Механізми реакцій метаболізму та елімінації гідазепаму в організмі щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

14.03.05 - фармакологія

МЕХАНІЗМИ РЕАКЦІЙ МЕТАБОЛІЗМУ ТА ЕЛІМІНАЦІЇ ГІДАЗЕПАМУ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ

ПРЕПОДОБНА КАТЕРИНА ВІКТОРІВНА

ОДЕСА - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України.

Науковий керівник академік АМН України, доктор біологічних наук, професор

ГОЛОВЕНКО Микола Якович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, м. Одеса,

завідувач відділу фізико-хімічної фармакології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

КАРАСЬОВА Тамара Леонідівна,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, м. Одеса,

провідний науковий співробітник відділу медичної хімії

доктор біологічних наук, професор

КРАВЧЕНКО Ірина Анатоліївна,

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, м. Одеса,

професор кафедри фармацевтичної хімії

Захист дисертації відбудеться „17” грудня 2008 р. о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65082, Одеса, Валіховський пров., 2).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65082, Одеса, Валіховський пров., 3).

Автореферат розісланий „17” листопада 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д.мед.н., професор Годован В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Більшість лікарських засобів, що мають пероральне застосування, відносяться до ліпофільних сполук і їх всмоктування здійснюється за рахунок пасивної дифузії та активного транспорту. Такий процес включає трансцелюлярні та парацелюлярні механізми. Після всмоктування ліки зв'язуються з білками плазми крові та за їх допомогою транспортуються до органів та тканин, а у деяких з них, наприклад, жировій - акумулюються [Головенко М.Я., 1998].

Елімінація ліпофільних лікарських засобів можлива тільки за умов перетворення (метаболізму) їх у більш гідрофільні метаболіти. Основним органом, що виконує цю функцію, є печінка, так як ендоепітеліальні клітини її синусоїдів вміщують пори або фенестри, які здійснюють пасаж плазмових протеїнів [Головенко Н.Я., 2004]. Плазмові білки, з'єднані з ліками, пасивно проходять крізь синусоїди у простір Дice. В подальшому препарат надходить у гепатоцит, де метаболізує до водорозчинного метаболіту. Каталізують таке перетворення ізоферменти цитохрому Р-450 (СYР450), що локалізуються в ендоплазматичній сітці гепатоцитів [Sai Y. and other, 2000]. Такі метаболіти можуть знову потрапити в кров, за рахунок синусного току й виводяться з сечею, або скрізь каналікулярну мембрану секретуватись у жовч з наступною екскрецією з калом. В деяких випадках лікарські засоби метаболізуються безпосередньо у шлунково-кишковий тракт (ШКТ), що приводить до так званої пресистемної елімінації.

Зазначені особливості притаманні гідазепаму, що має оригінальний спектр фармакологічної активності, поєднуючи виразну анксиолітичну дію з спроможністю оптимізувати навчання та оперантну діяльність при незначних побічних ефектах та низькій токсичності [Богатский А.В., Андронати С.А., 1980]. Поєднання перерахованих властивостей визначає перевагу гідазепаму порівняно з відомими транквілізаторами, для більшості яких характерна седативна та міорелаксантна дії [Богатский А.В. и соавт. 1982].

Фармакокінетичні параметри препарату були визначенні раніше [Андронати С.А., Воронина Т.А., 1992] в дослідах на різних експериментальних тваринах з використанням гідазепаму, міченого ¹⁴С у положенні «2» гетерокільця. Зважаючи на те, що молекула гідазепаму вміщує дві складові - бенздіазепін-2-он та гідразидний замісник, є всі підстави вважати, що шляхи метаболізму гідазепаму вивчені не в повній мірі. Це перш за все стосується механізмів реакцій окислення ацетилгідразидного фрагменту та гетерокільця в положенні «3» бенздіазепін-2-ону. Можна припустити, що ці процеси відіграють вирішальну роль в елімінації препарату та реалізації фармакодинамічної дії [Головенко Н.Я., Кравченко И.Я., 2007]. Це визначило напрям подальшого вивчення особливостей ферментативного усунення гідразидного замісника (N¹-деалкілування) та С³- гідроксилювання у молекулі гідазепаму в умовах його інтрагастрального введення експериментальним тваринам.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є фрагментами науково-дослідних робіт відділу фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України «Молекулярні механізми дії та конструювання біологічно активних речовин (нейротропних, противірусних, антимікробних)» (№ держреєстрації 0102V001629) та «Прогнозування безпеки та ефективності лікарських засобів в реакціях метаболічної трансформації» (№ держреєстрації 01030007258). Дисертант є співвиконавцем цих тем.

Мета і задачі дослідження. Мета дисертації - зв'язування елімінації гідазепаму в організмі щурів при введенні препарату міченого ¹⁴С у гідразидному радикалі та гетерокільці.

Теоретично обґрунтувати та експериментально довести можливу роль метаболітів гідазепаму в реалізації фармакодинамічної дії препарату.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Синтезувати зразки гідазепаму, що містить ¹⁴С в гідразидному заміснику (для визначення N¹-деалкілювання) та у гетерокільці (для визначення С³-гідроксилювання).

2. Оптимізувати систему методів тонкошарової хроматографії та мас-спектрометрії для встановлення структури (будови) метаболітів.

3. Валідувати аналітичні методи кількісного радіохімічного визначення вихідних сполук та їх метаболітів.

4. Провести інгібіторний аналіз процесів окислення гідразидного фрагменту та гетерокільця молекули гідазепаму, з метою визначення відповідних ізоформ цитохрому Р-450, що каталізують ці реакції.

