Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей

Вплив фактора некрозу пухлини-А, інтерлейкіну-2, інтерферону-А на здатність ооцитів, ізольованих від кумулюсних клітин, відновлювати мейоз і формувати перше полярне тільце. Мейотичне дозрівання ооцитів в умовах порушення функціонального стану мітохондрій.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 14.09.2015
Размер файла 47,0 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

03.00.13. - Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей

Шепель Олена Анатоліївна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі імунології та цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу імунології та цитотоксичних сироваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Лазаренко Людмила Миколаївна,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів;

доктор медичних наук, професор

Чернишов Віктор Павлович,

Інститут педіатрії акушерства і гінекології АМН України,

завідувач лабораторії імунології

Захист відбудеться " 20 " травня " 2008 р. о 13 год на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий " 17 " квітня 2008 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлено, що імунна система, діючи через локальну секрецію цитокінів, сприяє регуляції оваріальних функцій. У літературі існують переконливі докази участі окремих цитокінів в аутокринній і паракринній регуляції функцій яєчника. Зокрема показано, що вони можуть відігравати вирішальну роль, впливаючи на процеси проліферації та функціонального диференціювання клітин яєчника, на стероїдогенну активність гранулярних клітин, дозрівання ооцитів, овуляторний процес та функціонування жовтого тіла. Цитокіни також модулюють вплив гонадотропінів на функції фолікулярних клітин ссавців (Bukulmez O., Arid A., 2000; Lanuza G.M. et al., 2002; Martoriati A. et al., 2003; Caillaud M., Duchamp G., Gerard N., 2005; Vital Reyes V.S. et al., 2005; Greenfeld C.R. et al., 2007). Доведено, що соматичні і статеві оваріальні клітини та резидентні лейкоцити продукують широкий спектр прозапальних цитокінів: інтерлейкін-1б (ІЛ-1б), ІЛ-1в, ІЛ-2, ІЛ-6, фактор некрозу пухлини-б (ФНП-б), інтерферон-г (ІФН-г) та деякі інші (Martoriati A., Gerard N., 2003; Gerard N. et al., 2004; Son D.S. et al., 2004; Vital Reyes V.S. et al., 2005; Greenfeld C.R. et al., 2007).

Встановлено, що імунні механізми системного й місцевого характеру відіграють суттєву роль у патогенезі інфекційно-запальних захворювань органів жіночої репродуктивної системи. Відомо, що під час запальних процесів підвищується продукція прозапальних цитокінів, зокрема ФНП-б та ІЛ-2, які беруть участь у локальній регуляції фізіологічних функцій в яєчнику. Отже, їх підвищена продукція може мати негативний вплив на процеси фолікулогенезу та оогенезу, наприклад, привести до передчасного порушення овуляції (Bagavan H. et al., 1999). Існують дані, що рівень прозапальних цитокінів, зокрема ІФН-г, ІЛ-2 (Bagavan H. et al., 1999; Майоров М.В., 2004), ФНП-б (Bagavan H. et al., 1999) зростає також і при аутоімунних захворюваннях, пов'язаних із появою в сироватці крові антиоваріальних антитіл. Їх високий титр зафіксовано при неспецифічних запальних ураженнях яєчника (Niauru D.A., 1995), розвитку його передчасної недостатності (Forges T. et al., 2004; Goswami D., Conway G.S., 2005), а також при ушкодженні тканини яєчника, яке відбувається після повторних пункцій фолікулів з метою екстракорпорального запліднення (Horejsi J. et al., 2000). За умов аутоімунного процесу в сироватці крові жінок збільшується кількість антитіл до різних антигенів яєчника (Crha I. et al., 1995; Kalantaridou S.N., Nelson L.M., 2000). Показано, що при експериментальному імунному ураженні яєчників у мишей, індукованому ксеногенними антиоваріальними антитілами, відбувається порушення мейотичного дозрівання ооцитів in vitro (Гоцуляк Я.М., Янчій P.I., 1999; Блашків Т.В., Вознесенська Т.Ю., 2002; Voznesenskaya Т. et al., 2007).

Відомо, що фолікулярна рідина, яка формує мікрооточення для ооцита і є джерелом речовин, необхідних для його розвитку, також містить широкий спектр цитокінів (Хонина Н.А. и др., 2005). У зв'язку з вищенаведеним визначення рівня останніх, насамперед цитокінів запальної реакції, а також ІФН, біологічна активність яких, спрямована на підтримку гомеостазу організму, може свідчити про оптимальні або, навпаки, неоптимальні умови для розвитку ооцита, і тим самим бути прогнозом для успішного чи неефективного екстракорпорального запліднення.

Таким чином, дослідження ролі прозапальних цитокінів - ФНП-б і ІЛ-2, а також ІФН у мейотичному дозріванні ооцитів у нормі та при дії антиоваріальних антитіл є актуальним, що обумовлено необхідністю вдосконалення та розробки нових методів у регуляції народжуваності, фертильності та лікування безпліддя, корекції порушень оваріального циклу, а також для обґрунтування нових підходів до прогнозу імплантації та успішного перебігу вагітності при екстракорпоральному заплідненні.

Метою дослідження було встановити вплив прозапальних цитокінів - фактора некрозу пухлини-б та інтерлейкіну-2, а також інтерферону-б на мейотичне дозрівання ооцитів мишей у нормі та при дії різних доз антиоваріальних антитіл шляхом оцінки здатності ооцитів до відновлення мейозу та формування першого полярного тільця.

Для дослідження цієї мети були поставлені наступні завдання:

Вивчити вплив фактора некрозу пухлини-б, інтерлейкіну-2 та інтерферону-б на здатність ооцитів, ізольованих від кумулюсних клітин, відновлювати мейоз та формувати перше полярне тільце.

Дослідити мейотичне дозрівання ооцитів при їх культивуванні в складі кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів при дії фактора некрозу пухлини-б, інтерлейкіну-2 та інтерферону-б.

Вивчити вплив фактора некрозу пухлини-б, інтерлейкіну-2 та інтерферону-б на життєздатність клітин фолікулярного оточення ооцитів.

Дослідити мейотичне дозрівання ооцитів в умовах експериментального порушення функціонального стану мітохондрій і з'ясувати їх участь у механізмах дії фактора некрозу пухлини-б, інтерлейкіну-2 та інтерферону-б на ооцити. ооцит цитокін мейотичний дозрівання

Дослідити вплив фактора некрозу пухлини-б, інтерлейкіну-2 та інтерферону-б на мейотичне дозрівання ооцитів мишей при дії великих і малих доз антиоваріальних антитіл при застосуванні їх in vivo та in vitro.

Об'єкт дослідження: ооцити та кумулюсно-ооцитарні клітинні комплекси мишей.

Предмет дослідження: мейотичне дозрівання ооцитів, ізольованих від кумулюсних клітин та культивованих у складі кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів (КОКК).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась згідно плану теми “Вивчення механізмів розвитку імунної патології печінки і жіночої репродуктивної системи та шляхів її корекції“ (2005-2008 рр.) відділу імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, № держреєстрації 0105U003236.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено теоретичне узагальнення і запропоновано вирішення нового наукового завдання: визначення впливу цитокінів на ооцитогенез мишей шляхом оцінки здатності ооцитів до відновлення мейозу і формування першого полярного тільця.

Показано, що ІЛ-2, ФНП-б, а також ІФН-б in vitro у високих дозах пригнічували процес відновлення мейотичного поділу та формування першого полярного тільця ооцитами, ізольованими від кумулюсних клітин.

