кн. 1. - с. 69-75.

4. Каменёк Л.К., Каменёк Д.В., Тюльпинёва А.А., Терпиловский М.А. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении фитопатогенных грибов родов Phytophtora и Fusarium // Биотехнология. - 2008. - № 5. - с. 76-83.

5. Кузин А.И., Кузнецова Н.И., Григорьева Т.М., Зубашева М.В., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Штамм Bacillus thuringiensis Т-281, обладающий бинарной пестицидной активностью // Биотехнология. - 2008. - № 4. - с. 28-34.

6. Лосева О.И., Киркитадзе М.Д., Добрица А.П., Потехин С.А. Термодинамический анализ доменной организации токсинов Bacillus thuringiensis // Биоорганическая химия. - 1996. - Т. 22, № 12. - с. 900-906.

7. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - 496 с.

8. Adams L.F., Brown K.L., Whiteley H.R. Molecular Cloning and Characterization of Two Genes Encoding Sigma Factors That Direct Transcription from a Bacillus thuringiensis Crystal Protein Gene Promoter // Journal of Bacteriology. - 1991. - Vol. 173, No 12. - p. 3846-3854.

9. Agaisse H., Lereclus D. How Does Bacillus thuringiensis Produce So Much Insecticidal Crystal Protein? // Journal of Bacteriology. - 1995. - Vol. 177, No. 21. - p. 6027-6032.

10. Aronson A.I., Wu D., Zhang C. Mutagenesis of Specificity and Toxicity Regions of a Bacillus thuringiensis Protoxin Gene // Journal of Bacteriology. - 1995. - Vol. 177, No. 14. - p. 4059-4065.

11. Baum J.A. Tn5401, a New Class II Transposable Element from Bacillus Thuringiensis // Journal of Bacteriology. - 1994. - Vol. 176, No.10. - p. 2835-2845.

12. Baum J.A., Kakefuda M., Gawron-Burke C. Engineering Bacillus thuringiensis Bioinsecticides with an Indigenous Site-Specific Recombination System // Applied and Environmental Microbiology. - 1996. - Vol. 62, No.12. - p. 4367-4373.

13. Berry C., O'Neil S., Ben-Dov E., Jones A.F., Murphy L., Quail M.A., Holden M.T.G., Harris D., Zaritsky A., Parkhill J. Complete Sequence and Organization of pBtoxis, the Toxin-Coding Plasmid of Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis // Applied and Environmental Microbiology. - 2002. - Vol. 68, No. 10. - p. 5082-5095.

14. Bora R.S., Murty M.G., Shenbagarathai R., Sekar V. Introduction of a Lepidopteran-Specific Insecticidal Crystal Protein Gene of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki by Conjugal Transfer into a Bacillus megaterium Strain That Persists in the Cotton Phyllosphere // Applied and Environmental Microbiology. - 1994. - Vol. 60, No.1. - p. 214-222.

15. Bravo A., Sarabia S., Lopez L., Ontiveros H., Abarca C., Ortiz A., Ortiz M., Lina L., Villalobos F.J., Pena G., Nunez-Valdez M.-E., Soberon M., Quintero R. Characterization of cry Genes in a Mexican Bacillus thuringiensis Strain Collection // Applied and Environmental Microbiology. - 1998. - Vol. 64, No. 12. - p. 4965-4972.

16. Cerstiaens A., Verleyen P., Van Rie J., Van Kerkhove E., Schwartz J.-L., Laprade R., De Loof A., Schoofs L. Effect of Bacillus thuringiensis Cry1 Toxins in Insect Hemolymph and Their Neurotoxicity in Brain Cells of Lymantria dispar // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - Vol. 67, No. 9. - p. 3923-3927.

17. Cooper M.A., Carroll J., Travis E.R., Williams D.H., Ellar D.J. Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin interaction with Manduca sexta aminopeptidase N in a model membrane environment // Biochem. J. - 1998. - No. 333. - p. 677-683.

18. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Dean D.H. Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 1998. - Vol. 62, No. 3. - p. 807-813.