5. Обґрунтувати кінетичну схему та дати кількісну оцінку елімінації препарату при його інтрагастральному введенні.

6. Провести аналіз фармакометаболічного профілю.

Об'єкт дослідження: елімінація (метаболізм та екскреція) гідазепаму.

Предмет дослідження: основні закономірності N¹-деалкілювання, С³-гідроксилювання гідазепаму та кінетика його екскреції.

Методи дослідження: радіохроматографічні, мас-спектрометрічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що в ній вперше встановлено механізми метаболізму гідазепаму, а саме процеси N¹-деалкілювання та С³-гідроксилювання. Визначено роль ізоформ СYР450 стандартними методами інгібіторного аналізу по фармакокінетичним показникам.

Розроблена система методів, які забезпечують кількісну оцінку процесів метаболізму, розподілу в організмі введеної відповідної дози гідазепаму та елімінації препарату та його метаболітів.

Вперше поєднанням методів радіохроматографічного та мас-спектрометричного аналізів доведена будова метаболітів, що утворюються в організмі експериментальних тварин.

Розраховані константи швидкості елімінації та кінетичні показники для гідазепаму та його метаболітів.

Вивчено протисудомний ефект гідазепаму та його метаболітів за умов осередкової епілепсії при аплікації різних судомних реагентів. Показано, що дезалкілгідазепам та дезалкілгідроксигідазепам мають значно вищу активність ніж гідазепам.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що процеси метаболізму гідазепаму (N¹-деалкілювання та С³-гідроксилювання) каталізуються відповідними ізоформами СYР3А4 та СYР2С19, які локалізуються у шлунково кишковому тракті та печінці. Відомо, що гідазепам призначається у монотерапії, але можуть бути таки випадки, коли його призначають при сумісному застосуванні деяких лікарських засобів, які у свою чергу можуть впливати на метаболізм та ескрецію гідазепаму в організмі пацієнта. Цей факт необхідно враховувати при призначенні інших лікарських засобів (субстратів, інгібіторів або індукторів СYР450) одночасно з гідазепамом, що може викликати небажану дію.

Одержані результати можуть бути впроваджені у навчальний процес вищих медичних навчальних закладів, при розробці нових лікарських засобів та їх застосуванні у клініці.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за темою дисертації, визначена мета та завдання роботи, обґрунтована схема і методичні підходи досліджень, проведені експериментальні досліди. Проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів у вигляді таблиць і графіків, розроблено основні положення і висновки дисертації, опубліковано головні результати роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи представлені на науково - практичних конференціях: Вчені майбутнього - «Синтез гідазепаму, вміщуючего ¹⁴С у гідразидному фрагменті молекули», «Валідація аналітичного методу визначення ¹⁴С-гідазепаму у біологічному матеріалі» (Одеса, 2006), ІІІ Національний з'їзд фармакологів України - «Протисудомна активність гідазепаму за осередкової епілепсії у щурів», «Залежність динаміки протисудомного ефекту ¹⁴С-гідазепаму від його концентрації в крові експериментальних тварин» (Одеса, 2006), Материалы ІІІ Съезда фармакологов России - «Баланс масс гидазепама в фармакокинетических исследованиях» (Санкт-Петербург, 2007), Х конференція молодих вчених Південного регіону - «Фармакокінетична взаємодія гідазепаму з індукторами та інгібіторами цитохрому Р-450 (CYP3A4, CYP2C19)» (Одеса, 2007), Актуальні питання фармакології - «Протисудомна активність гідазепаму та його метаболітів за умов осередкової епілепсії» (Вінниця, 2007), «Протисудомна активність гідазепаму та його метаболітів за умов осередкової епілепсії у щурів при аплікації їм пікротоксіну» (Вінниця, 2008).

Публікації за темою дисертації. Опубліковано загалом 6 робіт у наукових фахових журналах, затверджених ВАК України, та 7 тез доповідей у збірниках наукових робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 125 комп'ютерних сторінках і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота проілюстрована 21 рисунками та 19 таблицями. Бібліографія включає 139 джерел (60 вітчизняних та 79 іноземних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Всі дослідження були виконані з використанням похідного 1,4-бенздіазепіну гідазепаму, та його аналогів, що мали радіоактивний ізотоп у гетерокільці та гідразидному фрагменті з радіохімічною чистотою 91-98 % та питомою активністю 0,003 та 0,07 Ки/моль відповідно. Препарати були синтезовані в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (Одеса).

Досліди були проведені на 180 білих щурах лінії „Wistar” вагою 180-220 г та 90 безпородних мишах масою 18-25 г. Дослідження проводили у відділі Фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України відповідно до вимог Комітету з біоетики Державного фармакологічного центру МОЗ України (Посвідчення протоколу № 20 від 20 вересня 2005 р.).

При вивченні елімінації, метаболізму та екскреції сполук, що досліджувались, гідазепам та його метаболіти вводились інтрагастрально у дозах 5 мг/кг, що відповідало ED₅₀ за анксиолітичною дією препарату у дослідах на щурах [Андронати С.А., Воронина Т.А., 1992]. Після введення радіоактивного матеріалу збирали зразки сечі та калу через певні проміжки часу 12-120 год. При визначенні протисудомної дії сполук перорально вводили гідазепам та його метаболіти у дозі 7 мг/кг. Вибір дози препарату ґрунтувався на підставі попередніх досліджень його фармакодинаміки [Головенко Н.Я., Зиньковский В.Г., 1999] та є оптимальною для кількісного визначення загального радіоактивного матеріалу. Контрольним тваринам вводились відповідні об'єми фізіологічного розчину у твіновій суспензії. У роботі було проведено оптимізацію та валідацію аналітичного методу у кількісному визначенні ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів.