З'ясовано, що вплив цитокінів на ооцити, культивовані в складі КОКК, був менш вираженим, ніж на ізольовані. Разом із тим виявлено пошкоджуючу дію досліджуваних цитокінів на кумулюсні клітини, яка проявлялась у зниженні кількості живих і зростанні кількості клітин з морфологічними рисами апоптозу. При дії ФНП-б активувалась також і некротична загибель фолікулярних клітин.

Встановлено, що порушення функцій мітохондрій під впливом ротенону та інгібіторів мітохондріальних переносників призводить до пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів. Показано, що мітохондрії можуть бути задіяні в механізм супресивної дії досліджуваних цитокінів. Результати дослідження з використанням блокатору кальцієвого уніпортера - рутенію червоного, а також циклоспорину А, який попереджує відкриття мітохондріальної пори, та лонідаміну - активатора мітохондріальної пори дозволяють припустити, що під впливом ФНП-б, ІЛ-2 та ІФН-б відбувається пошкодження функціонування іонотранспортних систем мітохондрій, порушення кальцієвої сигналізації ооцитів, унаслідок чого наступає пригнічення їх мейотичного дозрівання.

Показано, що досліджувані цитокіни, за винятком ІФН-б, в умовах аутоімунного пошкодження яєчників мають пригнічуючий вплив на ооцитогенез. Показано протективний ефект антиоваріальних антитіл у малих концентраціях на здатність ооцитів до завершення першого мейотичного поділу за умов упливу на них ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані щодо впливу ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б на мейотичне дозрівання ооцитів є суттєвими для з'ясування механізму паракринної та аутокринної регуляції фолікуло- та оогенезу ссавців і мають як теоретичне, так і практичне значення для клінічних потреб, а також можуть бути використані з метою імунодіагностики при проведенні допоміжних репродуктивних технологій, особливо у жінок із хронічними запальними процесами органів репродуктивної системи. Ранній прогноз високого ризику неефективного циклу екстракорпорального запліднення має велике значення для розробки тактики лікування й визначення оптимального періоду для успішного запліднення in vitro.

Результати дослідження впливу ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б за умов дії антиоваріальних антитіл на здатність ооцитів до мейотичного дозрівання можуть бути використані як теоретична основа для з'ясування патогенезу уражень репродуктивної системи при дії цитокінів та антитіл, а також мати прикладне значення для розробки нових методичних підходів для корекції порушень репродуктивної функції самок ссавців.

Результати дослідження впливу ротенону, інгібіторів мітохондріальних переносників, рутенію червоного, циклоспорину А та лонідаміну на ооцити свідчать про важливу роль мітохондрій у мейотичному дозріванні статевих гамет мишей, як органел, які беруть активну участь у відновленні ооцитом першого поділу мейозу та формуванні першого полярного тільця, що проявляється в перерозподілі іонів Ca2+ й підтримці кальцієвого гомеостазу ооцитів. Такі результати мають фундаментальне значення в розкритті кальцій-залежних механізмів нормального розвитку й дозрівання яйцеклітини.

Дослідження дії ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б при одночасному використанні факторів, які певним чином здійснюють пошкоджуючий ефект на функціонування мітохондрій, має теоретичне значення, оскільки дозволяє з'ясувати можливі шляхи реалізації пригнічуючого впливу даних цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів. Отримані результати мають також і практичне значення, зважаючи на те, що передача мітохондріальної ДНК за материнською лінією є генетичною основою для успадкування певних ушкоджень або навіть летальних розладів у людини. Структурні відхилення, виявлені в ооцитах і ембріонах, можуть бути пов'язані з мітохондріальними дисфункціями, особливо у випадку жінок зрілого репродуктивного віку.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено науковий пошук та обґрунтування напрямку досліджень. Виконано експериментальні дослідження по вивченню впливу in vitro ІФН-б, ФНП-б та ІЛ-2 на мейотичне дозрівання ооцитів мишей як у нормі, так і за умов дії різних доз антиоваріальних антитіл. Вивчено можливі мітохондріальні механізми, задіяні в реалізацію впливу досліджуваних цитокінів на ооцити. Проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення отриманих результатів, аналіз даних літературних джерел, сформульовано основні висновки, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації доповідалися на XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (м. Чернівці, 18-20 травня 2006 р.), на ІІІ міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь та поступ біології" (м. Львів, 23-27 квітня 2007 р.), на VIII науковій конференції молодих учених з міжнародною участю "Біологічні основи розвитку патології пізнього віку" (м. Київ, 29 січня 2007 р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених "Сучасні аспекти медицини і фармації - 2007" (м. Запоріжжя, 4 квітня 2007 р.).

Публікації. Результати дисертації викладено в 14 публікація - у 6 статтях, рекомендованих ВАК України та 8 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 139 сторінках друкованого тексту та ілюстровано 20 рисунками і 19 таблицями. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 213 найменувань, з них 150 надруковані в іноземних виданнях.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на самках статевозрілих мишей СВА віком 6-8 тижнів масою 16-20 г, що утримувалися на стандартному раціоні віварію. При роботі з тваринами дотримувалися Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.

Для виділення оваріальних фолікулів та ооцитів тварин присипляли ефіром і забивали методом зміщування шийних хребців. Фолікули механічно звільняли від сполучної тканини під мікроскопом МБС-9. Після проколу фолікула голкою виділяли ооцити, оточені кумулюсом (КОКК), та ооцити без кумулюсу. Від фолікулярних клітин КОКК відділяли не вдаючись до ферментів - механічно, гранулярні клітини ідентифікували за морфологічними ознаками під мікроскопом. Загальне число КОКК, які виділяли з обох яєчників однієї миші, становило 25-30 шт. Ооцити і кумулюсні клітини отримували з КОКК, які пропускали через тонку скляну піпетку. Ооцити знаходилися на стадії "зародкового пухирця" (ЗП+), яку встановлювали за наявністю чітко сформованої ядерної оболонки (Манк М., 1990).

КОКК та ооцити культивували в камерах, що містили 500 мкл культурального середовища DME з 15 ммоль HEPES з фізіологічною концентрацією Са2+ (1,71 ммоль/л) при 37 °С у стерильному боксі. Усі контрольні та тестовані ооцити і КОКК культивувалися в однакових умовах. Після 4 год культивування підраховували кількість ооцитів із розчиненим зародковим пухирцем (ЗП-), а через 20 год - таких, що сформували перше полярне тільце (ПТ) (Donahue R.P., 1968). Вираховували відношення кількості ооцитів з (ЗП-) та ооцитів з ПТ до початкової (загальної) кількості (ЗП+) ооцитів у відсотках (% ЗП- та % ПТ).

У роботі використовували препарати ФНП-б (виробництва ГНЦ "Вектор", Росія), ІЛ-2 ("Ферментас", Литва), ІФН-б ("Біофарма", Україна). Цитокіни інактивували, піддаючи їх термічній обробці протягом 40 хв при 70 °С.

Антиоваріальну цитотоксичну сироватку (АОЦС) одержували шляхом імунізації кроликів антигеном (водно-сольовими екстрактами тканин яєчника білих безпородних мишей) у зростаючих дозах (Спасокукоцький Ю.О., Алексєєва І.М. та ін., 1963). Антиоваріальні антитіла (г-АОЦС - сумарна гама-глобулінова фракція), отримані з АОЦС шляхом висолювання за допомогою сульфату амонію (Фримель Г., 1987), мали кінцеву концентрацію білка 7,2 мг/мл, яку визначали за методом Лоурі-Фоліна (Lowry O.H. et al., 1951).