19. Fang J., Xu X., Wang P., Zhao J.-Z., Shelton A.M., Cheng J., Feng M.-G., Shen Z. Characterization of Chimeric Bacillus thuringiensis Vip3 Toxins // Applied and Environmental Microbiology. - 2007. - Vol. 73, No.3. - p. 956-961.

20. Federici B.A., Maddox J.V. Host specificity in microbe-insect interactions // Bioscience. - 1996. - Vol. 46, No. 6. - p. 410-421.

21. Federici B.A., Park H.-W., Bideshi D.K., Wirth M.C., Johnson J.J. Recombinant bacteria for mosquito control // The Journal of Experimental Biology. - 2003. - No. 206. - p. 3877-3885.

22. Fortier M., Vachon V., Frutos R., Schwartz J.-L., Laprade R. Effect of Insect Larval Midgut Proteases on the Activity of Bacillus thuringiensis Cry Toxins // Applied and Environmental Microbiology. - 2007. - Vol. 73, No. 19. - p. 6208-6213.

23. Han C.S., Xie G., Challacombe J.F., Altherr M.R., Bhotika S.S., Bruce D., Campbell C.S., Campbell M.L., Chen J., Chertkova O., Cleland C., Dimitrijevic M., Doggett N.A., Fawcett J.J., Glavina T., Goodwin L.A., Hill K.K., Hitchcock P., Jackson P.J., Keim P., Kewalramani A.R., Longmire J., Lucas S., Malfatti S., McMurry K., Meincke L.J., Misra M., Moseman B.L., Mundt M., Munk A.C., Okinaka R.T., Parson-Quintana B., Reilly L.P., Richardson P., Robinson D.L., Rubin E., Saunders E., Tapia R., Tesmer J.G., Thayer N., Thompson L.S., Tice H., Ticknor L.O., Wills P.L., Brettin T.S., Gilna P. Pathogenomic Sequence Analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Isolates Closely Related to Bacillus anthracis // Journal of Bacteriology. - 2006. - Vol. 188, No. 9. - p. 3382-3390.

24. Ito A., Sasaguri Y., Kitada S., Kusaka Y., Kuwano K., Masutomi K., Mizuki E., Akao T., Ohba M. A Bacillus thuringiensis Crystal protein with Selective Cytocidal Action to Human Cells // The Journal of Biological Chemistry. - 2004. - Vol. 279, No. 20. - p. 21282-21286.

25. Kao S.S., Tzeng C.C., Tuan S.J., Tsai Y.S. Isolation, characterisation and cry gene typing of Bacillus thuringiensis from stored product material samples collected around Taiwan // The 2nd Pacific RIM conference on biotechnology of BT and its impact to the environment. - 1996, Taiwan - p. 132-151.

26. Katayama H., Kusaka Y., Yokota H., Akao T., Kojima M., Nakamura O., Mekada E., Mizuki E. Parasporin-1, a Novel Cytotoxic Protein from Bacillus thuringiensis, Induces Ca2+ Influx and a Sustained Elevation of the Cytoplasmic Ca2+ Concentration in Toxin-sensitive Cells // The Journal of Biological Chemistry. - 2007. - Vol. 282, No.10. - p. 7742-7752

27. Kegley S.E., Wise L.J. Pesticides in Fruits and Vegetables. - Sausalito, CA: University Science Books, 1998. - 104 p.

28. Kitada S., Abe Y., Shimada H., Kusaka Y., Matsuo Y., Katayama H., Okumura S., Akao T., Mizuki E., Kuge O., Sasaguri Y., Ohba M., Ito A. Cytocidal Actions of Parasporin-2, an Anti-tumor Crystal Toxin from Bacillus thuringiensis // The Journal of Biological Chemistry. - 2006. - Vol. 281, No. 36. - p. 26350-26360.

29. Kota M., Daniell H., Varma S., Garszinsky S.F., Gould F., Moar W.J. Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects // PNAS. - 1999. - Vol. 96. - p. 1840-1845.

30. Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.-S. The Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Ab д-Endotoxin // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol. 69, No. 8. - p. 4648-4657.