У дослідах визначення протисудомної активності гідазепаму, у коразоловому тесті, тваринам внутрішньоочеревинно вводили гідазепам та його метаболіти у дозах 0,16-1,5 мг/кг за 30 хв до підшкірного введення коразолу в дозі 125 мг/кг, яка викликає 95 % тонічну екстензію у мишей. Реєстрацію тонічної екстензії проводили протягом години [Головенко М.Я., Громов Л.О., 2003]. Визначення протисудомного ефекту гідазепаму та його метаболітів при пароксизмальній активності центральної нервової системи проводились в умовах гострого експерименту (електроенцефалографічні досліди). За 30 хв до створення судомної дії вводились протисудомні засоби, такі як гідазепам та його потенційні метаболіти. Судомні агенти (коразол та пікротоксін), аплікували на кору головного мозку.

Визначення гострої токсичності сполук (LD₅₀) проводилось протягом 24 год, після їх введення. За літературою [Seredenin S. B., Blednov Y. A., 1998] тваринам перорально вводили засоби у дозах 2000 - 500 мг/кг.

Розділення гідрофільних та ліпофільних метаболітів проводили у роздільній лійці у системі хлороформ - вода (1:1). Подальше вивчення метаболітів та шляхів елімінації засобів, що утворились в процесі біотрансформації вихідної сполуки, здійснювалось методом препаративної тонкошарової хроматографії та визначенням вмісту індивідуальних радіоактивних сполук.

У дослідах визначення ізоформ CYP450 тварин було поділено на групи. Першій групі (контроль) перорально вводився мічений гідазепам (5 мг/кг). Тваринам другої групи протягом чотирьох діб вводився індуктор CYP450 - фенобарбітал (80 мг/кг), а на п'яту добу - ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг). Іншій групі тварин вводили протягом чотирьох діб модифікатор CYP450 - омепразол (80 мг/кг), на п'яту добу вводився ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг).

Останній групі тварин вводився інгібітор ферменту CYP450 - кетоконазол (80 мг/кг), та на п'яту добу - ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг). Зразки сечі та калу збирали протягом п'яти діб після введення радіоактивного матеріалу. Весь цей час тварини знаходились у метаболічних комірках.

Вміст ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у зразках, що досліджувались, проводилось методом сцинтиляційної рідинної фотометрії на приладі „Canberra-Packard TRI-CARB 2700 TR” (USA).

Обробку отриманих результатів проводили відповідно до алгоритмів [Соловьев В.Н., Фирсов А.А., 1980]. При порівняльному аналізі результатів досліджень використовувались параметричні критерії Ст'юдента [Гланц С., 1999]. Довірчий інтервал у всіх дослідах розраховувався при рівні значимості Р?0,05, що гарантує вірогідність результатів з імовірністю 0,95.

Усі отримані результати обробляли загальноприйнятими в медико-біологічних дослідженнях методами статистичного аналізу з використанням стандартних пакетів комп'ютерних програм [Лапач С.Н. и сооавт., 2002].

Результати дослідження та їх обговорення. При дослідженні процесів метаболізму гідазепаму в організмі піддослідних тварин було використано гідазепам з вуглецевою міткою (¹⁴С) у гетерокільці молекули та у гідразидному фрагменті (рис. 1).

Рис. 1. Схема метаболізму гідазепаму в організмі піддослідних тварин. Зірочками відмічено положення мітки в молекулах сполук.

Дана схема не враховує можливі метаболіти, що містять гідроксильну групу в ароматичних ядрах (ароматичне гідроксилювання), які відносяться до мінорних компонентів. Наявність в даному випадку міченої сполуки 1 дає можливість прослідити шляхи перетворення в організмі її метаболіту оксиацетилгідразину (4), вияснити механізми N¹-деалкілювання та роль певної ізоформи CYP450 в цьому процесі.

Синтез, оптимізація та валідація методів кількісного визначення ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів.

Сполуки ¹⁴С-1 та ¹⁴С-1а синтезували наступним чином:

Радіохроматограми ¹⁴С-гідазепаму містили один пік та мали високу чистоту зразка (98,2±8,6 %). Питома радіоактивність ¹⁴С-речовини за номером-1 складала 0,07 Ки/моль, а 1а-0,003 Ки/моль.

Основна мета валідації методу - довести надійність конкретного методу для кількісного визначення концентрації аналізованої речовини (речовин) у даному біологічному середовищі. До характеристик біоаналітичного методу, що забезпечують прийнятність властивостей речовин та вірогідність всіх результатів, використовували наступні показники: стабільність, специфічність, чутливість, точність, ступінь екстракції, ефективність рахунку.

Отримані результати свідчать про можливе використання цих методів для подальшого вивчення фармакокінетики препарату.

Рис. 2. Синтез ¹⁴С-гідазепаму

Шляхи та механізми метаболізму гідазепаму в організмі щурів.

Використання радіоізотопних методів дозволило виявити у хлороформних екстрактах екскретів щурів наявність метаболітів, утворених в результаті біотрансформації гідазепаму, які виявляються у вигляді піків радіоактивності з різними показниками R_f при зонній радіохроматографії. При співставленні значень R_f вказаних сполук з аналогічними показниками радіоактивності метаболітів та їх синтетичних аналогів можна зробити попереднє припущення про інтенсивне N¹-деалкілювання гідазепаму з наступним окисленням його гетерокільця.