Оцінку апоптотичної і некротичної загибелі фолікулярних клітин здійснювали за морфологічними ознаками за допомогою методу прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот Хехст 33342 (Sigma, США) та пропідіум йодид (Sigma, США) (Shimizu S. et al., 1996). Використаний нами метод прижиттєвого подвійного забарвлення дає можливість визначити кількість живих, апоптотичних і некротичних клітин. Йодид пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин у зелено-синій колір. Зв'язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного матеріалу, притаманні апоптозу. Морфологічні дослідження проводили за допомогою люмінесцентного мікроскопа Люмам И-1 з водно-імерсійним об'єктивом х85. Визначали відсоток живих, апоптотичних та некротичних клітин при підрахунку не менш як 800 клітин.

Для вивчення впливу цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів, ізольованих від кумулюсних клітин, до середовища культивування додавали: 1) ІФН-б у концентраціях 10; 50; 100; 500 або 1000 нг/мл; 2) ІЛ-2 - 0,2; 2; 20 або 200 нг/мл; 3) ФНП-б - 0,2; 2; 20 або 200 нг/мл; 4) інактивовані ІФН-б - 100 або 1000 нг/мл; ІЛ-2 та ФНП-б - 2 або 200 нг/мл.

З метою дослідження впливу цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів, культивованих у складі КОКК, до середовища DME додавали: 1) ІФН-б у концентраціях 50; 100; 500 або 1000 нг/мл; 2) ІЛ-2 - 2; 20 або 200 нг/мл; 3) ФНП-б - 2; 20 або 200 нг/мл.

Для оцінки апоптотичної і некротичної загибелі кумулюсні клітини, відокремлені від КОКК, після 20 год культивування в середовищі з ІФН-б, ІЛ-2 або ФНП-б забарвлювали барвниками Хехст 33342 та пропідіум йодид, після чого визначали відсоток живих, апоптотичних та некротичних клітин, як описано вище.

Для вивчення ефекту порушення функціонування мітохондрій на мейотичне дозрівання ооцитів використовували ротенон (Sigma, США), отримуючи розчин з кінцевими концентраціями 1; 10 або 100 мМ; а також інгібітори мітохондріальних переносників: 1) амінооксиацетатну кислоту (AOAA) (Sigma, США) - інгібітор малат-аспартатних мітохондріальних переносників (0,4 мМ); 2) піридоксал 5'-фосфат (РРТ) (Sigma, США) - інгібітор аспартатних мітохондріальних переносників (0,3 або 0,03 мМ); 3) батофенантролін (BNL) (Sigma, США) - інгібітор аспартат-глутаматного переносника (3,0 або 0,3 мМ); 4) н-етилмалемід (NLD) (Sigma, США) - інгібітор глутаматного переносника (3,0 або 0,3 мМ).

Для дослідження залучення мітохондрій у механізми дії ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б на ооцити у культуральне середовище одночасно додавали АОАА (0,4 мМ) та один із цитокінів: ІЛ-2 (2 або 200 нг/мл); ФНП-б (2 або 200 нг/мл); ІФН-б (100 або 1000 нг/мл). Вивчали сумісну дію АОАА та цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів. У середовище DME додавали: 1) рутеній червоний (Sigma, США) - блокатор кальцієвого уніпортера (50 мкМ); 2) ІЛ-2 (200 нг/мл) та рутеній червоний (50 мкМ); 3) ІЛ-2 (200 нг/мл), рутеній червоний (50 мкМ) та АОАА (0,4 мМ); 4) рутеній червоний (50 мкМ) та АОАА (0,4 мМ); 5) ІФН-б (100 або 1000 нг/мл) та рутеній червоний (50 мкМ). Протягом 30 хв проводили преінкубацію ооцитів у середовищі з циклоспорином А (Sigma, США) (40 мкг/мл), після цього клітини переносили в середовище з ФНП-б в кінцевій концентрації 2 або 200 нг/мл або в середовище, яке одночасно містило ФНП-б (2 або 200 нг/мл) та лонідамін (Sigma, США) - активатор мітохондріальної пори (5 мкмоль/л), і культивували протягом 19 год 30 хв. Проводили контрольне культивування ооцитів, піддаючи їх впливу циклоспорину А протягом 30 хв, після цього переносили клітини у звичайне живильне середовище.

Для дослідження впливу цитокінів на ооцитогенез за умов імунного пошкодження яєчників, індукованого великими дозами антиоваріальних антитіл (0,3 мг білка на 1 г тварини) (Блашків Т.В., 2000), а також при стимуляції їх функції малими дозами (0,0002 мг білка на 1 г тварини) г-АОЦС вводили внутрішньовенно мишам на стадії діеструсу (Вознесенська Т.Ю., 2002), яку оцінювали за допомогою вагінальних мазків (Манк М., 1990). З метою дослідження впливу на мейотичне дозрівання ооцитів in vitro г-АОЦС (0,2 мг/мл) та цитокіни (ІФН-б - 100 або 1000 нг/мл; ІЛ-2 - 2 або 200 нг/мл; ФНП-б - 2 або 200 нг/мл) додавали в середовище культивування.

Статистичну обробку матеріалу проведено з обчисленням критерію Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б на мейотичне дозрівання ооцитів мишей in vitro. Встановлено, що ІФН-б в концентрації 10 нг/мл не впливав на мейотичне дозрівання ооцитів на стадії ЗП- (97,14 ± 1,41 %; у контролі 98,75 ± 1,25 %; p > 0,05) та на стадії ПТ (61,01 ± 2,82 %; у контролі 66,79 ± 3,49 %; p > 0,05). Однак у більш високих концентраціях - 50, 100, 500 і 1000 нг/мл - мав дозозалежну супресивну дію. Пригнічуючий вплив ІФН-б на здатність ооцитів відновлювати мейоз після 4 год культивування (стадія метафази І) був незначним, але статистично вірогідним. Так, у діапазоні концентрацій від 50 до 1000 нг/мл відновлення мейозу спостерігали відповідно у 92,39 ± 1,39 (p < 0,05); 90,03 ± 2,03 (p < 0,05); 83,25 ± 1,45 (p < 0,01) та 81,75 ± 2,84 % (p < 0,01) ооцитів порівняно з 98,75 ± 1,25 % у контролі. Більш виражений дозозалежний інгібуючий вплив ІФН-б виявляв на формування ооцитами першого ПТ (стадія метафази ІІ) після 20 год інкубації. Із зростанням концентрації ІФН-б від 50 до 1000 нг/мл формували перше ПТ відповідно 46,21 ± 4,21 (p < 0,01); 37,50 ± 1,11 (p < 0,001); 30,57 ± 2,65 (p < 0,001) та 23,19 ± 5,28 % (p < 0,001) ооцитів порівняно з 66,79 ± 3,49 % у контролі (n = 8). Слід зазначити, що при використанні інактивованого ІФН-б у концентраціях 100 і 1000 нг/мл пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів відносно інтактних клітин не відбувалося: відповідно 56,59 ± 6,72 та 57,76 ± 6,76 % проти 54,00 ± 1,32 % у контролі (p > 0,05; n = 6).