31. Liu X.S., Dean D.H. Redesigning Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin into a mosquito toxin // Protein Engineering, Design & Selection. - 2006. - Vol. 19, No.3 - p. 107-111.

32. Manasherob R., Zaritsky A., Metzler Y., Ben-Dov E., Itsko M., Fishov I. Compaction of the Escherichia coli nucleoid caused by Cyt1Aa // Microbiology. - 2003. - No.149. - p. 3553-3564.

33. Onstad D.W. Insect Resistance Management: Biology, Economics and Prediction. - San Diego, USA: Academic Press, 2008. - 305 p.

34. Padilla C., Pardo-Lopez L., De la Riva G., Gomez I., Sanchez J., Hernandez G., Nunez M.E., Carey M.P., Dean D.H., Alzate O., Soberon M., Bravo A. Role of Tryptophan Residues in Toxicity of Cry1Ab Toxin from Bacillus thuringiensis // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol. 72, No. 1. - p. 901-907.

35. Perez C., Fernandez L.E., Sun J., Folch J.L., Gill S.S., Soberon M., Bravo A. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cyt1Aa synergizes Cry11Aa toxin by functioning as a membrane-bound receptor // PNAS. - 2005. - Vol. 102, No. 51. - p. 18303-18308.

36. Pigott C.R., Ellar D.J. Role of Receptors in Bacillus thuringiensis Crystal Toxin Activity // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 2007. - Vol. 71, No. 2. - p. 255-281.

37. Pigott C.R., King M.S., Ellar D.J. Investigating the Properties of Bacillus thuringiensis Cry Proteins with Novel Loop Replacements Created Using Combinatorial Molecular Biology // Applied and Environmental Microbiology. - 2008. - Vol. 74, No.11. - p. 3497-3511.

38. Rang C., Gil P., Neisner N., Van Rie J., Frutos R. Novel Vip3-Related Protein from Bacillus thuringiensis // Applied and Environmental Microbiology. - 2005. - Vol. 71, No. 10. - p. 6276-6281.

39. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 1998. - vol. 62, no. 3. - p. 775-806.

40. Soberon M., Bravo A. Avoiding Insect Resistance to Cry Toxins from Bacillus thuringiensis // ISB News Report. - May 2008.

41. Tabashnik B.E. Seeking the root of insect resistance to transgenic plants // PNAS. - 1997. - vol. 94. - p. 3488-3490.

42. Tang M., Bideshi D.K., Park H.-W., Federici B.A. Minireplicon from pBtoxis of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol. 72, No. 11. - p. 6948-6954.

43. Tappeser B. The differences between conventional Bacillus thuringiensis strains and transgenic insect resistant plants. Possible reasons for rapid resistance development and susceptibility of non-target organisms // The third meeting of the Open-ended Working Group on Biosafety. - Okt 13-17 1998, Montreal, Canada.

44. Vaughn T., Cavato T., Brar G., Coombe T., DeGooyer T., Ford S., Groth M., Howe A., Johnson S., Kolacz K., Pilcher C., Purcell J., Romano C., English L., Pershing J. A Method of Controlling Corn Rootworm Feeding Using a Bacillus thuringiensis Protein Expressed in Transgenic Maize // Crop Science. - 2005. - Vol. 45. - p. 931-938.

45. Walters F.S., Stacy C.M., Lee M.K., Palekar N., Chen J.S. An Engineered Chymotrypsin/Cathepsin G Site in Domain I Renders Bacillus thuringiensis Cry3A Active against Western Corn Rootworm Larvae // Applied and Environmental Microbiology. - 2008. - Vol. 74, No. 2. - p. 367-374.

46. Wei J.-Z., Hale K., Carta L., Platzer E., Wong C., Fang S.-H., Aroian R.V. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes // PNAS. - 2003. - Vol. 100, No. 5. - p. 2760-2765.

47. Zhang X., Candas M., Griko N.B., Taussig R., Bulla L.A., Jr. A mechanism of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis // PNAS. - 2006. - No. 103. - p. 9897-9902.