Для підтвердження припущень про шляхи метаболізму гідазепаму у організмі щурів нами додатково був проведений мас-спектрометричний аналіз його метаболітів.

Молекули 1 мають значну стійкість до електронного удару, що проявляється у високій інтенсивності піку молекулярного іону (86 %) (рис. 3).

Рис. 3. Мас-спектр гідазепаму (1)

У мас-спектрі 1 спостерігається наявність лінійного заступника, пов'язаного з діазепіноновим циклом, який приводить до зміни традиційних для 1,4-бенздіазепін-2-онів напрямків фрагментації.

У цьому випадку послідовний розпад замісника в положенні 1 передує розкриттю діазепінового циклу, що супроводжується елімінуванням молекули окису вуглецю.

У мас-спектрі одного з метаболітів гідазепаму - дезалкілгідазепаму (2), присутні інтенсивні (92 % та 86 %) піки молекулярних іонів з m\z 314 та 316 , що підтверджує присутність одного атому брому у молекулі.

На відміну від 2, його 3-гідроксипохідне (3) проявляє меншу стійкість до електронного удару. Інтенсивність піку молекулярних іонів в цьому випадку складає лише 13%. Головний первинний напрямок призводить до утворення іонів [M-H]⁺ з (m\z 301).

Таким чином сполученням тонкошарової хроматографії та мас-спектрометрії показано, що до головного напрямку метаболізму гідазепаму відноситься N¹-деалкілювання з наступним С³-гідроксилюванням.

Механізм N¹-деалкілювання гідазепаму включає у себе утворення проміжного метаболіту - карбіноламіну (у квадратних дужках), також відщеплення метаболіту 2 відбувається стехіометрично з утворенням 3. Саме завдяки цьому припущенню ми можемо стверджувати про кількість метаболіту 3.

Механізм ферментативного усунення N-алкілзамісників припускає два можливі шляхи. Перший вимагає утворення проміжної сполуки - карбіноламіну. Другий механізм, як попередник карбіноламіну вважає N-окис. Карбіноламіни вважаються нестабільними речовинами й їх ізолювати практично не має змоги. Утворення карбіноламіну можливо при окисленні гідразидного фрагменту у монооксигеназном каталізі, де цитохром Р-450 (CYP450) активує один атом молекулярного кисню й вкорінює його у субстрат, також інший - відновлює до води. Альтернативний механізм, який включає пероксидазні реакції мало можливий, про що й свідчать подальші дослідження з використанням індуктору CYP450 (фенобарбіталу) та його інгібіторів (омепразолу й кетоконазолу).

Наявність у молекулі гідазепаму міченого ізотопу у гідразидному фрагменті молекули та його висока гідрофільність дозволили у подальшому визначити співвідношення водорозчинних та ліпофільних метаболітів (табл. 1). гідазепам метаболіт фармакодинамічний сполука

Таблиця 1. Кінетика виведення ¹⁴С-гідазепаму, що вводився інтрагастрально в дозі 5 мг/кг

Сполуки	Сеча	Кал	Сума, імп/хв	% введеної дози
	Імп/хв	% введеної дози	Імп/хв	% введеної дози
Загальна кількість	101331±124	11,2±1,8	665133±710	73,5±16,9	766514±773	84,7±8,1
Водорозчинні метаболіти	86007±293	7,0±2,1	437993±662	32,9±5,7	524000±713	39,9±6,3
Жиророзчинні метаболіти	11149±105	0,9±0,9	70229±265	5,7±2,4	81378±285	6,6±2,5

Аналіз отриманих результатів, наведених у таблиці, показав, що більша частина радіоактивного матеріалу виводиться біліарним шляхом (73,5 %), а менша (11,2 %) - ренальним. Співвідношення метаболітів склало 6:1 (водорозчинні - жиророзчинні). Виходячи з стехіометрії молекули препарату можна стверджувати, що деалкільних метаболітів в 6 разів більше ніж вихідної сполуки (гідазепаму), що свідчить про високу інтенсивність N¹-деалкілювання препарату.

Визначення ізоформ CYP450, що каталізують метаболізм гідазепаму (інгібіторний аналіз).

В цьому розділі роботи використані різні методичні прийоми (введення індуктору та інгібіторів CYP450), що дозволяють встановити механізм окислення гідразидного фрагменту молекули гідазепаму.

В таблиці 2 наведені контрольні фармакокінетичні показники екскреції гідазепаму з організму білих щурів.

Таблиця 2. Кінетичні параметри процесів елімінації ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у щурів

	Ліпофільні метаболіти	Гідрофільні метаболіти	Сумарне виділення метаболітів
	Сеча	Кал	Сеча	Кал	Сеча	Кал
MRT, год	80,67± 20,05	101,2±43,18	90,2±23,41	124,56± 50,23	96,9±34,12	120,76± 45,54
kel, год-1	0,036± 0,0010	0,045±0,0014	0,051±0,0015	0,056± 0,0015	0,061± 0,0018	0,096± 0,0025
t1/2, год	10,87± 0,056	14,2±0,066	13,21±0,063	19,72±0,112	15,78± 0,143	27,62± 0,228
AUС, імп/хв·год/см3	112371± 675	243123±1297	267563±1178	674782± 2880	324567± 1234	789234± 2585
Cl, см3/год	1,69±0,094	2,09±0,34	2,15±0,12	3,03±0,65	1,89±0,012	3,01±0,020

Введення індуктора СYP3A4 та СYP2С19 фенобарбіталу призводить до значного зменшення (на третину) періоду напівелімінації (t_1/2) загального радіоактивного матеріалу у калі та на 8 % у сечі (табл. 3).