Оскільки в організмі ооцит розвивається в тісному зв'язку з оточуючими його кумулюсними клітинами (Вознесенська Т.Ю., 2002) було проведено дослідження впливу ІФН-б на здатність ооцитів, культивованих у складі КОКК, формувати перше ПТ. Отримані результати показали, що за даних умов цитокін вірогідно не впливав на дозрівання ооцитів. Так, відносно контролю (72,56 ± 2,20 %; n = 8) при дії ІФН-б в концентраціях 50, 100, 500 або 1000 нг/мл перше ПТ сформували відповідно 66,61 ± 3,11; 67,54 ± 1,71; 66,93 ± 2,06 та 70,88 ± 2,79 % (p > 0,05) ооцитів. Такі результати дають підставу вважати, що оточуючі фолікулярні клітини можуть захищати статеву клітину від пригнічуючої дії ІФН-б у високих концентраціях, виконуючи роль своєрідного бар'єру і беручи на себе його негативний вплив.

При дослідженні впливу ІЛ-2 на руйнування ЗП та формування першого ПТ ооцитами, ізольованими від кумулюсних клітин, установлено, що цей цитокін у дозі 0,2 нг/мл не впливав на здатність гамет досягати стадії метафази І (93,37 ± 2,22 %; у контролі 96,79 ± 1,20 %; p > 0,05) та стадії метафази ІІ (58,90 ± 4,91 %; у контролі 57,68 ± 2,20 %; p > 0,05). Однак у більш високих концентраціях - 2,0; 20,0 та 200,0 нгмл - він викликав вірогідне пригнічення відновлення мейозу, відповідно кількість ооцитів із ЗП- становила 90,14 ± 2,38 (p < 0,05); 82,45 ± 2,88 (p < 0,001) та 80,30 ± 2,58 % (p < 0,001) проти 96,79 ± 1,20 % (n = 20) у контролі. Більш виражений дозозалежний інгібуючий вплив ІЛ-2 був виявлений на формування першого ПТ. Після культивування з ІЛ-2 у концентраціях 2,0; 20,0 або 200,0 нг/мл перше ПТ формували відповідно 32,39 ± 3,39; 19,78 ± 2,24 та 18,80 ± 3,57 % ооцитів порівняно з 57,68 ± 2,20 % (p < 0,001; n = 20) у контролі. На нашу думку, за таких умов відбувається взаємодія цитокіну майже зі всіма специфічними для нього рецепторами на ооцитах, і тому подальше збільшення його концентрації не викликає дозозалежного підсилення гальмівного ефекту. При інкубації ооцитів з інактивованим ІЛ-2 у концентраціях 2 і 200 нг/мл не виявлено гальмівного ефекту на мейотичне дозрівання ооцитів порівняно з інтактними клітинами (відповідно 61,21 ± 2,61 та 58,43 ± 2,10 %; у контролі 65,76 ± 2,69 %; p > 0,05; n = 4).

ІЛ-2 мав пригнічуючий вплив на формування першого ПТ ооцитами, культивованими в складі КОКК. При цьому супресивна дія ІЛ-2 виявлялася тільки при його концентрації 200 нг/мл (42,76 ± 3,56 %; у контролі 60,31 ± 2,81 %; p < 0,01). У дозах 2 і 20 нг/мл ІЛ-2 вірогідно не впливав на здатність ооцитів досягати стадії метафази ІІ (відповідно 53,76 ± 2,46 та 49,86 ± 4,45 %; p > 0,05; n = 8).

Отримані дані свідчать, що ФНП-б також пригнічував руйнування ЗП та формування першого ПТ ооцитами, ізольованими від кумулюсних клітин. Унаслідок впливу ФНП-б в концентраціях 2, 20 і 200 нг/мл показник мейотичного дозрівання змінювався наступним чином: руйнування ЗП спостерігалось відповідно у 79,71 ± 2,17; 68,05 ± 3,51 та 54,42 ± 3,97 % ооцитів проти 95,14 ± 2,30 % у контролі (p < 0,001; n = 8). Відсоток статевих гамет, які формували перше ПТ, зменшувався відповідно у 35,14 ± 1,50; 21,57 ± 5,20 та 19,46 ± 2,69 % ооцитів порівняно з 55,56 ± 3,91 % у контролі (p < 0,001). Разом із тим ФНП-б у концентрації 0,2 нг/мл не впливав на відновлення (93,02 ± 3,07 %; p > 0,05) та завершення (52,75 ± 5,64 %; p > 0,05) першого мейотичного поділу. Отже, порівняно з ІЛ-2, ФНП-б викликав подібний ефект на стадію метафази ІІ і виявляв більш сильну гальмівну дію на стадію метафази І. При інкубації ооцитів з інактивованим ФНП-б у концентраціях 2 і 200 нг/мл не виявлено гальмівного ефекту на ооцитогенез порівняно з інтактними клітинами. Кількість ооцитів, які сформували перше ПТ складала відповідно 63,19 ± 3,37 та 60,83 ± 3,94 % порівняно з 65,76 ± 2,69 % у контролі (p > 0,05; n = 4).

Встановлено, що ФНП-б пригнічував формування першого ПТ ооцитами, культивованими в складі КОКК. За даних умов інгібіторний ефект ФНП-б був суттєвим тільки при концентрації цитокіну 200 нг/мл (44,12 ± 1,92 %; p < 0,001). При дії ФНП-б у менших дозах (2 або 20 нг/мл) кількість ооцитів із сформованим першим ПТ вірогідно не відрізнялась від контрольного значення (відповідно 65,08 ± 3,68 та 61,12 ± 3,82 %; у контролі 70,78 ± 2,95 %; p > 0,05; n = 6).

Отже, під впливом прозапальних цитокінів - ФНП-б, ІЛ-2, а також ІФН-б відбувалось пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів, відокремлених від кумулюсних клітин. Спостерігалось зменшення кількості ооцитів, які відновили мейоз та сформували перше ПТ. Разом із тим вплив цитокінів на ооцити, культивовані в складі КОКК, був менш вираженим. Результати відносно супресивної дії ФНП-б, ІЛ-2 та ІФН-б на мейотичне дозрівання ооцитів мишей отримано вперше. Однак у літературі є дані про вплив цих цитокінів на різні етапи фолікулогенезу, проліферацію і диференціювання фолікулярних клітин, овуляцію та інші функції яєчника (Bukulmez O., Arid A., 2000; Caillaud M., Duchamp G., Gerard N., 2005; Greenfeld C.R. et al., 2007). Існують відомості про наявність рецепторів до цитокінів (Son D.S. et al., 2004; Greenfeld C.R. et al., 2007) та їхню продукцію оваріальними клітинами (Orvieto R. et al., 1997; Marcinkiewicz J.L., Balchak S.K., Morrison L.J., 2002; Martoriati A., Gerard N., 2003).

Аналіз експериментального пошкодження клітин фолікулярного оточення ооцитів за умов дії ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б. Встановлено (рис. 1), що в умовах впливу ІФН-б зменшувалось число живих та некротичних клітин, проте зростала кількість клітин з морфологічними рисами апоптозу. При цьому переважну більшість складали клітини з конденсованим ядерним хроматином, що відповідає раннім стадіям апоптозу. Такі дані пояснюють причину відсутності гальмівного ефекту високих доз ІФН-б на ооцити, культивовані в складі КОКК. ІЛ-2 викликав загибель фолікулярних клітин переважно за апоптотичним шляхом: вірогідно зменшувалась кількість живих клітин і зростав відсоток клітин із морфологічними ознаками, характерними для пізніх стадій апоптозу (рис. 1). За умов упливу ФНП-б суттєво зменшувалась кількість живих клітин, підвищувався відсоток клітин, загиблих шляхом апоптозу, а також значно активувався некротичний шлях клітинної загибелі . Таким чином, пошкодження фолікулярного оточення при дії ІЛ-2 та ФНП-б у високій концентрації (200 нг/мл) на КОКК можна вважати домінуючим фактором порушення мейотичного дозрівання, враховуючи функції цих клітин у регуляції метаболічних процесів в ооциті.