Таблиця 3. Кінетичні параметри процесів екскреції ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у щурів, яким попередньо вводили фенобарбітал (80 мг/кг)

	Ліпофільні метаболіти	Гідрофільні метаболіти	Сумарне виділення метаболітів
	Сеча	Кал	Сеча	Кал	Сеча	Кал
MRT, год	70,45±19,23	99,01±34,56	89,2±22,34	121,67±34,1	86,4±38,44	117,73± 43,51
kel, год-1	0,021± 0,0013	0,035±0,0011	0,045±0,0017	0,051± 0,0018	0,044± 0,0019	0,071±0,002
t1/2, год	3,2±0,051	4,1±0,045	4,04±0,061*	6,57± 0,054**	5,26±0,102	9,2±0,065
AUС, імп/хв·год/см3	151322±620	451627±1651	196121±1120	672375± 3257	241675± 1341	766413± 1188
Cl, см3/год	1,52±0,046	1,78±0,056	1,96±0,058	2,13±0,063	2,25±0,074	3,85±0,026

Примітка: Р - вірогідність відмінності щодо контролю; * - Р < 0,05; ** - Р < 0,001.

Можна припустити, що такі зміни викликані збільшенням вмісту СYP3A4 у кішкивнику щурів та прискоренням процесу окислення гідразидного фрагменту молекули гідазепаму. В той же час, аналіз отриманих показників, особливо k_el та MRT, свідчить про те, що можливим механізмом зміни процесів елімінації внаслідок введення фенобарбіталу є й те, що останній впливає на проникність деяких екскреторних бар'єрних структур.

Модифікатор СYP2С19 омепразол не впливає на фармакокінетичні параметри гідазепаму (табл. 4), що свідчить про відсутність взаємодії цих двох препаратів при їх пероральному застосуванні.

Таблиця 4. Кінетичні параметри процесів елімінації ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у щурів, яким попередньо вводили омепразол (80 мг/кг)

	Ліпофільні метаболіти	Гідрофільні метаболіти	Сумарне виділення метаболітів
	Сеча	Кал	Сеча	Кал	Сеча	Кал
MRT, год	79,60± 19,23	112,10± 45,08	85,60± 22,04	119,21± 0,060	92,55±33,25	117,45±38,78
kel, год-1	0,033±0,001	0,041± 0,0012	0,048± 0,0012	0,051± 0,0011	0,063±0,0020	0,086±0,0021
t1/2, год	9,87±0,045	13,98±0,062	12,19± 0,061	18,80±0,122	15,01±0,140	25,96±0,231
AUС, імп/хв·год/см3	114897±752	235368± 1425	24852± 1789	658284± 2780	314114±1245	72470±2741
Cl, см3/год	1,58±0,052	2,10±0,23	2,18±0,68	2,97±0,54	1,54±0,016	2,82±0,021

Кетоконазол, інгібітор СYP3A4 (табл. 5) зменшує гальмування процесу N¹-деалкілювання гідазепаму, що позначається на періоді напівелімінації (t_1/2) гідрофільних метаболітів у сечі тварин.

Таблиця 5. Кінетичні параметри процесів елімінації ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у щурів, яким попередньо вводили кетоконазол (80 мг/кг)

	Ліпофільні метаболіти	Гідрофільні метаболіти	Сумарне виділення метаболітів
	Сеча	Кал	Сеча	Кал	Сеча	Кал
MRT, год	65,54±18,51	70,12±32,25	71,15± 21,16	95,54± 45,58	72,48±22,67	112,82±35,65
kel, год-1	0,035±0,001	0,041±0,0015	0,035± 0,001	0,049± 0,002	0,034± 0,0010	0,082±0,0030
t1/2, год	9,17±0,054	11,92±0,057	7,05± 0,061*	12,57± 0,093*	10,62±0,108	22,03±0,156
AUС, імп/хв·год/см3	114701±574	212456±1350	274124± 1789	547259± 2210	317507± 1417	722311±1886
Cl, см3/год	1,81±0,071	2,14±0,48	2,18±0,27	3,17±0,27	2,10±0,037	3,15±0,022

Примітка: Р - вірогідність відмінності щодо контролю; * - Р < 0,05; ** - Р < 0,001.

У всіх спостереженнях відмічено, що середній час перебування препарату або його метаболітів в організмі, у незначній мірі залежить від зміни кліренсу на протязі дослідів. В той же час підвищення значення кліренсу зменшує показник періоду напівелімінації (t_1/2).

Отримані результати дозволяють прогнозувати взаємодію гідазепаму з іншими лікарськими засобами -індукторами та інгібіторами СYP3A4 та СYP2С19, які можуть бути використані при їх сумісному прийомі.

Цитохроми сімейства 3А складають біля 30 % всіх відомих цитохромів печінки та 70 % шлунково-кишкового тракту. CYP3A4 локалізований переважно у печінці та шлунково-кишковому тракті. Ця ізоформа окислює біля 60 % всіх відомих лікарських засобів. CYP3A4 відноситься до ферментів, що добре індуцюються, його індукторами можуть бути різноманітні лікарські засоби [Головенко Н.Я., 2004]. Його інгібітори поділяються на сильні (еритроміцин та тетроміцин), помірні (кларітроміцин) та малоактивні (диритроміцин, азитроміцин).

Цитохром 2С19 каталізує процеси окислення різноманітних за будовою та терапевтичною дією лікарських речовин (діазепам, гідазепам, пропаном, омепразол). Індукторами ферменту є барбітурати та рифампіцин, а інгібіторами - омепразол, рітонавир, фелбамат [Головенко Н.Я., 2004].

Фармако-токсикологічна оцінка гідазепаму та його метаболітів. Протисудомна активність гідазепаму оцінювалась за тестом антагонізму з коразолом при його підшкірному введенні експериментальним тваринам в дозі коразолу 125 мг/кг. На моделі антагонізму з коразолом (ED₅₀) метаболіти гідазепаму виявляють більш виражену активність, ніж вихідна сполука. Протилежне спостерігалось у дослідах гострої токсичності сполук (LD₅₀). У гострих дослідах на щурах було виявлено протисудомну активність на моделі осередкової епілепсії, яка викликана аплікацією судомних агентів (пікротоксин та коразол) на кору головного мозку тваринам для вивчення механізмів дії препаратів, що досліджувались.

Отримані результати свідчать про, те що потужність епілептичного осередку, викликаного аплікацією коразолу на кору головного мозку вище, порівняно з потужністю епілептичного осередку, викликаного аплікацією пікротоксину, що є наслідком різного механізму дії судомних агентів. Це свідчить, що терапевтична дія вихідної сполуки може досягатися за рахунок її біотрансформації у організмі. На користь такого висновку свідчить й той факт, що тропність гідазепаму до бенздіазепінових рецепторів, у результаті якого відбувається фармакологічна відповідь, значно менша, ніж у його метаболітів.

Результати проведеної роботи показали, що період з моменту аплікації пікротоксину до появлення епілептиформної активності кори головного мозку склав в середньому 11,05,2 хв; середній час існування осередку (t_сер) - 129,08,6 хв. Параметри осередку на 25 хв (t_max) його існування були наступними: амплітуда - 1,520,39 мВ, потужність - 35,504,6 ум. од.

Інтрагастральне введення гідазепаму у дозі 7 мг/кг за 30 хв до виникнення епілептичного осередку викликаного аплікацією коразолу призвело до зниження часу існування осередку до 50,4±1,2 хв, порівнянно з контролем у 2,3 рази. Під його впливом спостерігалося зниження частоти розрядів. На 25 хв існування осередку частота складала 21,5±4,7 розрядів/хв, амплітуда - 1,180,25 мВ, потужність - 25,43,6 ум. од., а час існування - 123,312,2 хв. Такий низький ефект може бути обумовлений відсутністю або незначною кількістю препарату у «біофазі дії» під час розвитку епілептичного нападу, що підтверджується даними літератури про то що максимальна концентрація у сироватці крові спостерігається тільки через 1-4 год після перорального введення.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне обґрунтування та експериментальне вивчення механізмів реакцій метаболізму та елімінації гідазепаму в організмі щурів. Теоретично обґрунтовано та експериментально доведено вирішальну роль метаболітів гідазепаму в реалізації ними фармакодинамічної дії препарату. Досліджено процес N¹-деалкілювання гідазепаму при введенні в організм індукторів та інгібіторів ферментної системи, що каталізує процес окислення молекули гідазепаму.

1. Синтезовано гідазепам та його мічені радіоактивним ізотопом аналоги, що у гідразидному та у гетерокільці містять ¹⁴С. Питома радіоактивність одержаних зразків дорівнювала для гідазепаму 0,07 Ки/моль, для диметилгідазепаму - 0,003 Ки/моль. Сполуки мають високу чистоту, що дає змогу використовувати їх у фармакокінетичних дослідженнях.

2. Оптимізована система методів тонкошарової хроматографії та мас-спектрометрії при встановленні структури метаболітів та визначені шляхи метаболізму гідазепаму. Методами радіохроматографії розділені ліпофільні метаболіти гідазепаму, та при мас-спектрометрії встановлена їх будова (N¹-деалкільне похідне та його 3-гідроксильний метаболіт). Гідрофільні метаболіти представлені в екскретах щурів ацетилгідазепамом.

3. Валідовано аналітичні методи кількісного радіохімічного визначення вихідних сполук та їх метаболітів. Визначено стабільність речовини у біоматеріалі, чистота препарату її специфічність та точність методів.

4. Проведено інгібіторний аналіз процесів окислення гідразидного фрагменту та гетерокільця молекули гідазепаму, й визначено відповідні ізоформи цитохрому Р-450, які каталізують ці реакції. Встановлено основний шлях елімінації гідазепаму - екскреція з калом 73 %, а з сечею 11 %. Введення індуктору фенобарбіталу призвело до зменшення періоду напівелімінації (t_1/2) у екскретах, що пов'язане із збільшенням концентрації CYP450 в організмі. Сумісне застосування інгібітору CYP450 кетоконазолу з гідазепамом, виявило зменшення показників у зразках.

5. Обґрунтована кінетична схема та визначена кількісна оцінка елімінації препарату. За результатами експериментів встановлено, що фармакокінетичні параметри гідазепаму (t_1/2, Cl, AUС, k_el та MRT) змінюються в залежності від типу індуктору (фенобарбітал) чи інгібітору (кетоконазол) CYP450, що вводилися безпосередньо до прийому гідазепаму.