Отже, результати проведених досліджень свідчать, що ФНП-б, ІЛ-2 та в меншій мірі ІФН-б викликають пошкодження фолікулярного оточення ооцитів, яке відбувається переважно за апоптотичним шляхом. При дії ФНП-б активується також і некротична загибель фолікулярних клітин.

Мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах експериментального порушення функціонального стану мітохондрій. За даними літератури деякі цитокіни, зокрема ФНП-б і ІЛ-1в, пригнічували активність мітохондрій у хондроцитах людини (Lopez-Armada M.J. et al., 2006). Однак відносно ооцитів подібних даних у літературі немає. Тому нами проведено 2 серії експериментів, першу - для оцінки, як порушення функціонування мітохондрій буде впливати на мейотичне дозрівання ооцитів, другу серію - з'ясувати, чи задіяні мітохондрії в інгібіторний ефект цитокінів.

Для дослідження ролі мітохондрій у мейотичному дозріванні жіночих гамет було використано ротенон - препарат, який блокує роботу цих органел шляхом пригнічення активності І комплексу дихального ланцюга (Sousa S.C., Castilho R.F., 2005), та інгібітори мітохондріальних переносників. Установлено пригнічуючий вплив ротенону у концентраціях 1; 10 та 100 мМ на здатність ооцитів відновлювати мейоз (відповідно 74,43 ± 2,12; 58,54 ± 3,95 та 26,00 ± 2,90 %; у контролі 94,05 ± 2,11 %; p < 0,001) і формувати перше ПТ (відповідно 20,57 ± 3,84 та 4,36 ± 2,52 %; у контролі 58,87 ± 5,57 %; p < 0,001). У концентрації 100 мМ ротенон повністю інгібував здатність жіночих гамет досягати стадії метафази ІІ.

Відомо, що інгібітори мітохондріальних переносників є сімейством транспортних білків, які розташовані на внутрішній мембрані мітохондрій (Fiermonte G. et al., 2004). В експериментах використано інгібітори малат-аспартатних (AOAA), аспартат-глутаматних (BNL), глутаматних (NLD) та аспартатних (РРТ) переносників. Нами вперше показано, що кожний із досліджуваних інгібіторів пригнічував здатність ооцитів досягати стадії метафази І і метафази ІІ, виявляючи на останню більш виражену дію (табл. 1). Такі дані засвідчують важливу роль мітохондрій у процесі мейотичного дозрівання ооцитів.

З метою з'ясування можливого механізму впливу досліджуваних цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей проведено декілька серій експериментів за умов присутності в культуральному середовищі АОАА (інгібітора малат-аспартатного мітохондріального переносника). При інкубації ооцитів у середовищі з використанням АОАА в комбінації з одним із цитокінів однонаправленість дії спостерігалася лише в групах ооцитів, культивованих у середовищі з АОАА або ІЛ-2, а також при одночасному впливі цих факторів (АОАА і ІЛ-2). Такі результати (табл. 2) дають підставу припускати, що АОАА і ІЛ-2 діють на ооцити подібним шляхом, пошкоджуючи функціонування малат-аспартатного переносника. Під час спільного впливу АОАА і ФНП-б порівняно із самостійним впливом кожного із досліджуваних факторів спостерігалось посилення пригнічуючого ефекту на мейотичне дозрівання, що може свідчити про різні механізми дії даних речовин (табл. 2). При культивуванні ооцитів у середовищі з АОАА і ІФН-б показник дозрівання статевих гамет наближався до такого, який спостерігався під час самостійної дії ІФН-б, але був вірогідно вищим, ніж при дії АОАА (табл. 2).

Таблиця 1

Вплив інгібіторів мітохондріальних переносників на руйнування зародкового пухирця ооцитами, ізольованими від кумулюсних клітин

(М ± m; n = 6)

Вплив

Концентрація

Кількість ооцитів (%):

ЗП- (4 год)

ПТ (20 год)

Контроль

94,02 ± 2,54

73,82 ± 1,99

BNL

0,30 мМ

82,12 ± 2,40*

53,64 ± 3,29**

3,00 мМ

71,10 ± 1,80***

38,72 ± 4,73***

NLD

0,30 мМ

71,79 ± 2,35***

41,31 ± 1,95***

3,00 мМ

66,74 ± 1,30***

22,93 ± 4,79***

PPT

0,03 мМ

75,69 ± 2,16**

35,21 ± 2,21***

0,30 мМ

18,61 ± 6,47***

-

AOAA

0,40 мМ

73,06 ± 1,62***

20,65 ± 4,31***

Примітки: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - вірогідність відмінностей по відношенню до контролю

Таблиця 2

Вплив сумарної дії цитокінів і амінооксиацетатної кислоти на мейотичне дозрівання ооцитів мишей (М ± m; n = 4)

Вплив

Концентрація

Кількість ооцитів (%):

ЗП- (4 год)

ПТ (20 год)

Контроль

94,09 ± 1,92

58,43 ± 2,25

ІЛ-2 + AOAA

2 нг/мл

76,20 ± 2,38***

21,88 ± 0,66***

200 нг/мл

74,43 ± 6,34*

19,32 ± 3,49***

ФНП-б + AOAA

2 нг/мл

64,00 ± 5,77**

13,97 ± 3,23***

200 нг/мл

51,92 ± 3,33***

10,77 ± 1,63***

ІФН-б + AOAA

100 нг/мл

84,71 ± 2,28*

34,54 ± 1,84***

1000 нг/мл

82,80 ± 3,76*

25,91 ± 3,88***

Примітки: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - вірогідність відмінностей по відношенню до контролю

Для подальшого вивчення та уточнення можливих шляхів дії ІЛ-2 було використано блокатор кальцієвого уніпортера - рутеній червоний (50 мкМ). Встановлено, що даний блокатор безпосередньо пригнічував мейотичне дозрівання ооцитів (табл. 3). При спільній дії рутенію червоного з ІЛ-2 або з АОАА, а також при наявності в культуральному середовищі всіх трьох досліджуваних препаратів нами не виявлено вірогідної різниці в показниках дозрівання гамет між даними групами впливу. Такі результати дають підставу припускати, що ІЛ-2 пригнічує мейотичне дозрівання ооцитів, порушуючи функцію мітохондрій, а саме ІЛ-2 блокує кальцієвий уніпортер. Імовірно при цьому відбувається пошкодження мітохондріальних іонотранспортних систем, які, у свою чергу, беруть участь у роботі мітохондріальних переносників. У результаті цього, на нашу думку, відбувається порушення кальцієвої сигналізації ооцита і, як наслідок, - пригнічення мейотичного дозрівання.