6. Проведено аналіз фармакометаболічного профілю гідазепаму та його метаболітів, визначено протисудомну активність по коразоловому тесту (ED₅₀ 0,36 мг/кг) та протиепілептичну активність засобів при аплікації судомних реагентів на кору головного мозку й розрахована гостра токсичність (LD₅₀ 1700 мг/кг) для препаратів, що досліджувались.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇЇ

1. Преподобна К.В. Біофармацевтичні підходи до раціонального використання препаратів бенздіазепінового ряду / М.Я. Головенко, І.Ю. Борисюк, К.В. Преподобна. // Одеський медичний журнал. - 2006. - № 6 (98). - С. 4-7. Внесок дисертанта - участь в експерименті, підготовка матеріалу до друку.

2. Преподобна К.В. Синтез ¹⁴С-гідазепаму та його потенційних метаболітів / М.Я. Головенко, В.І. Павловський, К.В. Преподобна, В.Б. Ларіонов, К.О. Семенішина. // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2007. - № 1. - С. 20-23. Внесок дисертанта - проведення есксперимету, написання та оформлення статті.

3. Преподобна К.В. Метаболізм гідазепаму в організмі щурів / М.Я. Головенко, К.В. Преподобна, О.В. Мазепа, Н.В. Шнейдер. // Клінічна фармація. - 2007. - Т. 11, № 3. - С. 6-10. Внесок дисертанта - постановка завдань дослідження, проведення експерименту, підготовка матеріалу до друку.

4. Преподобная Е.В. Фармако-токсикологическая характеристика гидазепама и его метаболитов / Головенко Н.Я., Преподобная Е.В. // Современные проблемы токсикологии.- 2007. - № 4. - С. 39-41. Внесок дисертанта - розробка методології експерименту проведення дослідженнь, аналізу та узагальнення даних, написання статті.

5. Преподобна К.В. Кінетика елімінації гідазепаму в умовах взаємодії з індукторами та інгібіторами цитохрому Р-450 (CYP3A4, CYP2C19) / Преподобна К.В. // Досягнення біології та медицини. - 2008. - № 1 (11). - С. 16-19.

6. Преподобна К.В. Протисудомна активність гідазепаму та його метаболітів за умов осередкової епілепсії. / Преподобна К.В. // Вісник Вінницького національного медичного університету. -- 2007. -- № 11 (2/1). -- С. 524-526 (Актуальні проблеми фармакології : наук.-практ. конф. з міжнар. участю, присвячена 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова. Вінниця, 28-29 верес. 2007 р. : праці.).

7. Преподобна К.В. Фармакокінетична взаємодія гідазепаму з індукторами та інгібіторами. / Преподобна К.В. // X конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України, 11-13 вересня 2007 р. : тези доп. - Одеса, 2007. - С. 47.

8. Преподобная Е.В. Баланс масс гидазепама в фармакокинетических исследованиях. / Головенко Н.Я., Преподобная Е.В. // Психофармакология и биол. наркология. -- 2007. -- Т. 7, спец. вып. (сентябрь). Ч. 2 (Л-Я). -- С. 2-1660. (Фармакология -- практическому здравоохранению: III съезд фармакологов России. Санкт-Петербург, 23-27 сент. 2007 г.). Внесок дисертанта -- проведення експериментів, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

9. Преподобна К.В. Валідація аналітичного методу визначення ¹⁴С-гідазепаму у біологічному матеріалі. / Преподобна К.В., Шнейдер Н.В. // IX конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України, 16-17 жовтня 2006 р. : тези доп. - Одеса, 2006. - С. 60. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, статобробки, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

10. Преподобна К.В. Синтез гідазепаму, вміщуючего ¹⁴С у гідразидному фрагменті молекули. / Семенішина К.О., Преподобна К.В. // IX конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України, 16-17 жовтня 2006 р. : тези доп. - Одеса, 2006. - С. 61. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

11. Преподобна К.В. Залежність динаміки протисудомного ефекту ¹⁴С-гідазепаму від його концентрації в крові експериментальних тварин / Майкова Г.В., Преподобна Е.В. // Фармакологія-2006 -- крок в майбутнє : III Нац. з'їзд фармакологів України, 17-20 жовт. 2006 р. : тези доп. -- Одеса, 2006. -- С. 104. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, статобробки, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

12. Преподобна К.В. Протисудомна активність гідазепаму за осередкової епілепсії у щурів. / Преподобна Е.В., Майкова Г.В. // Фармакологія-2006 -- крок в майбутнє : III Нац. з'їзд фармакологів України, 17-20 жовт. 2006 р. : тези доп. -- Одеса, 2006. -- С. 140. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

13. Преподобна К.В. Протисудомна активність гідазепаму та його метаболітів за умов осередкової епілепсії. / Преподобна К.В. // Вісник Вінницького національного медичного університету. -- 2007. -- № 12 (1). -- С. 219 (Актуальні проблеми фармакології : наук.-практ. конф. з міжнар. участю, присвячена 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Вінниця, 15-18 березня. 2008 р. : праці.). Внесок дисертанта -- проведення досліджень, статистичної обробки, аналізу результатів, написання та оформлення тез.

АНОТАЦІЯ

Преподобна К.В. Механізми реакцій метаболізму та елімінації гідазепаму в організмі щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса 2008.

Дисертація присвячена вивченню екскреції та метаболізму, гідазепаму з організму тварин, дослідженню процесів N¹-деалкілювання та С³-гідроксилювання його молекули.

Сполученням методів тонкошарової хроматографії та мас-спектрометрії встановлено будову гідазепаму та його метаболітів. У дослідах in vitro спостерігається інтенсивний метаболізм гідазепаму з утворенням його головних метаболітів - дезалкілгідазепаму, дезалгідроксигідазепаму та ацетилгідразину. За своїми фізико-хімічними властивостями ці речовини можна розділити на гідрофільні (ацетилгідразин) та ліпофільні (гідазепам, дезалкілгідазепам та дезалкілгідроксигідазепам). Співвідношення гідрофільних та ліпофільних метаболітів у екскретах тварин склало 6:1 відповідно.

Визначенно ізоформи CYP450 стандартними методами інгібіторного аналізу, що каталізують процеси N¹-деалкілювання та С³-гідроксилювання по фармакокінетичним показникам. У всіх дослідженнях відмічено, що початкова концентрація препарату або його метаболітів у незначній мірі залежить від змін кліренсу. В той же час зміни кліренсу зменшують показник періоду напівелімінації засобу. Отриманні результати дають змогу прогнозувати дію гідазепаму з різними лікарськими засобами - інгібіторами, індукторами та субстратами CYP450.

Ключові слова: гідазепам, метаболізм, CYP450, екскреція.

АННОТАЦИЯ

Преподобная Е.В. Механизмы реакций метаболизма и элиминации гидазепама в организме крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05-фармакология. Одесский государственный медицинский университете МЗ Украины. - Одесса 2008.

Диссертация посвящена изучению экскреции и метаболизма гидазепама из организма животных, исследование процессов N¹-деаклкилирования и С³-гидроксилирования его молекулы.

Цель работы заключалась в проведении исследования элиминации (метаболизм и экскреция) гидазепама в организме крыс при введении им препарата меченого ¹⁴С в гидразидном радикале и в гетерокольце, также в доказательстве осуществления фармакодинамического профиля препарата за счет его метаболитов.

Для определения N¹-деалкилирования исследования были проведены с использованием гидазепама и его аналогов, которые содержали радиоактивный изотоп в гетерокольце и гидразидном фрагменте. Их радиохимическая чистота составила 98 %, а удельная радиоактивность - 0,003 и 0,07 Ки/моль соответственно. Использование радиоизотопных методов позволило определить в хлороформных экстрактах экскретов крыс присутствие 4-х метаболитов, образующиеся при метаболизме гидазепама, метаболиты можно разделить на две группы первая группа составляет гидрофильные метаболиты - ацетилгидразин. Вторая группа состоит из липофильных метаболитов - гидазепам, дезалкилгидазепам и дезалгидроксигидазепам. Для подтверждения наших предположений про пути метаболизма гидазепама в организме крыс нами дополнительно был проведен масс-спектральный анализ исходного вещества и его метаболитов. Соотношение первой группы ко второй составила 6:1. Исходя из стехиометрии молекулы препарата можно утверждать, что деалкильных метаболитов в 6 раз больше, чем исходного вещества, что свидетельствует про высокую интенсивность N¹-деалкилирования препарата.

Для определения изоформ цитохрома Р-450, которые катализируют процессы N¹-деалкилирования и С³-гидроксилирования, в работе использовались стандартные методы ингибиторного анализа. В работе определены фармакокинетические показатели радиоактивного материала в экскретах животных при условии введения индуктора и ингибиторов CYP450. Так, введение индуктора СYP3A4 и СYP2С19 фенобарбитала приводило к уменьшению периода полуэлиминации общего радиоактивного материала в кале на треть и в моче на 8%, по сравнению с контрольными данными. Модификатор CYP2C19 омепразол не влияет на фармакокинетические параметры гидазепама, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия этих двух препаратов при их совместном пероральном приеме. Кетоконазол, ингибитор CYP3A4, уменьшает торможение процесса N¹-деалкилирования гидазепама, это отражается на показателях периода полуэлиминации препарата гидрофильных метаболитов в моче животных.

Для определения вклада каждого метаболита гидазепама в его фармакологическую активность и токсикологические свойства было проведено соответствующее исследование этих показателей. Противосудорожная активность гидазепама оценивалась по тесту антагонизма с коразолом. На модели антагонизма с коразолом метаболиты гидазепама оказывали более выраженную активность, чем исходный препарат. Противоположное наблюдалось в исследованиях острой токсичности веществ.

Ключевые слова: гидазепам, метаболизм, CYP450, экскреция.

SUMMURY

Prepodobnya K.V. Mechanisms of elimination and metabolism of gidazepam in rat organisms. - A manuscript.

Thesis for the degree of candidate of biological sciences by specialty 14.03.05-pharmacology. - Odessa State Medical University of Ministry of Health of Ukraine. - Odessa 2008.

The work is dedicated to studying of elimination and metabolism of gidazepam and its metabolites from the organism's of experimental animals.

Using the combination of thin-layer chromatography and mass-spectrometry was established the structure of gidazepam and its metabolites. Under in vivo experiments the intensive metabolism of gydazepam, forming the main metabolites - dealkilgydazepam, dealkilhydroxygydazepam and acetylhyrozine were detected. The hydrolytic/lipophylic metabolites were 6:1.

By the help of standard methods of inhibition analysis the different CYP450 izoforms, participating N¹-dealcylation and C³-hydroxylation were excluded from gydazepams' metabolism. This can be used for cross influence after concomitant CYP450 inhibitors or inductors administration.

Key words: gidazepam, metabolism, CYP450, elimination.

Размещено на Allbest.ru