Таблиця 3

Мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах дії рутенію червоного, інтерлейкіну-2 та амінооксиацетатної кислоти (М ± m; n = 5)

Вплив

Концентрація

Кількість ооцитів (%):

ЗП- (4 год)

ПТ (20 год)

Контроль

-

96,76 ± 2,08

68,10 ± 2,84

Рутеній червоний

50 мкМ

77,34 ± 5,10**

31,90 ± 1,61***

ІЛ-2 + АОАА

200 нг/мл + 0,4 мМ

76,52 ± 1,46***

21,58 ± 2,74***

ІЛ-2 + рутеній червоний

200 нг/мл + 50 мкМ

73,73 ± 2,12***

19,29 ± 2,44***

ІЛ-2 + рутеній червоний + AOAA

200 нг/мл + 50 мкМ + 0,4 мМ

72,65 ± 0,84***

19,72 ± 2,29***

Рутеній червоний + AOAA

50 мкМ + 0,4 мМ

71,11 ± 2,14***

23,62 ± 1,96***

Примітки: ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - вірогідність відмінностей показників мейотичного дозрівання ооцитів порівняно з контролем

Встановлено, що рутеній червоний спільно з ІФН-б пригнічували формування ооцитами першого ПТ. Причому цей показник залежав від концентрації цитокіна (табл. 4). Під впливом ІФН-б в дозі 100 нг/мл показник дозрівання вірогідно не відрізнявся від такого, який спостерігався під час самостійної дії рутенію червоного. Однак зростання концентрації цитокіну до 1000 нг/мл призводило до вірогідного збільшення кількості ооцитів з ПТ.

Таким чином, можна припустити, що ІФН-б і рутеній червоний виявляють протилежну дію на мітохондрії, тобто ІФН-б сприяє відкриттю кальцієвого уніпортера, що врешті-решт призводить до перерозподілу іонів Ca2+ між цитоплазмою і мітохондріальним матриксом. Імовірно покращення дозрівання гамет в умовах одночасного впливу обох факторів можна пояснити тим, що за своєю силою дії рутеній червоний і ІФН-б у концентрації 1000 нг/мл рівноцінні, і під час їх спільного впливу пригнічуючий ефект на клітини менш виражений. А при низькій дозі ІФН-б скоріш за все проявляється супресивна дія рутенію червоного, який у даному випадку є більш сильним супресором.

Таблиця 4

Мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах дії рутенію червоного та інтерферону-б (М ± m; n = 4)

Вплив

Концентрація

Кількість ооцитів (%):

ЗП- (4 год)

ПТ (20 год)

Контроль

96,53 ± 1,72

67,59 ± 2,70

Рутеній червоний + ІФН-б

50 мкМ+ 100 нг/мл

95,94 ± 2,38##

31,62 ± 5,02***

Рутеній червоний + ІФН-б

50 мкМ+ 1000 нг/мл

96,16 ± 2,29##

43,66 ± 1,29***#

Рутеній червоний

50 мкМ

77,24 ± 3,58***

31,62 ± 2,83***

Примітки:

1. *** - р < 0,001 - вірогідність відмінностей по відношенню до контролю;

2. # - р < 0,05; ## - р < 0,01 - відносно самостійної дії рутенію червоного.

На основі літературних даних (Залесский В.Н., Великая Н.В., 2003) та вищенаведених результатів досліджень висунуто припущення, що ФНП-б пригнічує мейотичне дозрівання ооцитів, сприяючи відкриттю мітохондріальних пор. При використанні циклоспорину А (40 мкг/мл), який перешкоджає відкриттю мітохондріальних пор, установлено, що 30-и хв обробка ооцитів циклоспорином А, які потім культивували в середовищі з ФНП-б, призводила до суттєвого збільшення кількості ооцитів із сформованим ПТ порівняно з тими, що не піддавались обробці циклоспорином А (табл. 5). Разом із тим сам по собі циклоспорин А не впливав на мейотичне дозрівання ооцитів.

Для подальшого аналізу механізму дії ФНП-б було використано лонідамін - активатор мітохондріальної пори. Результати дослідження трактували за здатністю ооцитів досягати стадії метафази ІІ. Встановлено, що лонідамін (5 мкМ) самостійно, а також у комбінації з ФНП-б (200 нг/мл) значно пригнічували формування ооцитами першого ПТ (відповідно 20,67 ± 1,04 та 19,07 ± 1,04 %; у контролі 61,85 ± 2,35 %; p < 0,001). Проте не виявлено вірогідної різниці в показниках дозрівання між даними групами клітин. Преінкубація ооцитів із циклоспорином А протягом 30-и хв з подальшим культивуванням їх у середовищі, що одночасно містило ФНП-б і лонідамін, суттєво збільшувала кількість ооцитів на стадії метафази ІІ (37,08 ± 2,19 %; p < 0,001). Отримані дані підтверджують припущення, що супресивний ефект ФНП-б на дозрівання ооцитів опосередкований активацією відкриття мітохондріальних пор.

Таким чином, шляхом фармакологічного впливу на ооцити цитокінів у комбінації з рутенієм червоним, АОАА та циклоспорином А встановлено, що супресивна дія ФНП-б, ІЛ-2 та ІФН-б опосередкована порушенням функціонального стану мітохондрій.

Таблиця 5

Вплив фактора некрозу пухлини-б на мейотичне дозрівання ооцитів за умов дії циклоспорину А (М ± m; n = 7)

Вплив

Час інкубації

Кількість ооцитів з ПТ (%):

Інтактні клітини

20 год

56,61 ± 1,88

Обробка циклоспорином А (40 мкг/мл) + інкубація в контр. середовищі

30 хв + 19 Ѕ год

52,35 ± 1,40

Циклоспорин А (40 мкг/мл) + ФНП-б (2 нг/мл)

30 хв + 19 Ѕ год

50,29 ± 3,78#

Циклоспорин А (40 мкг/мл) + ФНП-б (200 нг/мл)

30 хв + 19 Ѕ год

48,75 ± 1,62## *

ФНП-б (2 нг/мл)

20 год

35,30 ± 5,33***

ФНП-б (200 нг/мл)

20 год

24,91 ± 2,69***

Примітки:

1. * - р < 0,05; *** - р < 0,001 - вірогідність відмінностей показників мейотичного дозрівання ооцитів порівняно з контролем;

2. # - р < 0,05; ## - р < 0,01 - вірогідність відмінностей показників мейотичного дозрівання ооцитів порівняно з дією ФНП-б

Вплив ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б на мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах імунного пошкодження яєчників великою дозою антиоваріальних антитіл. Нами досліджено вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах імунного пошкодження яєчників, яке індукували шляхом трьохкратного введення г-АОЦС (0,3 мг білка) у хвостову вену миші. Встановлено, що за даних умов цитокіни по-різному впливали на дозрівання гамет. Так, вплив ІЛ-2 (200 нг/мл) супроводжувався вірогідним посиленням супресивного ефекту на обидві стадії першого мейотичного поділу. Якщо у контролі кількість ооцитів із ЗП- дорівнювала 94,78 ± 2,71 % (n = 6), то при дії ІЛ-2 на тлі г-АОЦС або при самостійній дії г-АОЦС - відповідно 57,06 ± 7,10 (p < 0,001) та 80,20 ± 3,86 (p < 0,05). Разом із тим кількість ооцитів, які формували перше ПТ, зменшувалась з 55,85 ± 3,33 % у контролі (n = 6) відповідно до 9,89 ± 2,93 % (p < 0,001) та 29,26 ± 3,65 % (p < 0,001). Внаслідок дії ФНП-б (200 нг/мл) спостерігалось пригнічення відновлення мейозу (56,14 ± 2,42 %; у контролі 93,67 ± 2,18 %; p < 0,001; n = 4) та формування першого ПТ (20,17 ± 3,65 %; у контролі 62,70 ± 2,42 %; p < 0,001; n = 4), але показники дозрівання ооцитів знаходилися в діапазоні самостійного впливу даного цитокіну та антитіл. І накінець, ІФН-б (1000 нг/мл) навпаки знижував пригнічуючий вплив г-АОЦС на процес мейотичного дозрівання: кількість ооцитів із ЗП- становила 96,42 ± 1,52 % (у контролі 95,84 ± 1,65 %; p > 0,05; n = 8), а формували перше ПТ - 52,46 ± 1,75 % (у контролі 56,52 ± 1,78 %; p > 0,05; n = 8). За даними літератури при деяких аутоімунних захворюваннях порушується продукція ендогенного ІФН-б (Ершов Ф.И., 1996). Якщо припустити, що це відбувається і при аутоімунних оваріальних захворюваннях, то додавання екзогенного ІФН-б компенсує нестачу ендогенного і, таким чином, покращується дозрівання гамет. У цьому випадку можна зробити ще один висновок, що ІФН-б відіграє важливу фізіологічну роль у мейотичному дозріванні ооцитів.

Вплив ІФН-б, ІЛ-2, ФНП-б та малої дози антиоваріальних антитіл на мейотичне дозрівання ооцитів мишей. Раніше показано, що ін'єкції малих доз г-АОЦС (0,0002 мг білка) здійснюють стимулюючий вплив на здатність ооцитів формувати ПТ (Вознесенська Т.Ю., 2002). З метою дослідження впливу ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б за умов дії малих доз антитіл протягом 3 діб г-АОЦС вводили у хвостову вену миші. Після цього ооцити виділяли і культивували в середовищі з одним із цитокінів. Установлено, що подібні ін'єкції мали стимулюючий ефект на мейотичне дозрівання ооцитів, культивованих у середовищі як з ІФН-б, так і з ІЛ-2 і ФНП-б. Так, при дії ІФН-б (100 нг/мл) відновили мейоз 90,42 ± 1,83 % (у контролі 96,00 ± 2,07 %; p > 0,05; n = 6) та сформували перше ПТ 52,89 ± 3,42 % (у контролі 59,62 ± 2,73 %; p > 0,05; n = 6) ооцитів. Під впливом ІЛ-2 (2 нг/мл) кількість ооцитів із ЗП- дорівнювала 91,25 ± 3,70 % (у контролі 95,00 ± 3,42 %; p > 0,05; n = 6), а тих, що сформували перше ПТ - 49,51 ± 1,10 % (у контролі 52,50 ± 2,18 %; p > 0,05; n = 6). Внаслідок дії ФНП-б (2 нг/мл) відновили мейоз 85,24 ± 4,13 % (у контролі 87,41± 5,93 %; p > 0,05; n = 6) та сформували перше ПТ 48,73 ± 4,75 % (у контролі 51,48 ± 2,88 %; p > 0,05; n = 6) ооцитів. Такі результати дають підставу стверджувати, що г-АОЦС у малих дозах має протективний ефект на дозрівання статевих гамет на тлі патологічного впливу даних цитокінів, а також дозволяють припустити, що малі дози г-АОЦС можна використовувати при порушеннях, які призводять до зниження реактивності клітин яєчника.

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б в експериментальних умовах здійснюють дозозалежний пригнічуючий вплив на здатність ооцитів до мейотичного дозрівання, що виявляється у зменшенні кількості ооцитів, які відновили мейоз і сформували перше ПТ. Отримані дані свідчать про важливу роль цитокінів у регуляції репродуктивної функції та їх діагностичній і прогностичній значущості під час проведення процедур допоміжних репродуктивних технологій.

ВИСНОВКИ

Встановлено, що цитокіни - ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б - мають супресивний вплив на дозрівання ооцитів у нормі та при дії великих і малих доз антиоваріальних антитіл, визначено механізми впливу цитокінів на відновлення процесу мейозу та формування першого полярного тільця ооцитами, що є абсолютно необхідним для нормального запліднення і подальшого розвитку плода.

Прозапальні цитокіни - ФНП-б і ІЛ-2, а також ІФН-б пригнічували мейотичне дозрівання ооцитів, відокремлених від кумулюсних клітин, що підтверджується зменшенням кількості ооцитів, які відновили мейоз та сформували перше полярне тільце. Вплив цитокінів на ооцити, культивовані в складі кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів, був менш вираженим.

ФНП-б і ІЛ-2, а також ІФН-б мають пошкоджуючу дію на життєздатність фолікулярного оточення ооцитів, що підтверджується суттєвим зниженням кількості живих клітин і зростанням кількості клітин, що піддаються апоптозу. У випадку дії ФНП-б активуєтся також і некротична загибель фолікулярних клітин.

Досліджувані цитокіни викликають пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів через порушення функціонального стану мітохондрій (ІЛ-2 блокує кальцієвий уніпортер, ІФН-б виявляє протилежну по відношенню до ІЛ-2 дію, а ФНП-б сприяє відкриттю мітохондріальних пор), що встановлено шляхом фармакологічного впливу на ооцити даних цитокінів у комбінації з рутенієм червоним, амінооксиацетатною кислотою та циклоспорином А.

За умов імунного пошкодження яєчників за допомогою великої дози антиоваріальних антитіл у присутності ФНП-б та ІЛ-2 відбувалося пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів. Під впливом ІФН-б відсоток ооцитів, що досягли стадії метафази І і ІІ суттєво зростав.

Вплив ФНП-б, ІЛ-2, ІФН-б та великої дози гама-глобулінової фракції антиоваріальної цитотоксичної сироватки в дослідах in vitro викликають пригнічення мейотичного дозрівання ооцитів мишей.

За умов дії малої дози антиоваріальних антитіл пригнічуючий вплив ІФН-, ІЛ-2 та ФНП- на розвиток статевих гамет послаблюється, відповідно кількість ооцитів, що відновили мейоз і сформували перше полярне тільце, зростає і наближається до їх значення в контролі.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

Янчій Р.І., Вознесенська Т.Ю., Зюбіна О.А. (Шепель О.А.). Вплив альфа інтерферону на відновлення мейотичного дозрівання ооцитами мишей in vitro // Наук. записки Терноп. нац. пед. ун-ту імені Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2005. - № 1-2 (25). - С. 85-89. (Здобувач самостійно провела всі дослідження та статистичну обробку даних, узяла участь у написанні статті).

Вознесенская Т.Ю., Блашкив Т.В., Зюбина Е.А. (Шепель Е.А.), Янчий Р.И. Влияние ингибиторов митохондриальных переносчиков на мейотическое созревание ооцитов мышей // Вісн. Черкаськ. ун-ту. Серія: Біол. науки. - 2006. - № 91. - С. 16-25. (Здобувач брала участь у проведенні дослідження та написанні статті).

Янчій Р.І., Вознесенська Т.Ю., Шепель О.А., Блашків Т.В., Бідзіля Ю.П. Цитокіни - як чинники впливу на репродуктивну систему // Наук. записки Терноп. нац. пед. ун-ту імені Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2007. - № 1 (31). - С. 89-95. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, аналізі даних та написанні статті).

Янчій Р.І., Вознесенська Т.Ю., Шепель О.А. Цитокіни та їх роль в репродуктивній системі // Фізіол. журн. - 2007. - Т. 53, № 3. - С. 82-90. (Здобувач провела аналіз літературних даних, взяла участь у написанні статті).

Вознесенская Т.Ю., Блашкив Т.В., Шепель Е.А., Янчий Р.И. Влияние ингибитора малат-аспартатных митохондриальных переносчиков на клеточный апоптоз фолликулярного окружения ооцитов при моделировании иммунной патологии яичников у мышей // Зб. наук. праць співробітників КМАПО імені П.Л. Шупика. - К., 2007. - Вип. 16, кн. 2. - С. 583-590. (Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні даних та написанні статті).

Шепель О.А., Янчій Р.І. Реактивуюча дія малої дози антиоваріальних антитіл на мейотичне дозрівання ооцитів мишей за умов пригнічуючого впливу інтерлейкіну-2 та фактору некрозу пухлини-б // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: Зб. наук. статей. Том 2, вип. XIX. - Запоріжжя: Вид-во Запорізьк. держ. мед. ун-ту, 2007. - С. 245-251. (Здобувач самостійно провела дослідження, статистичну обробку даних, взяла участь у написанні статті).

Янчій Р.І., Зюбіна О.А. (Шепель О.А). Пригнічувальна дія альфа інтерферону на відновлення першого поділу мейозу ооцитами мишей in vitro // Матеріали XVII з'їзду Укр. фізіол. то-ва з міжнар. участю (м. Чернівці, 18-20 травня 2006 р.) // Фізіол. журн. - 2006. - Т. 52, № 2. - С. 116-117.

Zjubina O.A. (Shepel O.A), Blashkiv T.V., Voznesenskaya T.Yu., Yanchiy R.I. The influence of the mitochondrial carriers inhibitors on murine oocyte meiotic maturation in the cumulus-oocyte-cellular complexes // Молодь та поступ біології: Матеріали ІІ міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів (м. Львів, 21-24 березня 2006 р.). - Львів, 2006. - С. 451-452.

Шепель Е.А. Влияние ингибиторов митохондриальных переносчиков на мейотическое созревание ооцитов мышей разного возраста // Матеріали VIII наук. конф. молодих учених з міжнар. участю "Біологічні основи розвитку патології пізнього віку" (м. Київ, 29 січня 2007 р.). - К.: Ін-т геронтології АМН України, 2007. - С. 154-155.

Shepel O.A., Voznesenskaya T.Yu., Yanchiy R.I. Meiotic maturation of murine oocytes in conditions of action of interferon-alpha and a small dose of antiovarian antibodies // Матеріали ІІІ міжнар. конф. молодих учених "Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція" (м. Одеса, 15-18 травня 2007 р.). - Одеса, 2007. - С. 136-137.

Шепель О.А., Вознесенська Т.Ю., Янчій Р.І. Вплив інтерлейкіну-2 на мейотичне дозрівання ооцитів мишей // Молодь та поступ біології: Матеріали ІІІ міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів (м. Львів, 23-27 квітня 2007 р.). - Львів, 2007. - С. 493.

Янчій Р.І., Бідзіля Ю.П., Шепель О.А. Модулюючий вплив інтерлейкіну-2 на скоротливу активність гладеньких м'язів матки та оогенез ссавців // VI читання В.В. Підвисоцького: Бюл. матер. наук. конф. (м. Одеса, 31 травня - 1 червня 2007 р.). - Одеса: Одеськ. держ. мед. ун-т, 2007. - С. 130.

Шепель О.А., Сердюк О.М. Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей в умовах експериментального імунного пошкодження яєчників ксеногенними антиоваріальними антитілами // Шевченківська весна: Матеріали VI міжнар. наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих учених (м. Київ, 20-23 березня 2008 р.). - К.: Обрії, 2008. - Т. 2, вип. VI. - С. 114-115.

Шепель О.А. Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей при модуляції функціонального стану мітохондрій // Шевченківська весна: Матеріали VI міжнар. наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих учених (м. Київ, 20-23 березня 2008 р.). - Стрий: Укрпол, 2008. - Т. 3, вип. VI. - С. 10-11.

АНОТАЦІЯ

Шепель О.А. Вплив цитокінів на мейотичне дозрівання ооцитів мишей. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2008 р.

Встановлено, що ФНП-б, ІЛ-2 та ІФН-б in vitro дозозалежно пригнічували мейотичне дозрівання ооцитів, ізольованих від кумулюсних клітин. Вплив цитокінів на ооцити, культивовані в складі кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів, був менш вираженим. Виявлено пошкоджуючу дію ФНП-б, ІЛ-2 та ІФН-б на життєздатність клітин фолікулярного оточення ооцитів. Установлено, що одним із механізмів супресивного впливу цитокінів на дозрівання ооцитів є порушення функціонування мітохондрій, що супроводжується пошкодженням іонотранспортних систем. Показано, що ІЛ-2 та ФНП-б пригнічували мейотичне дозрівання ооцитів в умовах імунного пошкодження яєчників великими дозами антиоваріальних антитіл. Проте в присутності ІФН-б спостерігалось стимулювання ооцитогенезу, що має важливе значення для обґрунтування доцільності використання препаратів ІФН при лікуванні безпліддя у хворих із аутоімунними процесами яєчників. Застосування ін'єкцій малої дози антитіл знижувало пригнічуючий вплив ІФН-б, ІЛ-2 та ФНП-б на мейотичне дозрівання ооцитів. Такі результати дозволяють стверджувати, що антиоваріальні антитіла в малих дозах здійснюють протективний ефект на ооцитогенез при патологічному впливі даних цитокінів.


Подобные документы

  • Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.

    статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017

  • Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.

    презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015

  • Природа та механізм дії інтерферону. Фармакокінетичні характеристики рекомбінантного немодифікованого (стандартного) інтерферону. Огляд найпоширеніших технологій виробництва інтерферону, їх аналіз та порівняння, зіставлення рівнів продуктивності методів.

    курсовая работа [1,9 M], добавлен 19.05.2016

  • Типи клітинної організації. Структурно-функціональна організація еукаріотичної клітини. Вплив антропогенних чинників на довкілля. Будова типових клітин багатоклітинного організму. Ракція клітин на зовнішні впливи. Подразливість та збудливість клітин.

    курсовая работа [4,0 M], добавлен 02.12.2012

  • Мітохонрдрії як органоїди клітини, їх будова та функції. Розміри, форма, загальна схема організації мітохондрій. Локалізація ферментної системи мітохондрій. Методи дослідження мітохондрій: електронна мікроскопія; інтерференційне мікроскопування.

    курсовая работа [398,9 K], добавлен 21.09.2010

  • Фізико-хімічні, біологічні, фармакологічні властивості і застосування металів нанорозмірів. Методи отримання та характеристика наночастинок золота, їх взаємодія з білками, з бактеріальними клітинами; вплив на ферментативну активність пухлинних клітин.

    презентация [362,3 K], добавлен 20.09.2013

  • Механізми дії та функції цитокінів у нервовій системі, їх взаємодії на рівні головного мозку. Рецептори цитокінів в межах центральної нервової системи (ЦНС). Стимуляція гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС.

    реферат [5,7 M], добавлен 13.11.2013

  • Сутність та фізичні основи явища випромінювання. Влив різних видів випромінювання на прокаріотів. Ультразвукові хвилі та їх вплив на різні мікроорганізми. Природа осмотичного тиску, дія гідростатичного тиску, особливості впливу цього фактора на бактерії.

    презентация [403,1 K], добавлен 16.05.2015

  • Вплив попереднього періодичного помірного загального охолодження щурів-самців у віці 3 та 6 місяців на формування та наслідки емоційно-больового стресу при визначенні функціонального стану церебральних механізмів регуляції загальної активності.

    автореферат [58,6 K], добавлен 12.02.2014

  • Мейоз как один из ключевых механизмов наследственности и изменчивости. Биологическое значение мейоза: поддержание постоянства кариотипа в ряду поколений, обеспечение рекомбинации хромосом и генов. Законы Грегора Менделя как основа классической генетики.

    презентация [3,3 M], добавлен 15.04.2014

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.